CN110760516A - 核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的应用和药物偶合物 - Google Patents

核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的应用和药物偶合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸适配体技术领域，具体涉及核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的应用和药物偶合物。所述核酸适配体衍生物通过用抗代谢药物取代至少部分如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物得到，所有R同时为氢，Base为选自A、T、G和C的碱基；或者所有R同时为羟基，Base为选自A、U、G和C的碱基；所述抗代谢药物为核苷类似物；n为10‑100的整数。本发明用抗代谢药物修饰核酸适配体，可以增强核酸适配体的稳定性，还可以提高抗代谢药物对肿瘤细胞的选择性。
Figure DDA0002270328650000011

Description

核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的 应用和药物偶合物
技术领域
本发明涉及核酸适配体技术领域，具体涉及一种核酸适配体衍生物，一种氨基化的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物或所述氨基化的核酸适配体衍生物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用，以及一种药物偶合物。
背景技术
核酸适配体是一种利用自身折叠的高级结构与特定靶标结合的单链寡核苷酸，主要是指一段DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或者修饰的DNA和RNA。它可以通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)筛选获得[Wochner, A.；Menger,M.；Rimmele,M.Characterisation ofaptamers for therapeutic studies.Expert Opin.Drug Discov.2007,2,1205-1224.]。DNA是由多个脱氧核苷酸组成，一个脱氧核苷酸分子由一分子碱基(腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C和鸟嘌呤G)、一分子脱氧核糖和一分子磷酸偶联而成；RNA是由多个核糖核苷酸组成，一个核糖核苷酸是由一分子碱基(腺嘌呤A、尿嘧啶 U、胞嘧啶C、鸟嘌呤G)、一分子核糖和一分子磷酸偶联而成。
Figure BDA0002270328630000011
核酸适配体可以通过3D构象互补与靶分子结合，具有与抗体相似的亲和性和特异性，且具有水溶性好、免疫原性低、生产容易、花费少及稳定性高等优点，并且临床试验证明是安全的。并且，由于可以实现细胞水平的特异性递送，核酸适配体作为靶向分子已经被广泛应用在药物的靶向递送研究中[Jiang,F.；Liu,B.；Lu,J.；Li,F.；Li,D.；Liang,C.；Dang,L.；Liu,J.；He,B.； Badshah S.A.；Lu,C.；He,X.；Guo,B.；Zhang,X.-B.；Tan,W.；Lu,A.；Zhang,G. Progress and Challenges in Developing Aptamer-FunctionalizedTargeted Drug Delivery Systems.Int.J.Mol.Sci.2015,16,23784-23822.]。而且，核酸本身具有多种药理作用，按其作用特点可分为：(1)抗病毒剂；(2)抗肿瘤剂； (3)干扰素诱导剂；(4)免疫增强剂等[冯琦,王成济,孙秉中.核酸药物的研究现状与展望.中国生化药物杂志,1997,18(3):156-160.]。然而，核酸作为药物或者靶向分子在体内容易被核酸酶等的作用下快速代谢掉，因此需要对核酸进行修饰，增强其稳定性。文献报道主要有下列方法稳定核酸：(1) 碱基修饰；(2)糖修饰；(3)磷酸酯修饰；(4)L-DNA等[Ni,S.；Yao,H.； Wang,L.；Lu,J.；Jiang,F.；Lu,A.；Zhang,G.Chemical Modifications of Nucleic Acid Aptamersfor Therapeutic Purposes.Int.J.Mol.Sci.2017,18,1683.]。这些方法可以在一定程度上稳定核酸适配体，却难以提高核酸适配体的药理活性。
