CN110787148B - 一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子及其制备方法，所述明胶纳米粒子由明胶经核酸适配体修饰表面修饰而成。本发明所提供的核酸适配体修饰的明胶纳米粒子单分散性好、稳定性和重现性均十分优良；制备方法简单易行，明胶纳米粒子具有抗蛋白质吸附性能，其表面富集丰富的羧基可以与核酸适配体偶联，既能够抗蛋白吸附，又能为核酸适配体所修饰，具有靶向性，在靶向载药治疗癌症领域具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子及其制备方法。
背景技术
纳米药物载体是指在纳米尺寸，用来负载药物的载体，通常的药物载体可以分为无机和有机两大类。无机类的纳米药物载体多以纳米金粒子和纳米二氧化硅为核，通过化学方法在表面修饰一些药物结合位点和靶向识别位点，以达到运载药物的目的，此类纳米药物载体由于其内核不可降解，注射到人体中不易排出，具有比较大的纳米毒性。有机类的纳米药物载体通常是以自组装，乳液聚合等方法合成的，相比与无机类纳米药物载体可以在人体内被降解，生物毒性要小，但其稳定性要低于无机类纳米药物载体。处于纳米尺寸的载体能够更好的进入到细胞中。
蛋白吸附是指当纳米药物载体进入到人体血清环境中，由于纳米粒子表面所带电荷和表面能的影响，而被血清中的生物大分子所包覆，丧失其靶向识别能力，并且很快会被血清中吞噬细胞排出体外。蛋白吸附能够降低药物的释放效率，从而影响药物的靶向效率。
抗蛋白吸附是指当纳米药物载体进入到人体血清环境中，不被生物大分子所吸附，仍然具有很好的靶向识别能力的特征。第一代抗蛋白吸附的纳米载体多以聚乙二醇为代表，在纳米金颗粒或者纳米二氧化硅表面修饰一层聚乙二醇的长链，由于聚乙二醇长链具有很高的亲水性，能够在纳米粒子表面形成一层水合层，能够有效的阻止生物大分子的吸附，但此类纳米药物载体的稳定性较差，在一些高盐环境中容易发生聚集沉淀。第二代的抗蛋白吸附纳米药物载体是在纳米粒子表面修饰一层带正负离子对的结构，此类结构多以羧基甜菜碱和磺基甜菜碱为代表，使纳米粒子呈现电中性，表面的离子化官能团也能形成一层水合层，这种电中性的纳米药物载体具有较好的抗蛋白吸附能力，相比于第一代抗蛋白吸附纳米药物载体具有较好的稳定性，但其要求表面完全电中性，限制了其靶向官能团的引入，从而限制了靶向识别的能力以及药物负载的能力。
发明内容
为了克服上述技术缺陷的不足，本发明一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子及其制备方法。
为了达到上述目的，一方面，提供一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法，关键在于包括以下步骤：
步骤一、制备明胶纳米粒子：将明胶、木瓜蛋白酶和水投入反应釜中，进行水解得到水解明胶，调节体系的pH值至5-6后，将复配引发剂、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸投入反应釜中，升温进行聚合反应，制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体溶液中进行偶联，纯化后，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子。
优选的，步骤一中所述复配引发剂为质量比为300：1的质量分数为20％wt双氧水和七水合硫酸亚铁。
优选的，步骤一具体为：将超纯水和明胶投入反应釜中，在体系温度60-65℃下保温30-40min，然后向反应釜中投入木瓜蛋白酶进行水解，保温水解60-70min，再调节水解体系pH值至5-6，加入七水合硫酸亚铁，并同时将体系升温至85-90℃，将质量分数为20％wt的双氧水、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸滴加至反应体系中，进行聚合反应，得到明胶纳米粒子。
优选的，所述步骤一中明胶、超纯水和木瓜蛋白酶的质量比为(457-462)：(1524-1542)：1。
优选的，所述步骤一中所述质量分数为20％wt的双氧水、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸的质量比为10：(150-188)：1。
优选的，所述步骤二中：所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为(4.4-4.7)：1：(5.7-6.4)，活化时间为30-60分钟。
优选的，所述步骤三中所述核酸适配体溶液为核酸适配体AS1411溶液，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073。
另一方面，提供一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子，关键在于所述明胶纳米粒子采用上述任一项具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法制备得到。
本发明的有益效果是：本发明所提供的核酸适配体修饰的明胶纳米粒子单分散性好、稳定性和重现性均十分优良；制备方法简单易行；制备得到的明胶纳米粒子，既能够抗蛋白吸附，又能为核酸适配体所修饰，具有靶向性，在靶向载药治疗癌症领域具有广阔的前景。
附图说明
图1为核酸适配体修饰的明胶纳米粒子加入胎牛血清(FBS)前后的粒径图；
图2为核酸适配体修饰的明胶纳米粒子加入胎牛血清(FBS)后的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图；
图3为核酸适配体修饰的明胶纳米粒子的DNA尿素变性凝胶电泳显影图。
具体实施方法
实施例1一种具有抗蛋白吸附和靶向能力的明胶纳米粒子I的制备
