CN110755361A - 一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法 - Google Patents

一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法，属于化妆品技术领域，按质量百分比计，由2‑4％iPS细胞液和96‑98％基底液组成。本发明提供的iPS细胞液成分护肤品，能有效保持细胞液的生长因子功效成分，安全性极高，肤感舒适，保湿锁水效果良好，有效保持肌肤弹性，结合最新细胞生物技术的护肤品，具有良好市场前景。

Description

一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体为一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法。
背景技术
随着生物科技的进步和生活水平的提高，人们对利用生物技术的高端新型护肤品的需求也越来越高。iPS干细胞(induced pluripotent stem cells)是通过转录因子利用反转录的方式导入动物已分化的成体细胞从而形成的具有多能性的干细胞，称为诱导式多能性干细胞。研究表明，这些多能性干细胞的培养液中，含有多种具有生物活性的细胞生长因子，可以有效激活人的成体干细胞的活性，可以促进毛囊或表皮基底层的成体干细胞的增殖，并且促进皮肤表皮细胞的自我更新、再生修复，从而能够有效地达到护肤、美容、抗衰老的效果。
然而能高效地制取干细胞细胞液，并且成功将干细胞细胞液制成护肤品的合理配方和工艺则较少。如何能结合生物技术开发一款新型干细胞细胞液护肤品以适应市场需求是当前亟待解决的难题。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品及其制备方法，制备得到的护肤品具有良好保湿、增加皮肤弹性的功能。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，由iPS细胞液和基底液组成。
作为本发明一种优选的技术方案，按质量百分比计，由2-4％iPS细胞液和96-98％基底液组成。
作为本发明一种优选的技术方案，所述基底液由A组分、B组分、C组分、D组分和E组分组成。
作为本发明一种优选的技术方案，所述A组分包括2-8％甘油、0.5-3％蔗糖、2-3％双甘油、0.5-1.0％山梨(糖)醇和89-95％水。
作为本发明一种优选的技术方案，所述B组分包括1-6％丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.005-0.3％卡波姆和93.7-96.995％水。
作为本发明一种优选的技术方案，所述C组分包括0.035％氢氧化钠和99.965％水。
作为本发明一种优选的技术方案，所述D组分包括1-6％丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、2-6％角鲨烷、2-8％聚山梨醇酯-60、0.3-0.6％1,2-戊二醇、2-8％丁二醇和80.5-92.7％水。
作为本发明一种优选的技术方案，所述E组分包括0.5-1％苯氧乙醇、1-6％狗牙蔷薇果提取物、1-6％姜根提取物、1-6％线状阿司巴拉妥提取物、0.005-0.02％日用香精、2-8％丁二醇和78.49-94.495％水。
一种如上所述的以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)制取iPS细胞液：从人体的血样中收集外周血细胞，并用iPS干细胞诱导试剂盒进行人工诱导，经过两到三周的诱导后，获得iPS细胞系，并进行细胞培养，培养结束后进行细胞上清液的收集，将所收集的上清液进行浓缩，按1:1-1:20的比例浓缩后，留存备后续使用；
(2)制备基底液：将A组分和B组分加入高速混合器加热到80-85℃，进行高速混合搅拌,高速混合器冷却到40℃以下时投入C组分高速混合搅拌，然后投入D组分进行高速混合搅拌,待高速混合器冷却到室温后投入E组分；
(3)待高速混合器冷却到室温后，在步骤(2)的基底液中加入步骤(1)中的iPS细胞液，进行高速混合搅拌。
作为本发明一种优选的技术方案，还包括步骤(4)半制品检测合格后灌装，成品检测合格后入冷藏库4-10℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的护肤品中，含有由iPS细胞液和协助保持生物活性的基底液组成。通过合理制取工艺与配方，护肤品中各组分相互作用、协调增效，唤醒皮肤细胞并促进细胞自我修复更新。利用人体的成体细胞诱导培养iPS细胞培养液，分离出具有生长因子等活性物质的培养液，再通过特有的配方提供一种增加皮肤弹性、保湿锁水效果显著，且安全无任何毒副作用的护肤品及制备方法。