肿瘤是一类严重危害人类生命健康的疾病，表现为细胞增殖、分化异常等。化疗是治疗肿瘤的方法之一。抗肿瘤化疗药物主要包括：(1)抗代谢药物；(2)烷化剂；(3)细胞毒素类抗生素和相关物质；(4)植物生物碱和其他天然药；(5)其他抗肿瘤药等5个亚类。其中，抗代谢药物是目前应用较为广泛的一种抗肿瘤药物，该类药物大多为核苷类似物，是利用生物电子等排原理，将DNA合成中所需的嘌呤、嘧啶等代谢物的结构作细微改变而得，经细胞内三磷酸化过程活化后，通过抑制合成嘌呤或嘧啶核苷酸的相关酶使细胞内三磷酸碱基脱氧核苷酸合成失调、掺入DNA或RNA大分子中干扰细胞复制、竞争性抑制DNA的合成相关酶等作用杀死肿瘤细胞。然而，抗代谢药物没有肿瘤选择性，临床使用存在严重的毒副反应风险。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上问题，提供一种用抗代谢药物修饰的核酸适配体衍生物，该核酸适配体衍生物具有提高的稳定性，并且增强了抗代谢药物对肿瘤细胞的选择性。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种核酸适配体衍生物，该核酸适配体衍生物通过用抗代谢药物取代至少部分如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物得到，
其中，所有R同时为氢，Base为选自A、T、G和C的碱基；或者
所有R同时为羟基，Base为选自A、U、G和C的碱基；
其中，所述抗代谢药物为核苷类似物；
其中，n为10-100的整数。
本发明第二方面提供一种氨基化的核酸适配体衍生物，该氨基化的核酸适配体衍生物包括如上所述的核酸适配体衍生物以及通过酯化反应连接在所述核酸适配体衍生物磷酸末端上的连接臂，所述连接臂具有如式2所示的结构式；
Figure BDA0002270328630000041
其中，m为2-6的整数。
本发明第三方面提供如上所述的核酸适配体衍生物或如上所述的氨基化的核酸适配体衍生物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
本发明第四方面提供一种药物偶合物，该药物偶合物包括：如上所述的核酸适配体衍生物和抑制肿瘤生长的药物，以及用于将所述核酸适配体衍生物和所述抑制肿瘤生长的药物连接的连接臂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过用抗代谢药物来修饰核酸适配体，一方面可以增强核酸适配体的稳定性，另一方面利用核酸适配体对肿瘤细胞的识别能力将抗代谢药物靶向输送到肿瘤细胞，从而提高抗代谢药物对肿瘤细胞的选择性。同时本发明中的核酸适配体衍生物还能偶联上其它抗肿瘤机制的药物，从而从不同的作用靶点治疗肿瘤，具有协同效果。
附图说明
图1为本发明制备例1中核酸适配体衍生物1的MS图谱；
图2为本发明制备例1中核酸适配体衍生物2的MS图谱；
图3为对比例制备例中核酸适配体CRO的MS图谱；
图4为本发明制备例2中氨基修饰的Aptamer 1的MS图谱；
图5为本发明实施例1中偶合物1的MS图谱；
图6为本发明实施例2中偶合物2的MS图谱；
图7为本发明实施例3中偶合物3的MS图谱；
图8为本发明实施例4中偶合物4的MS图谱；
图9为本发明制备的核酸适配体衍生物Aptamer 1对卵巢癌细胞系 SKOV3的特异性(A：对卵巢癌细胞系SKOV3的选择性；B：为对正常的卵巢细胞系的选择性)；
图10为本发明制备的偶合物1-4对卵巢癌细胞系SKOV3的活性测试结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在研究的过程中，突破了以往对核酸进行稳定性修饰的常规思路，以核苷类似物的抗代谢药物来替换核酸适配体中的相应碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物，得到了新的核酸适配体衍生物，其不仅对核酸酶具有显著提高的稳定性，还提高了抗代谢药物对肿瘤细胞的选择性，并且该新的核酸适配体衍生物进入肿瘤细胞后，会在细胞质的作用下释放出抗代谢药物，从而发挥抗肿瘤效果。
基于如上的发现，第一方面，本发明提供一种核酸适配体衍生物，该核酸适配体衍生物通过用抗代谢药物取代至少部分如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物得到，
Figure BDA0002270328630000061
其中，所有R同时为氢，Base为选自A、T、G和C的碱基；或者
所有R同时为羟基，Base为选自A、U、G和C的碱基；
其中，所述抗代谢药物为核苷类似物；
其中，n为10-100的整数。
应该理解的是，术语“相应的”是指根据抗代谢药物的类型而替换核酸适配体中相应的碱基类型，例如，如果抗代谢药物是通过将DNA合成中所需的鸟嘌呤的结构作细微改变从而抑制合成鸟嘌呤核苷酸的相关酶的鸟嘌呤类似物，则该抗代谢药物取代的是核酸适配体中至少部分鸟嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
