CN113681020B - 具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料及其制备方法，以氯金酸和柠檬酸三钠为原料，通过一锅法制备金纳米粒子，将金纳米粒子和酪蛋白溶液混合孵育制备酪蛋白包覆的纳米金，以酪蛋白包覆的纳米金为模板，在酪蛋白上原位反应生成金纳米团簇。本发明所提供的具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料的制备以及操作方法简单，原料方便易得，且环境友好，制备的复合材料属于同时包含金纳米粒子和金纳米团簇的核壳纳米材料，具有优异的抗蛋白吸附性能和较好的光动力抗癌效果，对于癌症治疗具有十分重大的意义。

Description

具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料及制备方法
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，具体涉及具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料及其制备方法。
背景技术
金纳米簇是指具有精确的原子个数(20～200)和配体数目的金纳米粒子，其作为一种纳米材料在纳米医学中被认为具有治疗疾病的作用，比如肿瘤、遗传等方面的疾病。目前金纳米簇作为纳米医药用于肿瘤治疗和抗菌等方面已经越来越广泛，所以金纳米簇的研究对于抗肿瘤的治疗的应用具有重要的意义，本文是通过模板法合成了金纳米粒子和金纳米团簇的结合物，通过选择能够保护和稳定金属纳米簇的合适材料作为模板，在制备金纳米簇的过程中，金离子逐渐地被还原成为金原子，然后其不断被累积和包裹在由模板分子构成的空腔结构中，然后形成金属纳米簇。模板材料的选择是模板法的重要步骤，模板材料常常需要具有可以与金属离子产生相互作用的多种官能团，因此，硫醇分子、高分子聚合物、蛋白质等都能够作为金属纳米簇制备过程中的模板。
纳米技术在纳米药物靶向治疗领域蓬勃发展，各种研究表明，在纳米粒子上负载各种治疗和诊断剂，可以对癌症细胞进行特异性识别，也可以调节纳米粒子的电荷和靶向识别基团使其更容易高效的进入癌症细胞，有着非常广阔的前景。但当纳米材料进入生物环境之后，其表面会吸附的一层或多层蛋白所组成的结构，形成蛋白质冠，这类现象不仅会使纳米药物载体丧失其靶向识别能力，还会引起补体激发，易被当成外来抗原排出体外，降低了药物的治疗效率。
抗蛋白吸附性能是指当纳米材料进入到人体血清环境中时，不会被生物大分子吸附的能力。具有良好抗污能力的材料聚乙二醇(PEG)纳米粒子和两性聚合物纳米粒子已经被广泛应用多年，但它们仍然存在许多问题，如聚乙二醇纳米粒子易被氧化丧失抗蛋白吸附能力，两性聚合物纳米粒子则在功能化过程中具有很大局限等。
发明内容
为了克服上述技术缺陷的不足，本发明提供了具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料及其制备方法。
为了达到上述目的，一方面，本发明提供具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料的制备方法，关键在于包括以下步骤：
步骤一、以氯金酸和柠檬酸三钠为原料，通过一锅法制备尺寸均匀、呈球形单分散分布的金纳米粒子；
步骤二、将金纳米粒子和酪蛋白溶液混合孵育过夜，制备酪蛋白包覆的金纳米粒子，纳米粒子的粒径在16-20nm；
步骤三、调节体系pH到10-12，在酪蛋白包覆的金纳粒子模板上原位反应生成金纳米团簇。
优选的，所述步骤一具体为：将83ul质量浓度为0.294M的氯金酸水溶液加热至沸腾，然后搅拌加入质量浓度为0.17M的柠檬酸三钠水溶液，直到溶液呈现亮红色。
优选的，所述步骤二中金纳米粒子与酪蛋白溶液混合孵育前，进行纯化。
优选的，所述步骤二具体为：将金纳米粒子分散至PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液混合，保持酪蛋白浓度为0.1-0.5mg/ml，在25℃下孵育过夜，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子。
优选的，所述步骤三具体为：将包含金纳米模板溶液离心纯化后，重新分散在PBS缓冲溶液中，调节反应体系的pH为10-12，搅拌加入20ul质量浓度为 0.294M氯金酸溶液，在40-50℃反应5-7h，制备得到以酪蛋白包覆的金纳米粒子为模板的金纳米簇。
优选的，所述步骤三中采用质量浓度为1M氢氧化钠溶液调节反应体系的 pH值。
另一方面，提供具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料，关键在于：采用以上具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料的制备方法制得。
本发明的有益效果是：本发明所提供的具有抗蛋白吸附性能和光动力效应的复合材料的制备以及操作方法简单，原料方便易得，且环境友好，制备的复合材料属于同时包含金纳米粒子和金纳米团簇的核壳纳米材料，具有优异的抗蛋白吸附性能和较好的光动力抗癌效果，对于癌症治疗具有十分重大的意义。
附图说明
图1为金纳米粒子包覆酪蛋白(casein)前后的紫外光谱图；
图2酪蛋白(casein)包覆金纳米粒子的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3为复合材料加入胎牛血清(FBS)前后的粒径对比图；
图4为复合材料的光动力效果实验图。
具体实施方法：
实施例1
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应10min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.1mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到10，搅拌下加入20ul 0.294M氯金酸溶液，在40℃反应6h，制得复合材料。
实施例2