步骤一、制备明胶纳米粒子：将15克明胶和50克超纯水投入反应釜中，以180转/分钟的速度搅拌并升温至60℃，保温30分钟，然后加入0.0325克木瓜蛋白酶水解60分钟后，得到水解明胶，加入醋酸调节体系的pH值至5，2分钟后加入0.02克七水合硫酸亚铁，升温至85℃后，用恒流泵滴加质量分数为20％wt过氧化氢溶液6克，滴速为0.05毫升/分钟并同时用恒压滴液漏斗滴加甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸混合物10.6克，滴速为0.13毫升/分钟，保温2.5小时，冷却出料，即可制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，活化时间为30分钟，所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为4.4：1：5.7，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体AS1411溶液中进行偶联12小时，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073，再在10000转转速下离心30分钟后，纯化4次，除去游离的核酸适配体，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子I。
实施例2一种具有抗蛋白吸附和靶向能力的明胶纳米粒子II的制备
步骤一、制备明胶纳米粒子：将16.5克明胶和55克超纯水投入反应釜中，以190转/分钟的速度搅拌并升温至60℃，保温30分钟，然后加入0.0358克木瓜蛋白酶水解60分钟后，得到水解明胶，加入醋酸调节体系的pH值至5.2，2分钟后加入0.021克七水合硫酸亚铁，升温至85℃后，用恒流泵滴加质量分数为20％过氧化氢溶液6.3克，滴速为0.05毫升/分钟并同时用恒压滴液漏斗滴加甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸混合物10.6克，滴速为0.14毫升/分钟，保温2.6小时，冷却出料，即可制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，活化时间为30分钟，所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为4.7：1：5.8，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体AS1411溶液中进行偶联12小时，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073，再在11000转转速下离心30分钟后，纯化4次，除去游离的核酸适配体，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子II。
实施例3一种具有抗蛋白吸附和靶向能力的明胶纳米粒子III的制备
步骤一、制备明胶纳米粒子：将17.25克明胶和57.5克超纯水投入反应釜中，以200转/分钟的速度搅拌并升温至65℃，保温40分钟，然后加入0.0373克木瓜蛋白酶水解60分钟后，得到水解明胶，加入醋酸调节体系的pH值至5.5，2分钟后加入0.022克七水合硫酸亚铁，升温至85℃后，用恒流泵滴加质量分数为20％过氧化氢溶液6.6克，滴速为0.06毫升/分钟并同时用恒压滴液漏斗滴加甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸混合物10.6克，滴速为0.15毫升/分钟，保温2.5小时，冷却出料，即可制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，活化时间为40分钟，所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为4.7：1：5.9，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体AS1411溶液中进行偶联12小时，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073，再在11000转转速下离心30分钟后，纯化5次，除去游离的核酸适配体，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子III。
实施例4一种具有抗蛋白吸附和靶向能力的明胶纳米粒子IV的制备
步骤一、制备明胶纳米粒子：将18克明胶和60克超纯水投入反应釜中，以220转/分钟的速度搅拌并升温至65℃，保温30分钟，然后加入0.039克木瓜蛋白酶水解70分钟后，得到水解明胶，加入醋酸调节体系的pH值至5，2分钟后加入0.023克七水合硫酸亚铁，升温至85℃后，用恒流泵滴加质量分数为20％过氧化氢溶液6.9克，滴速为0.07毫升/分钟并同时用恒压滴液漏斗滴加甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸混合物10.6克，滴速为0.16毫升/分钟，保温3小时，冷却出料，即可制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，活化时间为50分钟，所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为4.7：1：6，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体AS1411溶液中进行偶联12小时，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073，再在12000转转速下离心30分钟后，纯化5次，除去游离的核酸适配体，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子IV。