根据本发明，所述抗代谢药物可以为任意的将DNA合成中所需的嘌呤、嘧啶等代谢物的结构作细微改变从而抑制合成嘌呤或嘧啶核苷酸的相关酶的核苷类似物，包括但不限于6-巯嘌呤
Figure BDA0002270328630000062
硫鸟嘌呤
Figure BDA0002270328630000063
奈拉滨
Figure BDA0002270328630000064
氯法拉滨
Figure BDA0002270328630000065
氟达拉滨克拉屈滨
Figure BDA0002270328630000067
5-氟尿嘧啶
Figure BDA0002270328630000071
卡培他滨
Figure BDA0002270328630000072
阿糖胞苷
Figure BDA0002270328630000073
安西他滨
Figure BDA0002270328630000074
吉西他滨
Figure BDA0002270328630000075
曲沙他滨
Figure BDA0002270328630000076
和地西他滨
Figure BDA0002270328630000077
根据如上各抗代谢药物的结构，优选的，所述取代以如下至少一种的方式发生：
(1)用6-巯嘌呤取代A(腺嘌呤)；
(2)用硫鸟嘌呤取代G(鸟嘌呤)；
(3)用奈拉滨、氯法拉滨、氟达拉滨和克拉屈滨取代A与脱氧核糖或核糖形成的偶合物或者取代G与脱氧核糖或核糖形成的偶合物；
(4)用5-氟尿嘧啶取代U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶)；
(5)用卡培他滨取代U与脱氧核糖或核糖形成的偶合物或者取代T与脱氧核糖或核糖形成的偶合物；
(6)用阿糖胞苷、安西他滨、吉西他滨、曲沙他滨和地西他滨取代C (胞嘧啶)与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
根据本发明，所述取代可以为单一的一种取代方式，例如，仅将5-氟尿嘧啶取代U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶)而形成核酸适配体衍生物，也可以为不同的取代方式的结合，例如，将5-氟尿嘧啶取代U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶)，且以硫鸟嘌呤取代G(鸟嘌呤)而形成核酸适配体衍生物。
根据本发明一种具体的实施方式，所述核酸适配体衍生物为仅将5-氟尿嘧啶取代U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶)而形成的核酸适配体衍生物。
根据本发明另一种具体的实施方式，所述核酸适配体衍生物为仅将硫鸟嘌呤取代G(鸟嘌呤)而形成的核酸适配体衍生物。
根据本发明，只要使用所述核苷类似物的抗代谢药物取代核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物即可提高所述核酸适配体的核酸酶稳定性，而对于取代的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物的位置以及个数并没有特别的限制。根据本发明一种优选的实施方式，用抗代谢药物取代至少1个如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。根据本发明一种更为优选的实施方式，用抗代谢药物取代全部如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
根据本发明一种具体的实施方式，当n为10时，可以用抗代谢药物取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
根据本发明一种具体的实施方式，当n为50时，可以用抗代谢药物取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、 12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、 22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、 32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
