CN110742863B - 一种槲皮素衍生物纳米胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种槲皮素衍生物纳米胶束，包括槲皮素衍生、卵磷脂、牛黄胆酸钠等；所述槲皮素衍生物为2‑羟基‑4‑(3,5,7‑三羟基‑4‑氧代‑4H‑苯并吡喃‑2‑基)苯基十二烷酸酯。本发明制备的槲皮素衍生物纳米胶束，有较好的包封率和载药量，生物利用度较高。

Description

一种槲皮素衍生物纳米胶束及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物制剂，属于医药领域。
背景技术
槲皮素是广泛分布于自然界的一种黄酮类化合物，大量存在于常见的植物和蔬菜水果中，如浆果、茶、苹果、洋葱等。槲皮素不但在心血管疾病、防癌和抗癌等方面具有独特的作用，同时，还能改善肿瘤微环境，包括降低肿瘤细胞的多药耐药性和竞争性抑制相关代谢酶。因此，已成为国内外学者的一个研究热点。
中国专利申请CN110128385A中，公开了制备一种槲皮素衍生物的方法——2-羟基-4-(3,5,7-三羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基十二烷酸酯，得到了高纯度的槲皮素衍生物，其对天然槲皮素进行化学修饰，通过在4’-OH羟基位发生取代反应，有利于提高其脂溶性，改善生物利用度，该方法原理简单，产品收率高。
目前，还没有将该产品制备制剂的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种槲皮素衍生物的药物制剂及其制备方法。
具体地，本发明提供了一种槲皮素衍生物纳米胶束，包括如下配比的原料：
A、槲皮素衍生物18～22重量份、卵磷脂90～130重量份、牛黄胆酸钠60～85重量份；
B、四氢呋喃、甲醇，四氢呋喃：甲醇＝2：1V/V；其中，有机溶剂的用量只要能溶解卵磷脂，牛黄胆酸钠和槲皮素衍生物就行，为了避免有机溶剂的残留，尽量少加有机溶剂，体积用量可以但不限于3-5体积份。本发明中，重量份与体积分对比时，可以是g：ml、kg：L，以此类推。
C、水或缓冲液适量，所述缓冲液pH7～8；
所述槲皮素衍生物为2-羟基-4-(3,5,7-三羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基十二烷酸酯。
进一步地，槲皮素衍生物20重量份、卵磷脂120重量份、牛黄胆酸钠80重量份。
缓冲液与水可以互相替代，另外，如果是pH7.4的磷酸盐缓冲液能更好地模拟生理环境，与生理PH较为接近。
其中，A:C＝0.21重量份：3～10体积份，本发明一个具体实施方式中，选择4份。
其中，所述纳米胶束的粒径约为50nm。
根据鉴定，所述纳米胶束的电位为-29.933±3.109mV，所述纳米胶束的PDI为0.274±0.016。PDI是指多分散性指数。
本发明还提供了一种槲皮素衍生物纳米胶束的制备方法，它包括如下内容：
(1)槲皮素衍生物、卵磷脂、四氢呋喃，混合溶解；
(2)牛黄胆酸钠、甲醇，混合溶解；
(3)将(1)和(2)混合均匀，除去溶剂；
(4)与C混合，水化，得到纳米胶束。
其中，所述水化是指，在37℃下，充分混合至形成纳米胶束。
所述混合的方式可以选自涡旋、摇晃或震荡。
水化的目的：形成胶束粒子。
本发明实验中发现，多种因素和条件对槲皮素衍生物纳米胶束的质量有显著影响，例如：
1.胆盐的种类
目前常用的胆盐为牛黄胆酸钠和脱氧胆酸钠，在磷脂与胆盐的最佳配比下，两种胆盐均可以制成粒径较小的胶束，但载药牛黄胆酸钠胶束的PDI平均值约0.2左右，明显小于载药脱氧胆酸钠胶束的PDI值(约0.3)，另外脱氧胆酸钠胶束随着载药量的增加，PDI也逐渐增加，粒径分布很不均一。因此，确定牛黄胆酸钠为处方中的胆盐成分。
2.溶剂的种类
分别考察了不同有机溶剂同时对槲皮素、C12-槲皮素共轭物、卵磷脂及牛磺胆酸钠的溶解性，选择溶解能力最好的溶剂，尽量减少有机溶剂的用量，减少溶剂在胶束中的残留。所选溶剂的种类有三氯甲烷、乙腈、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇、水。
在考察不同溶剂对药物槲皮素、C12-槲皮素共轭物溶解性时发现，共轭物的脂溶性强于原药槲皮素，对两者的溶解性最好的溶剂是四氢呋喃，而且四氢呋喃对卵磷脂也具有良好的溶解性。
四氢呋喃对牛黄胆酸钠的溶解性较差，牛黄胆酸钠在甲醇中溶解性好，而甲醇和四氢呋喃又互溶，因此最终选择混合溶剂四氢呋喃/甲醇(2：1，v/v)，四氢呋喃溶解药物(槲皮素、C12-槲皮素共轭物)和卵磷脂，甲醇溶解胆盐。
溶剂的用量不会影响胶束的成型，使用溶剂的目的就是为了溶解固体物质，只要用最少量的溶剂溶解固体物质(卵磷脂，胆盐和药物)即可。
3.磷脂/胆盐比
磷脂/胆盐的比例是能否成功制备混合胶束的关键因素。以粒径和PDI为评价指标，分别考察了不同磷脂/胆盐比(w/w)：1:1，1:2，1:3，2:3，3:2，3:1，2:1对混合胶束的影响。