2.本发明首次将iPS细胞引入护肤品中，iPS细胞液中所含生长因子能有效滋养皮肤细胞并促进人体皮肤细胞的自我更新，从内部细胞层面达到美容护肤效果。
3.生姜是一种药、食两用的植物，应用广泛，而且生姜原汁液还具有很好的抗氧化特性，姜根提取物能够有效的深层滋养和延缓肌肤的衰老，可加强皮肤的活性，具有抗氧化效果，同时具有保湿和克服臭味的作用。
4.抗酸茶是生长在炎暑、枯燥的严格环境中的灌木。线状阿司巴拉妥提取物是从抗酸茶的全草中获取的保湿成分，同时能排出自在基，有抗氧化的功用。
附图说明
图1为本发明中皮肤水分结果图；
图2为本发明中经皮水份散失量结果图；
图3为本发明中皮肤弹性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，由iPS细胞液和基底液组成。优选地，按质量百分比计，由2-4％iPS细胞液和96-98％基底液组成。
具体地，基底液由A组分、B组分、C组分、D组分和E组分组成。更为具体的是，A组分包括2-8％甘油、0.5-3％蔗糖、2-3％双甘油、0.5-1.0％山梨(糖)醇和89-95％水。B组分包括1-6％丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.005-0.3％卡波姆和93.7-96.995％水。C组分包括0.035％氢氧化钠和99.965％水。D组分包括1-6％丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、2-6％角鲨烷、2-8％聚山梨醇酯-60、0.3-0.6％1,2-戊二醇、2-8％丁二醇和80.5-92.7％水。E组分包括0.5-1％苯氧乙醇、1-6％狗牙蔷薇果提取物、1-6％姜根提取物、1-6％线状阿司巴拉妥提取物、0.005-0.02％日用香精、2-8％丁二醇和78.49-94.495％水。
一种如上所述的以iPS(induced pluripotent stem cells,iPS cells)细胞培养液为主要成分的护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)制取iPS细胞液：从人体的血样中收集外周血细胞，并用iPS干细胞诱导试剂盒进行人工诱导，经过两到三周的诱导后，获得iPS细胞系，并进行细胞培养，培养结束后进行细胞上清液的收集，将所收集的上清液进行浓缩，按1:1-1:20的比例浓缩后，留存备后续使用；
(2)制备基底液：将A组分和B组分加入高速混合器加热到80-85℃，进行高速混合搅拌,高速混合器冷却到40℃以下时投入C组分高速混合搅拌，然后投入D组分进行高速混合搅拌,待高速混合器冷却到室温后投入E组分；
(3)待高速混合器冷却到室温后，在步骤(2)的基底液中加入步骤(1)中的iPS细胞液，进行高速混合搅拌。
具体地，还包括步骤(4)半制品检测合格后灌装，成品检测合格后入冷藏库4-10℃保存。
实施例一：
本发明提供一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，按质量百分比计，由4％iPS细胞液和96％基底液组成。
其中iPS细胞液制取步骤如下：
即从人体的血样中收集外周血单个核细胞(PBMC)，利用CytoTune-iPS2.0LG(细胞重编程试剂盒厂商：日本ID Pharma Co.Ltd)进行感染，在无供给和无血清的条件下培养21天，形成人iPS细胞集落，然后，再基于人iPS细胞集落建立人iPS细胞系。
具体制备过程为：将外周血样用1.5倍的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，厂商：Thermo Fisher Scientific)进行稀释并放置在淋巴细胞分离液(品牌：Lymphoprep，厂商：Alere Technonlogies AS)中；然后，在室温下400g离心30分钟，收集中间层的PBMC，接种于24孔板完整的PBMC介质培养基(品牌：StemPro-34SFM厂商：Thermo Fisher Scientific)中，细胞密度为50万细胞/孔；细胞在完整的PBMC培养基中培养4天后，将细胞用CytoTune-iPS 2.0LG的Sev载体进行感染，感染复数为5；感染三天后，将100,000个受感染的细胞接种于以0.5μg/cm2浓度iMatrix511(细胞培养基质厂商：日本Nippi.Ltd)包被的24孔板中，在PBMC培养基中培养5天；五天后培养基从PBMC培养基换成StemFit培养基(厂商：Ajinomoto)继续培养13天，即可得到人的iPS细胞集落；从上述得到的iPS细胞集落中，选择生长状态良好、未分化的20个集落至24孔板，培养在以0.5μg/cm2浓度iMatrix-511包被的StemFit介质上；培养七天后，iPS细胞集落进行传代，将细胞通过在37℃TrupLE(非动物源性的消化酶厂商：美国Thermo