根据本发明一种具体的实施方式，当n为100时，可以用抗代谢药物取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、 12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、 22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、 32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、 42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、 52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、 62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、 72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、 82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、 92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
如上仅是列举了n为10、50或100的情况下，可以用抗代谢药物取代如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物的个数，但本领域技术人员能够理解的是，当n为10-100之间的任意整数时，取代的个数可以为1至n+1之间的任意整数。
根据本发明一种优选的实施方式，所述核酸适配体衍生物为将5-氟尿嘧啶取代至少1个如式1所示的核酸适配体中U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶) 而形成的核酸适配体衍生物；更为优选的，所述核酸适配体衍生物为将5- 氟尿嘧啶取代100％如式1所示的核酸适配体中U(尿嘧啶)或T(胸腺嘧啶)而形成的核酸适配体衍生物。
根据本发明另一种优选的实施方式，所述核酸适配体衍生物为将硫鸟嘌呤取代至少1个如式1所示的核酸适配体中G(鸟嘌呤)而形成的核酸适配体衍生物；更为优选的，所述核酸适配体衍生物为将硫鸟嘌呤取代100％如式1所示的核酸适配体中G(鸟嘌呤)而形成的核酸适配体衍生物。
根据本发明，所述核酸适配体可以为本领域常规使用的各种需要提高核酸酶稳定性的核酸适配体，其可以为一段DNA序列，也可以为一段RNA序列，当其为一段DNA序列时，在式1所示结构中，所有R同时为氢，Base 为选自A、T、G和C的碱基；当其为一段RNA序列时，所有R同时为羟基，Base为选自A、U、G和C的碱基。
根据本发明，n为10-100的整数，例如，n可以为10，26，54，78，99。
根据本发明一种优选的实施方式，所述核酸适配体为核仁素适配体 AS1411，其核酸序列如SEQ ID NO:1(5-GGT GGT GGT GGTTGT GGT GGTGGT GG-3’)所示。在该优选的实施方式中，n为25。
本发明的发明人在研究的过程中发现，当所述核酸适配体为核仁素适配体AS1411时，将5-氟尿嘧啶(5Fu)取代至少1个、2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个核仁素适配体AS1411中T(胸腺嘧啶)，优选取代9 个核仁素适配体AS1411中T(胸腺嘧啶)时，能够更为显著的提高核仁素适配体AS1411的核酸酶稳定性，以及由其制备的抗肿瘤药物偶合物的抗肿瘤效果。因此，根据本发明一种更为优选的实施方式，所述核酸适配体衍生物的核酸序列如SEQ ID NO:2(5’-GG(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu) (5Fu)G(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu)GG-3’)所示。
本发明的发明人在研究的过程中还发现，当所述核酸适配体为核仁素适配体AS1411时，将硫鸟嘌呤(tG)取代至少1个、2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核仁素适配体AS1411中鸟嘌呤(G)，优选取代17个核仁素适配体AS1411 中鸟嘌呤(G)时，能够较为显著的提高核仁素适配体AS1411的核酸酶稳定性，以及由其制备的抗肿瘤药物偶合物的抗肿瘤效果。因此，根据本发明一种更为优选的实施方式，所述核酸适配体衍生物的核酸序列如SEQ ID NO: 3(5’-(tG)(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)TT(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)T (tG)(tG)T(tG)(tG)-3’)所示。
能够理解的是，当所述抗代谢药物取代核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物时，其以和在先的相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物相类似的方式连接在核酸适配体的骨架结构上。