实施例5一种具有抗蛋白吸附和靶向能力的明胶纳米粒子V的制备
步骤一、制备明胶纳米粒子：将18.75克明胶和62.5克超纯水投入反应釜中，以230转/分钟的速度搅拌并升温至65℃，保温40分钟，然后加入0.041克木瓜蛋白酶水解70分钟后，得到水解明胶，加入醋酸调节体系的pH值至6，2分钟后加入0.03克七水合硫酸亚铁，升温至90℃后，用恒流泵滴加质量分数为20％过氧化氢溶液9克，滴速为0.07毫升/分钟并同时用恒压滴液漏斗滴加甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸混合物10.6克，滴速为0.18毫升/分钟，保温3小时，冷却出料，即可制得明胶纳米粒子；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)进行活化，活化时间为60分钟，所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸(NHS-Sulfo)的质量比为4.7：1：6，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体AS1411溶液中进行偶联12小时，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073，再在12000转转速下离心30分钟后，纯化5次，除去游离的核酸适配体，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子V。
对本发明制备的明胶纳米粒子进行如下测试，以明胶纳米粒子I为例：
将表面修饰的明胶纳米粒子I与胎牛血清(FBS)置于37℃的摇床中以180转的速度进行孵育1小时，再离心纯化洗掉游离的血清。
(1)通过动态光散射(DLS)粒径测量和聚丙烯酰胺凝胶电泳确定纳米粒子抗蛋白吸附能力，凝胶电泳条件：10％聚丙烯酰胺胶，电泳电压120V，时间70分钟，显色为银染。
测试结果表明：图1可得，纳米粒子吸附血清后，粒径没有改变，证明其有优异的抗蛋白吸附性能；
图2中1：蛋白marker，2:胎牛血清，3：FBS孵育后纳米粒子，4：离心后的上清液，可以看到纳米粒子与FBS共同孵育并离心清晰后，无明显的蛋白吸附条带，证明其优异的抗蛋白吸附性能。
(2)DNA尿素变性凝胶电泳显影测试：DNA尿素变性凝胶电泳后，取出凝胶，加入100mL超纯水，并加入3μL Gel Red染料混匀，在超纯水中清洗2min，置于凝胶成像仪中选择核酸凝胶进行显影拍照。
测试结果表明：图3中1：DNAMaker，2：核酸适配体有明显的显影，3：未离心洗涤的纳米粒子，4：已离心洗涤的纳米粒子，5：离心后的上清液。可以看到只在胶图最上方有显影，说明没有游离的核酸适配体存在，而纳米粒子跑不进胶图中，所以纳米粒子与核酸适配体的偶联物只能留在最上方，说明纳米粒子可与核酸适配体偶联。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、制备明胶纳米粒子：将明胶、木瓜蛋白酶和水投入反应釜中，进行水解得到水解明胶，调节体系的pH值至5-6后，将复配引发剂、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸投入反应釜中，升温进行聚合反应，制得明胶纳米粒子；所述复配引发剂为质量比为300：1的质量分数为20%双氧水和七水合硫酸亚铁；所述质量分数为20% wt的双氧水、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸的质量比为10：（150-188）：1；
步骤二、活化明胶纳米粒子：将步骤一制得的明胶纳米粒子去除杂质后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸（NHS-Sulfo）进行活化，得到活化的明胶纳米粒子；
步骤三、表面修饰明胶纳米粒子：将步骤二制得活化的明胶纳米粒子加入核酸适配体溶液中进行偶联，纯化后，得到核酸适配体修饰的明胶纳米粒子；所述核酸适配体溶液为核酸适配体AS1411溶液，所述核酸适配体AS1411和所述活化的明胶纳米粒子的质量比为1：3073。
2.根据权利要求1所述的具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤一具体为：将超纯水和明胶投入反应釜中，在体系温度60-65℃下保温30-40min，然后向反应釜中投入木瓜蛋白酶进行水解，保温水解60-70min，再调节水解体系pH值至5-6，加入七水合硫酸亚铁，并同时将体系升温至85-90℃，将质量分数为20%wt的双氧水、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸滴加至反应体系中，进行聚合反应，得到明胶纳米粒子。
3.根据权利要求1或2所述的具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法，其特征在于所述步骤一中明胶、超纯水和木瓜蛋白酶的质量比为（457-462）：（1524-1542）：1。
4.根据权利要求1或2所述的具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法，其特征在于所述步骤二中：所述明胶纳米粒子、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺-磺酸（NHS-Sulfo）的质量比为（4.4-4.7）：1：（5.7-6.4），活化时间为30-60分钟。
5.一种具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子，其特征在于：所述明胶纳米粒子采用权利要求1-4任一项所述的具有抗蛋白质吸附和适体修饰的明胶纳米粒子的制备方法制备得到。
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