Fisher Scientific)选择处理五分钟的条件下分离收集进离心管后，室温下200g离心3分钟，收集到的细胞接种于iMatrix-511涂抹的(0.5μg/cm2)24孔板培养，使用含10μM ROCK(p160ROCK)抑制剂(品牌型号：Y-27632厂商：日本WAKO.Ltd)新鲜培养基；传递6代后，从每组的20个集落中，选择生长状态良好、未分化的10个继续进行培养，在第8代，通过染色确认培养细胞内不含Sev载体后，测定细胞活力并进行纯度鉴定评估并完成细胞系建立；最后，取上清液通过0.22um滤膜过滤获取细胞培养液，(﹣80℃)冻存备用。
按质量百分比计，组分A包括5％甘油、2％蔗糖、2％双甘油、0.5％山梨(糖)醇和90.5％水。B组分包括3％丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.1％卡波姆和96.9％水。C组分包括0.035％氢氧化钠和99.965％水。D组分包括3％丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、3％角鲨烷、5％聚山梨醇酯-60、0.4％1,2-戊二醇、6％丁二醇和82.6％水。E组分包括1％苯氧乙醇、3％狗牙蔷薇果提取物、6％姜根提取物、5％线状阿司巴拉妥提取物、0.01％日用香精、6％丁二醇和78.99％水。
基底液与最终成品按如下步骤制备：
(1)称量上述A组分原料加入高速混合器加热到80℃，进行高速混合搅拌。
(2)称量上述B组分原料加入高速混合器加热到80℃，进行高速混合搅拌。
(3)称量上述C组分原料，高速混合器冷却到35℃时投入进行高速混合搅拌。
(4)称量上述D组分原料，高速混合器冷却到35℃时投入进行高速混合搅拌。
(5)称量上述E组分原料并添加上述保存待用的iPS细胞液，待高速混合器冷却到室温后投入进行高速混合搅拌。
(6)半制品检测合格后灌装，成品检测合格后入冷藏库4-10℃保存。
实施例二：
本发明提供一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，按质量百分比计，由2％iPS细胞液和98％基底液组成。
其中iPS细胞液制取步骤如下：
即从人体的血样中收集外周血单个核细胞(PBMC)，利用CytoTune-iPS2.0LG(细胞重编程试剂盒厂商：日本ID Pharma Co.Ltd)进行感染，在无供给和无血清的条件下培养21天，形成人iPS细胞集落，然后，再基于人iPS细胞集落建立人iPS细胞系。
具体制备过程为：将外周血样用1.5倍的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，厂商：Thermo Fisher Scientific)进行稀释并放置在淋巴细胞分离液(品牌：Lymphoprep，厂商：Alere Technonlogies AS)中；然后，在室温下400g离心30分钟，收集中间层的PBMC，接种于24孔板完整的PBMC介质培养基(品牌：StemPro-34SFM厂商：Thermo Fisher Scientific)中，细胞密度为50万细胞/孔；细胞在完整的PBMC培养基中培养4天后，将细胞用CytoTune-iPS 2.0LG的Sev载体进行感染，感染复数为5；感染三天后，将100,000个受感染的细胞接种于以0.5μg/cm2浓度iMatrix511(细胞培养基质厂商：日本Nippi.Ltd)包被的24孔板中，在PBMC培养基中培养5天；五天后培养基从PBMC培养基换成StemFit培养基(厂商：Ajinomoto)继续培养13天，即可得到人的iPS细胞集落；从上述得到的iPS细胞集落中，选择生长状态良好、未分化的20个集落至24孔板，培养在以0.5μg/cm2浓度iMatrix-511包被的StemFit介质上；培养七天后，iPS细胞集落进行传代，将细胞通过在37℃TrupLE(非动物源性的消化酶厂商：美国Thermo Fisher Scientific)选择处理五分钟的条件下分离收集进离心管后，室温下200g离心3分钟，收集到的细胞接种于iMatrix-511涂抹的(0.5μg/cm2)24孔板培养，使用含10μM ROCK(p160ROCK)抑制剂(品牌型号：Y-27632厂商：日本WAKO.Ltd)新鲜培养基；传递6代后，从每组的20个集落中，选择生长状态良好、未分化的10个继续进行培养，在第8代，通过染色确认培养细胞内不含Sev载体后，测定细胞活力并进行纯度鉴定评估并完成细胞系建立；最后，取上清液通过0.22um滤膜过滤获取细胞培养液，(﹣80℃)冻存备用。