根据本发明，所述核酸适配体衍生物可以通过本领域常规的方式进行合成，例如，可以采用核酸固相合成的方法进行合成，可以通过基于四步法亚磷酰胺化学合成方法(Froehler,Matteucci,1983)，在DNA固相合成仪上进行合成，具体的：该过程将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺分子耦合到一个固定在固相(一般是硅材质表面)的脱氧核苷酸分子上。在第一个合成循环中，核苷酸链从第一个固定在表面上受保护的核苷酸分子开始延伸。其中，经常采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃(CPG)或者聚苯乙烯微珠(PS beads)。试剂被泵入并流经材质表面，诱导分步添加的核苷酸单体加入到寡核苷酸链上，使寡核苷酸链不断延长。
其中，每添加一个核苷酸单体到核苷酸链的四步过程如下：
(1)脱保护：一种弱酸从延长的核苷酸链的5’端末端移除二甲氧三苯甲基基团，并产生一个5’端活性羟基基团；
(2)耦合：脱氧核苷亚磷酰胺分子在适当的活化剂(如四唑，tetrazole) 作用下，会产生一个活性单体分子，与上一步产生的5’羟基基团进行反应；
(3)盖帽：未耦合的5’羟基基团会被封闭，经常采用的封闭剂是酰化剂；
(4)氧化：连接核苷酸分子之间的亚磷酯键是不稳定的，容易被酸、碱水解，所以需要被氧化成为更加稳定的磷酸三酯。
整个合成过程完成后，采用浓氨水将寡核苷酸链从固相上切除，寡核苷酸链上的保护基团会被同时移除，残留最初固定在表面的那一个残基。
能够理解的是，当需要用抗代谢药物取代至少部分如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物时，可以直接添加抗代谢药物已经取代好的核苷酸单体进行核酸链的合成。其中，所述抗代谢药物已经取代好的核苷酸单体可以自行合成，也可以委托公司合成，例如，可以委托苏州贝信生物技术有限公司进行合成。
第二方面，本发明提供了一种氨基化的核酸适配体衍生物，该氨基化的核酸适配体衍生物包括如上所述的核酸适配体衍生物以及通过酯化反应连接在所述核酸适配体衍生物磷酸末端上的连接臂，所述连接臂具有如式2所示的结构式；
Figure BDA0002270328630000121
其中，m为2-6的整数，例如，可以为2、3、4、5、6。
氨基化的核酸适配体衍生物可以通过如下的方式合成(以m＝3为例进行说明)：以下式3修饰的可控玻璃微球(CPG)为起点，按照如上所述的采用经典的四步合成法在固相合成仪上完成氨基修饰的核酸适配体的合成。
Figure BDA0002270328630000131
第三方面，本发明提供了如上所述的核酸适配体衍生物或如上所述的氨基化的核酸适配体衍生物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种药物偶合物，该药物偶合物包括：如上所述的核酸适配体衍生物和抑制肿瘤生长的药物，以及用于将所述核酸适配体衍生物和所述抑制肿瘤生长的药物连接的连接臂。
根据本发明，所述连接臂可以为本领域常规使用的将核酸适配体与相应药物连接的连接臂。根据本发明一种优选的实施方式，所述连接臂具有如式 2所示的结构式；
Figure BDA0002270328630000132
其中，m为2-6的整数，例如，可以为2、3、4、5、6。
根据本发明，所述抑制肿瘤生长的药物可以为本领域常规使用的各种抗肿瘤生长的药物，本领域技术人员可以根据实际的需要进行相应的选择，优选的，选自抗代谢药物、细胞毒素类药物及其衍生物以及植物生物碱及其衍生物。
根据本发明进一步优选的实施方式，所述抑制肿瘤生长的药物选自紫杉醇及其衍生物、阿霉素及其衍生物、伊立替康及其衍生物、拓扑替康及其衍生物、美登素及其衍生物、雷甲素及其衍生物、单甲基瑞奥西汀E(MMAE) 及其衍生物和单甲基瑞奥西汀F(MMAF)及其衍生物。
其中，所述抑制肿瘤生长的药物可以通过常规的方式与用于将所述核酸适配体衍生物和所述抑制肿瘤生长的药物连接的连接臂相连，以所述连接臂为如上式2结构，所述抑制肿瘤生长的药物为美登素为例，式2结构上的氨基通过与美登素上的羧基缩水缩合形成酰胺键而连接到一起。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所用的试剂均为市售产品。
5-氟尿嘧啶(5Fu)替代胸腺嘧啶(T)的核苷酸以及硫鸟嘌呤(tG)代替鸟嘌呤(G)的核苷酸委托苏州贝信生物技术有限公司合成。
DNA固相合成在苏州贝信生物技术有限公司完成。
制备例1
本制备例用于说明抗代谢药物修饰的核酸适配体衍生物的合成