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应15min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.3mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到10，搅拌下加入30ul 0.294M氯金酸溶液，在50℃反应6h，制得复合材料。
实施例3
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应15min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.3mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到11，搅拌下加入20ul 0.294M氯金酸溶液，在45℃反应5h，制得复合材料。
实施例4
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应15min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.5mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到12，搅拌下加入20ul 0.294M氯金酸溶液，在45℃反应6h，制得复合材料。
实施例5
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应15min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.5mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到12，搅拌下加入40ul 0.294M氯金酸溶液，在45℃反应5.5h，制得复合材料。
实施例6
取83ul 0.294M的氯金酸溶液加入到50g超纯水中，搅拌并升温至100℃，煮沸后迅速加入1ml 0.17M柠檬酸三钠溶液，反应15min，当溶液颜色由黑灰色变为亮红色时停止反应，表明生成金纳米粒子；将反应液离心分离后，收集上层金溶液，取5ml上层金溶液在PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液在25℃下过夜孵育，整个溶液的体系体积为18ml，保持酪蛋白浓度为0.5mg/ml，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子，重复进行5组实验；将5组实验将制备得到的酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液混合并高速离心纯化30min后，重新分散在20ml PBS缓冲溶液中，向其加入1M氢氧化钠溶液，调节反应体系的pH值到11，搅拌下加入60ul 0.294M氯金酸溶液，在45℃反应7h，制得复合材料。
将本发明制备的实施例3为例，进行如下性能测试：
(1)通过紫外光谱测试和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验确定金纳米粒子与酪蛋白结合情况：
紫外光谱测试：紫外分光光度计测试金纳米粒子及经过酪蛋白孵育的金纳米粒子在水和PBS缓冲液中的紫外图谱；
测试结果：图1中可以看到，金纳米粒子经过与酪蛋白一起孵育后，紫外特征峰发生明显红移，表明酪蛋白与金纳米粒子成功结合；
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(SDS-PAGE)：凝胶电泳条件为10％聚丙烯酰胺胶，电泳电压120V，时间70分钟，显色为银染。
测试结果：图2中1：蛋白marker，2：胎牛血清，3：与酪蛋白孵育后的金纳米粒子，4：洗涤最后一次的上清液。可以看到最后一次上清液无明显的蛋白吸附，而金纳米颗粒出现明显蛋白吸附，证明酪蛋白成功接到了金纳米粒子的表面；
(2)动态光散射(DLS)粒径测量：将复合材料与胎牛血清(FBS)在37℃下置于摇床中孵育1小时，再离心纯化洗掉游离的血清后，通过动态光散射(DLS) 粒径测量以确定其抗蛋白吸附能力。
测试结果：图3可得，复合材料吸附血清后，粒径没有改变，证明其有优异的抗蛋白吸附性能；
(3)光动力实验：避光条件下，将1，3-二苯基异笨并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕获剂以示单线态氧的产生，在420nm激光灯照射下，每隔30s测一次紫外吸收，测八组曲线，观察空白DPBF溶液(见图4a)及加入复合材料的 DPBF溶液(见图4b)的特征峰对应的吸光度变化趋势。
测试结果：图4a中可以看到，未加入复合材料的DPBF溶液，在420nm处的吸光度几乎没有变化，而图4b中可以看到，加入了复合材料的DPBF溶液，溶液的吸光度明显下降,可以看出以酪蛋白包覆的金纳米粒子为模板的金纳米簇具有较好的光动力效应。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种包含金纳米粒子和金纳米团簇的核壳纳米材料在光动力抗癌中的应用，其特征在于，所述材料采用以下步骤制备：
步骤一、将83ul质量浓度为0.294M的氯金酸水溶液加热至沸腾，然后搅拌加入质量浓度为0.17M的柠檬酸三钠水溶液，直到溶液呈现亮红色，表明生成尺寸均匀、呈球形单分散分布的金纳米粒子；
步骤二、将金纳米粒子分散至PBS缓冲溶液中与酪蛋白溶液混合，保持酪蛋白浓度为0.1-0.5mg/ml，在25℃下孵育过夜，得到酪蛋白包覆的金纳米粒子；
步骤三、将酪蛋白包覆的金纳米粒子溶液进行离心纯化，除去反应体系中多余的酪蛋白之后，将其重新分散在PBS缓冲液中，调节反应体系的pH为10-11，搅拌加入质量浓度为0.294M的氯金酸水溶液，氯金酸的量为20ul-60ul，在40-50℃下反应5-7h，制备得到以酪蛋白包覆的金纳米粒子为模板的金纳米簇。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述步骤三中采用质量浓度为1M氢氧化钠溶液调节反应体系的pH值。
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