按质量百分比计，组分A包括5％甘油、2％蔗糖、2％双甘油、1％山梨(糖)醇和90％水。B组分包括2％丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.2％卡波姆和97.8％水。C组分包括0.035％氢氧化钠和99.965％水。D组分包括4％丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、3％角鲨烷、6％聚山梨醇酯-60、0.5％1,2-戊二醇、6％丁二醇和80.5％水。E组分包括0.5％苯氧乙醇、5％狗牙蔷薇果提取物、6％姜根提取物、5％线状阿司巴拉妥提取物、0.01％日用香精、5％丁二醇和78.49％水。
基底液与最终成品按如下步骤制备：
(1)称量上述A组分原料加入高速混合器加热到85℃，进行高速混合搅拌。
(2)称量上述B组分原料加入高速混合器加热到85℃，进行高速混合搅拌。
(3)称量上述C组分原料，高速混合器冷却到30℃时投入进行高速混合搅拌。
(4)称量上述D组分原料，高速混合器冷却到30℃时投入进行高速混合搅拌。
(5)称量上述E组分原料并添加上述保存待用的iPS细胞液，待高速混合器冷却到室温后投入进行高速混合搅拌。
(6)半制品检测合格后灌装，成品检测合格后入冷藏库4-10℃保存。
产品检测：
1.人体斑贴试验：
1.1受试物：实施例一和实施例二的护肤品，及市售的日本护肤霜(对照组)。
1.2受试者：共27人，男13人，女14人，年龄20-45岁，符合受试者志愿入选标准。
斑试方法：选用斑试器，将受试物约0.025ml涂于斑试器内，将加有斑试物的斑试器胶带自下向上贴牢于前臂曲侧，48小时候去除受试物，于去除受试物斑贴器30min后观察皮肤反应，按《化妆品卫生规范》(2007年版)中皮肤反应分级标准记录结果。
1.3结果评价：按表1(皮肤不良反应分级标准)记录反应结果。
表1
Figure BDA0002216020060000081
1.4试验结果：见表2。
表2
Figure BDA0002216020060000082
以上结果显示：实施例一和实施例二中，27名受试者全部呈阴性反应(评分等级：0级)，依据《化妆品卫生规范》(2007版)人体皮肤斑贴试验判断标准，样品对人体无皮肤不良反应。对照组仅有一例一级可疑反应。
2.感官分析评估：
2.1受试物：实施例一和实施例二的化妆品成品及对照例。
2.2受试者：受试者共27人，男13人，女14人，年龄20-45岁，符合受试者志愿入选标准。
2.3评估方法：将受试物约0.4克涂于手背，回旋涂抹6次，然后以打分的方式(0-10分，分数越高代表该产品的质感、铺展性、湿润感、柔滑度、用后舒适感越好)，把这五项指标的分值相加，数值越高，说明产品性能越好。
2.4评估结果：涂用后平均受试者评分进行统计，结果如表3所示，结果表明，实施例一的护肤品，用后皮肤舒适、柔软、滋润，感官效果良好。
表3
样品 质感 铺展性 湿润感 柔滑度 舒适感 总分
实施例1 7.9 7.5 7.8 7.6 8.3 39.1
实施例2 8.2 7.3 7.5 7.9 8.8 39.7
对照例 7.5 7.1 7.8 6.9 7.6 36.9
3.补水与保湿锁水功效评价：
3.1测试人群：性别和年龄随机，共30名，随机分为5组每组6人，每组分别测试一种护肤品。
3.2测试样品：实施例一和实施例二，对比例1为未培养过细胞的StemFit细胞培养基液体(质量分数3％)与实施例一的基底液构成的护肤品，对比例2为实施例一的护肤品去掉姜根提取物、线状阿司巴拉妥提取物、狗牙蔷薇果提取物成分(去除成分用水代替)，对比例3为仅含实施例一的基底液的护肤品(iPS细胞液用水代替)，所有样品均4-10℃低温保存。
3.3测试条件：测试环境为专用测试间，室内保持温度处于24-26℃，湿度处于55-65％。
3.4测试仪器：皮肤水份含量测试仪Corneometer CM 825(德国CK公司)，皮肤水份流失测试探头Tewameter TM300(德国CK公司)。
3.5测试方法：受试者在测试期间以及测试前一周内，脸部未使用功能类似护肤品以及化妆品，测试者在测试期间每日早晚使用测试护肤品，使用后将护肤品保存于家用冰箱冷藏层(约4℃)。每次测试前受试者使用清水对脸部进行清洗，在测试房间内静坐15分钟。使用Corneometer CM 825对受试者皮肤表面水分含量进行测试，测试区域为左右脸颊，每个测试区域各测试3次共6次取平均值。使用Tewameter TM 300对受试者皮肤表面进行经皮水分丢失率测试，测试区域为右脸颊，测试3次取平均值。测试时间为使用前、使用后四小时、第二周、第四周。用皮肤测试仪进行皮肤水分与经皮水分丢失(transepidermal waterloss,TEWL)测试对比，皮肤水分数值增加代表皮肤补水效果好。经皮水分散失TEWL值，其值越小，水分散失越少，锁水能力越强；反之，锁水能力越弱。失水率，及TEWL值的变化率，此值越低锁水效果越好。