抗代谢药物修饰的核酸适配体衍生物以核仁素适配体AS1411的碱基序列为基准采用经典的四步合成法在DNA固相合成仪上完成。核仁素适配体 AS1411的碱基序列为5’-GGT GGT GGTGGTTGT GGT GGTGGT GG-3’ (SEQ ID NO:1)；用5-氟尿嘧啶(5Fu)代替胸腺嘧啶(T)修饰核仁素适配体AS1411，得到核酸适配体衍生物Aptamer1(MS：calculated8308.2，found 8306.6，MS图谱如图1所示)，其碱基序列为5’-GG(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu) GG(5Fu)(5Fu)G(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu)GG(5Fu)GG-3’(SEQ ID NO:2)；用硫鸟嘌呤(tG)代替鸟嘌呤(G)修饰核酸适配体AS1411，得到核酸适配体衍生物Aptamer 2(MS：calculated8544.0，found 8543.9，MS图谱如图2 所示)，其碱基序列为5’-(tG)(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)TT(tG)T(tG) (tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)T(tG)(tG)-3’(SEQ ID NO:3)。
所得核酸适配体衍生物的结构式如式3所示(Aptamer 1，Base为G和 5Fu；Aptamer2，Base为T和tG；n为25)。
Figure BDA0002270328630000151
如上合成的抗代谢药物修饰的核酸适配体衍生物分离纯化在高效液相色谱Waters UPLC-UV/Vis上进行，分离条件如下：
色谱柱：XBridge Shield RP18，3.5um，4.6*50mm；
柱温：40℃；
流动相：乙腈/乙酸的氨水溶液，梯度洗脱；
流速：1.5mL/min。
对比制备例
本对比例制备例用于参比的核酸适配体的合成
按照制备例1的方法合成参比的核酸适配体CRO(非肿瘤细胞特异性)，序列为5’-CCT CCT CCTCCTTCT CCT CCTCCT CC-3’(SEQ ID NO:4) (MS：calculated 7592.0，found7596.7，MS图谱如图3所示)。
制备例2
本制备例用于说明抗代谢药物修饰的核酸适配体衍生物的氨基化修饰
按照制备例1的方法，以式3所示可控玻璃微球(CPG)为起点，采用经典的四步合成法在固相合成仪上依次连上核酸适配体Aptamer1的所有序列，得到氨基修饰的Aptamer 1(MS：calculated 8518.3，found 8527.1，MS 图谱如图4所示，结构式如式5所示)。
Figure BDA0002270328630000161
实施例1
本实施例用于说明核酸适配体衍生物-美登素偶合物的合成
将1.0eq.的美登素衍生物和1.5eq.的DMT-MM溶于DMSO，室温搅拌 1小时，将0.01eq.氨基修饰的Aptamer 1溶于pH＝9.0的碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液后加入，在37℃条件下振荡24小时，分离纯化得到核酸适配体衍生物-美登素偶合物(Conjugate 1)，其反应式如下所示，质谱特征数据(MS： calculated 9227.8，found 9227.0，MS图谱如图5所示)。
Figure BDA0002270328630000171
实施例2
本实施例用于说明核酸适配体衍生物-MMAE偶合物的合成
将1.0eq.的MMAE(单甲基瑞奥西汀E)衍生物和1.05eq.的HATU溶于DMSO，室温搅拌1小时，将0.01eq.的氨基修饰的Aptamer 1溶于pH＝7.0 的磷酸盐缓冲液后加入，在37℃条件下振荡24小时，分离纯化得到Aptamer 1-MMAE偶合物(Conjugate 2)，其反应式如下所示，质谱特征数据(MS： calculated 9687.2，found 9687.7，MS图谱如图6所示)。
Figure BDA0002270328630000181
实施例3
本实施例用于说明核酸适配体衍生物-MMAF偶合物的合成
将1.0eq.的MMAF(单甲基瑞奥西汀F)衍生物和1.5eq.的DMT-MM 溶于DMSO，室温搅拌1小时，将0.01eq.氨基修饰的Aptamer 1溶于pH＝9.0 的碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液后加入，在37℃条件下振荡24小时，分离纯化得到Aptamer 1-MMAF偶合物(Conjugate 3)，其反应式如下所示，质谱特征数据(MS：calculated 9701.1，found 9701.9，MS图谱如图7所示)。
Figure BDA0002270328630000191
实施例4
本实施例用于说明核酸适配体衍生物-雷甲素偶合物的合成
将1.0eq.的雷甲素衍生物和1.5eq.的DMT-MM溶于DMSO，室温搅拌 1小时，将0.01eq.氨基修饰的Aptamer 1溶于pH＝9.0的碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液后加入，在37℃条件下振荡24小时，分离纯化得到Aptamer 1- 雷甲素偶合物(Conjugate 4)，其反应式如下所示，质谱特征数据(MS： calculated 9327.8，found 9325.1，MS图谱如图8所示)。
Figure BDA0002270328630000201
测试例1
核酸适配体衍生物在核酸酶作用下的稳定性试验
将制备例1制备的核酸适配体衍生物Aptamer 1、Aptamer 2及对照适配体AS1411(浓度1mM)分别加入PBS缓冲溶液(Sigma公司)、PBS缓冲溶液+核酸酶(Sigma公司)，37℃震荡培养箱孵育72小时，在4、8、12、24、48及72小时时间点取50μL样品，HPLC分析所含核酸适配体及其衍生物的浓度，其浓度如表1所示。从表1中可以看出，Aptamer 1、Aptamer 2 和AS1411在PBS溶液中是稳定的；而在核酸酶的作用下，Aptamer 1、 Aptamer 2和AS1411都有一定的降解，而Aptamer 1、Aptamer 2比AS1411 更加稳定；并且Aptamer 1比Aptamer 2更佳稳定。
表1
Figure BDA0002270328630000211
测试例2
核酸适配体衍生物对肿瘤细胞的特异性实验
(1)参照文献(Li,F.；Lu,J.；Liu,J.；Liang,C.；Wang,M.；Wang,L.；Li,D.；Yao,H.；Zhang,Q.；Wen,J.；Zhang,Z.-K.；Li,J.；Lv,Q.；He,X.；Guo,B.；Guan, D.；Yu,Y.；Dang,L.；Wu,X.；Li,Y.；Jiang,F.；Sun,S.；Zhang,B.-T.；Lu,A.； Zhang,G.A water-solublenucleolin aptamer-paclitaxel conjugate for tumor-specific targeting inovarian cancer.Nat.commun.2017,8,1390.)的方法对核酸适配体衍生物Aptamer 1，以及对照AS1411和CRO进行FAM标记。
(2)将FAM标记的核酸适配体衍生物Aptamer 1分别与5.0×105/mL 卵巢癌细胞系SKOV3(购自ATCC细胞库)和正常的卵巢细胞系(购自ATCC 细胞库)在200uL的Hanks缓冲液中孵育30分钟，然后用Hanks缓冲液洗涤两次，并用流式细胞仪进行分析。FAM标记的AS1411和FAM标记的CRO 适配体作为对照。结果如图9(A：对卵巢癌细胞系SKOV3的选择性；B：为对正常的卵巢细胞系的选择性)所示。
由图9可以看出，用5-氟尿嘧啶(5Fu)代替胸腺嘧啶(T)修饰核酸适配体AS1411得到的Aptamer 1，对核仁素过表达的卵巢癌细胞系SKOV3具有很好的选择性。
测试例3
偶合物的体外肿瘤细胞株活性测试
细胞培养用培基(McCoy’s 5A)购买于Gibco公司，胎牛血清购买于 Hyclone公司。CCK-8试剂盒购自Sigma公司。实验所用的卵巢癌细胞系 SKOV3从ATCC细胞库购买。
SKOV3的培养基为McCoy’s 5A。向以上培养基添加10％胎牛血清和1％双抗配成完全培养基，细胞置于温度为37℃、CO2浓度为5％的孵育箱中培养。卵巢癌细胞系SKOV3细胞以较低密度(1×103-1×104)均匀铺于96孔板，在培养箱中过夜培养使之贴壁，倒掉旧培基，更换含药无血清培基。
本测试例测试偶合物的细胞毒作用，并以等量相同的抗代谢物和抗肿瘤药物作为参照，来评价适配体衍生物和抗肿瘤药物偶合前后的抗肿瘤活性差异。实施例1-4制备的偶合物Conjugate 1-4，均溶于PBS配成10mM溶液，现配现用。以无血清培基作为空白对照，给药组分为四组：即偶合物组、9 倍摩尔数的抗代谢物组(按照偶合物的结构式，每摩尔的偶合物嵌合9摩尔抗代谢药物)、等量细胞毒药物组、9倍摩尔数的抗代谢药物+细胞毒药物联合用药组(按照偶合物的结构式，每摩尔的偶合物嵌合9摩尔抗代谢药物和1摩尔细胞毒药物)。给药终浓度为：1、5、25、50、100nM。在温度为 37℃、CO2浓度为5％的孵育箱培育48小时。用CCK-8试剂盒检测细胞活性。平行操作3次。其细胞存活率如图10所示。
由图10可以看出，Conjugate 1-4显示出比单用抗代谢物和单用细胞毒药物表现出更强的抗肿瘤活性，和抗代谢药物和细胞毒药物联用活性相当。同时测试例2也证明了，所合成的核酸适配体衍生物对肿瘤细胞具有很好的选择性，可用于体内靶向给药治疗。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赣南医学院