3.6测试结果：测试结果如图1和图2所示。由检测结果可知，受试者在使用了实施例一和实施例二产品后皮肤水份在短时间内都有明显提升，随着时间推移也有稳定长效的补水效果，水份流失率有明显降低，代表本发明的护肤品具有良好的补水与保湿锁水功效，具有防止皮肤表皮水的蒸散作用。相对于对比例3的结果可知iPS细胞液成分有良好补水护肤功效，相对于对比例1和对比例2的结果可知本发明的护肤品组合物比仅含单一成分的护肤品具有更好的补水与保湿锁水功效。
4.皮肤弹性功效评价：
4.1测试方法：对使用实施例一和实施例二、对比例1-3的受试者，用皮肤测试仪进行皮肤弹性数值测试对比，皮肤弹性数值的增加代表皮肤弹性变好。分别测试了使用前、使用后4h、2周、4周的受试者左右脸颊部位的弹性数值，每个位点测试3次，最后综合数据得出平均值。
4.2测试条件：测试环境为专用测试间，室内保持温度处于24-26℃，湿度处于55-65％。测试仪器为皮肤弹性测试仪，仪器探头为Cutometer dual MPA580。
4.3测试结果：结果如图3所示。由检测结果可知，使用实施例一和实施例二护肤品后4小时皮肤弹性有明显的提升，使用后4周皮肤弹性有稳定提升，结果表明iPS护肤品有良好提高皮肤弹性的效果。相对于对比例3的结果可知iPS细胞液成分有良好提高皮肤弹性功效，相对于对比例1和对比例2的结果可知本发明的护肤品组合物比仅含单一成分的护肤品具有更好的提高皮肤弹性功效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：由iPS细胞液和基底液组成。
2.根据权利要求1所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：按质量百分比计，由2-4％iPS细胞液和96-98％基底液组成。
3.根据权利要求2所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述基底液由A组分、B组分、C组分、D组分和E组分组成。
4.根据权利要求3所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述A组分包括2-8％甘油、0.5-3％蔗糖、2-3％双甘油、0.5-1.0％山梨(糖)醇和89-95％水。
5.根据权利要求3所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述B组分包括1-6％丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.005-0.3％卡波姆和93.7-96.995％水。
6.根据权利要求3所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述C组分包括0.035％氢氧化钠和99.965％水。
7.根据权利要求3所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述D组分包括1-6％丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、2-6％角鲨烷、2-8％聚山梨醇酯-60、0.3-0.6％1,2-戊二醇、2-8％丁二醇和80.5-92.7％水。
8.根据权利要求3所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品，其特征在于：所述E组分包括0.5-1％苯氧乙醇、1-6％狗牙蔷薇果提取物、1-6％姜根提取物、1-6％线状阿司巴拉妥提取物、0.005-0.02％日用香精、2-8％丁二醇和78.49-94.495％水。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制取iPS细胞液：从人体的血样中收集外周血细胞，并用iPS干细胞诱导试剂盒进行人工诱导，经过两到三周的诱导后，获得iPS细胞系，并进行细胞培养，培养结束后进行细胞上清液的收集，将所收集的上清液进行浓缩，按1:1-1:20的比例浓缩后，留存备后续使用；
(2)制备基底液：将A组分和B组分加入高速混合器加热到80-85℃，进行高速混合搅拌,高速混合器冷却到40℃以下时投入C组分高速混合搅拌，然后投入D组分进行高速混合搅拌,待高速混合器冷却到室温后投入E组分；
(3)待高速混合器冷却到室温后，在步骤(2)的基底液中加入步骤(1)中的iPS细胞液，进行高速混合搅拌。
10.根据权利要求9所述的一种以iPS细胞培养液为主要成分的护肤品的制备方法，其特征在于：还包括步骤(4)半制品检测合格后灌装，成品检测合格后入冷藏库4-10℃保存。
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