<120> 核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的应用和药物偶合
物
<130> GZI00596GNYXY
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 核仁素适配体AS1411
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 核酸适配体衍生物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> n为5-氟尿嘧啶（5Fu），取代核仁素适配体AS1411中的胸腺嘧啶T
<400> 2
ggnggnggng gnngnggngg nggngg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 核酸适配体衍生物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> n为硫鸟嘌呤，取代核仁素适配体AS1411中的鸟嘌呤G
<400> 3
nntnntnntn nttntnntnn tnntnn 26

Claims (10)

1.一种核酸适配体衍生物，其特征在于，该核酸适配体衍生物通过用抗代谢药物取代至少部分如式1所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物得到，
Figure FDA0002270328620000011
其中，所有R同时为氢，Base为选自A、T、G和C的碱基；或者
所有R同时为羟基，Base为选自A、U、G和C的碱基；
其中，所述抗代谢药物为核苷类似物；
其中，n为10-100的整数。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体衍生物，其中，所述抗代谢药物选自6-巯嘌呤、硫鸟嘌呤、奈拉滨、氯法拉滨、氟达拉滨、克拉屈滨、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、安西他滨、吉西他滨、曲沙他滨和地西他滨所组成的组中；
优选的，所述取代选自如下至少一种：
(1)用6-巯嘌呤取代A；
(2)用硫鸟嘌呤取代G；
(3)用奈拉滨、氯法拉滨、氟达拉滨和克拉屈滨取代A与脱氧核糖或核糖形成的偶合物或者取代G与脱氧核糖或核糖形成的偶合物；
(4)用5-氟尿嘧啶取代U或T；
(5)用卡培他滨取代U与脱氧核糖或核糖形成的偶合物或者取代T与脱氧核糖或核糖形成的偶合物；
(6)用阿糖胞苷、安西他滨、吉西他滨、曲沙他滨和地西他滨取代C与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体衍生物，其中，所述至少部分为至少1个。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核酸适配体衍生物，其中，所述核酸适配体的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的核酸适配体衍生物，其中，所述核酸适配体衍生物的核酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
6.一种氨基化的核酸适配体衍生物，其特征在于，该氨基化的核酸适配体衍生物包括权利要求1-5中任意一项所述的核酸适配体衍生物以及通过酯化反应连接在所述核酸适配体衍生物磷酸末端上的连接臂，所述连接臂具有如式2所示的结构式；
Figure FDA0002270328620000021
其中，m为2-6的整数。
7.权利要求1-5中任意一项所述的核酸适配体衍生物或权利要求6所述的氨基化的核酸适配体衍生物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
8.一种药物偶合物，其特征在于，该药物偶合物包括：权利要求1-5中任意一项所述的核酸适配体衍生物和抑制肿瘤生长的药物，以及用于将所述核酸适配体衍生物和所述抑制肿瘤生长的药物连接的连接臂。
9.根据权利要求8所述的药物偶合物，其中，所述连接臂具有如式2所示的结构式；
其中，m为2-6的整数。
10.根据权利要求8或9所述的药物偶合物，其中，所述抑制肿瘤生长的药物选自抗代谢药物、细胞毒素类药物及其衍生物以及植物生物碱及其衍生物；
优选的，所述抑制肿瘤生长的药物选自紫杉醇及其衍生物、阿霉素及其衍生物、伊立替康及其衍生物、拓扑替康及其衍生物、美登素及其衍生物、雷甲素及其衍生物、单甲基瑞奥西汀E及其衍生物和单甲基瑞奥西汀F及其衍生物。
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GR01 Patent grant
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