在选择时发现，该参数是影响混合胶束粒径和PDI的关键因素，磷脂/胆盐比为3:2(w/w)制得的混合胶束溶液澄清近透明，胶束粒子的粒径和PDI都较好。
其余磷脂/胆盐比在制备过程中不是牛奶状的乳液，就是含有泡沫或沉淀物，制得的胶束粒子大小不一，粒径分布较宽，难以形成胶束，所以确定磷脂/胆盐比为3:2(w/w)。
在确定了磷脂/胆盐比为3:2(w/w)后，分别又做了2组磷脂和胆盐不同量对胶束粒径和PDI的影响。结果如下：
组1：磷脂/胆盐比3:2，磷脂量90mg，胆盐量60mg，制备的产品，粒径13.24nm，PDI0.223，Zeta-31.6mV；
组2：磷脂/胆盐比3:2，磷脂量120mg，胆盐量80mg，制备的产品，粒径9.97nm，PDI0.208，Zeta-26.9mV。
通过不通用量的对比，粒径和PDI相差不明显，考虑到载体用量大，包载的药物也会多一些，因此确定使用2组的用量。
4.投药量考察
分别考察投药量为2％，4％，6％，8％，9％，10％时，对混合胶束粒径、PDI的影响。
对于槲皮素胶束，最大投药量为4％，超过该值时，槲皮素析出，无法成膜，因此确定槲皮素胶束的投药量为4％。
对于C12-槲皮素共轭物胶束，当投药量为6％和8％时，胶束粒子的平均粒径均约为50nm左右，PDI小于0.30，当投药量增加到10％时，胶束溶液浑浊现象严重，粒径和PDI值均明显增加，确定C12-槲皮素胶束的投药量为9％。
在做胶束时投药量是试着一点一点的增加的，从10mg逐渐加大投药量，每增加一次投药量，就会检测粒径和PDI，当增加到20mg时粒径和PDI是可以的，但增加到22或25mg时，胶束溶液明显浑浊，PDI大于0.3，所以确定槲皮素衍生物的最大投药量为20mg，即约9％左右。
5.水化体积的影响
水化体积对磷脂/胆盐的粒径和PDI有明显影响，如表1所示，水化体积为4mL和5mL时，制得的胶束粒径最小，且粒径分布较窄，考虑到给药体积尽量少，所以选择水化体积为4mL为最优处方。
表1水化体积对胶束的影响
Figure BDA0002284371450000031
综上所述，本发明纳米胶束的最佳制备处方为：牛黄胆酸钠为处方中的胆盐成分，四氢呋喃：甲醇(2：1，v/v)为溶解水化体积为4mL药物和载体材料的溶剂，磷脂/胆盐比为3:2(w/w)，投药量为9％。
本发明制备的槲皮素衍生物纳米胶束，有较好的包封率和载药量，生物利用度较高。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1.槲皮素标准曲线图
图2.槲皮素专属性(a：槲皮素溶液；b：空白胶束；c：槲皮素胶束)
图3.槲皮素衍生物标准曲线
图4.槲皮素衍生物专属性(a：槲皮素衍生物溶液；b：空白胶束；c：槲皮素衍生物胶束)
图5.胶束外观图(从左往右依次为空白胶束，槲皮素胶束，槲皮素衍生物胶束)
图6.胶束粒径分布图(a：空白胶束；b：槲皮素胶束；c：槲皮素衍生物胶束)
图7.胶束透射电镜图(a：空白胶束；b：槲皮素胶束；c：槲皮素衍生物胶束bar＝200nm)
图8.不同稀释倍数下胶束的稳定性
图9.槲皮素胶束放置稳定性
图10.槲皮素衍生物胶束放置稳定性实验
图11.槲皮素衍生物胶束体外累积释放曲线(n＝4)
图12.槲皮素胶束体外累积释放曲线(n＝3)
图13.槲皮素专属性色谱图(a：空白血浆；b：空白血浆+槲皮素+姜黄素；c：给药大鼠血浆样品)
图14.槲皮素标准曲线图
图15大鼠灌胃给药后药-时曲线图(n＝6)
具体实施方式
以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1.本发明槲皮素衍生物纳米胶束(本发明中亦可称为槲皮素衍生物胶束、前药胶束)的制备
采用薄膜分散法制备混合胶束。称取120mg卵磷脂，80mg牛黄胆酸钠，20mg槲皮素衍生物；
槲皮素衍生物、卵磷脂，溶解于四氢呋喃中；牛黄胆酸钠溶解于甲醇中。其中，四氢呋喃/甲醇＝2：1，V/V；四氢呋喃与甲醇的总体积为3ml。
再将四氢呋喃溶液、甲醇溶液混合均匀，40℃旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜。真空干燥箱放置备用，37℃加入4mL PBS(pH 7.4)水化5min，涡旋10min得本发明纳米胶束。
试验例1本发明纳米胶束体外评价
1.材料
卵磷脂(德国Lipoid GmbH公司)，牛黄胆酸钠(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)，胃蛋白酶与胰酶均购自Solarbio公司，透析袋购自Biotopped公司(分子量12000-14000Da)。槲皮素标准品(>98％)，甲醇，乙酸乙酯均为色谱试剂。
仪器与设备
METTLER PL203型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，QL-861型涡旋仪(其林贝尔仪器制造有限公司)，THZ-100B型恒温气浴摇床(上海一恒科学仪器有限公司)，Agilent 1220Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，旋转蒸发仪(RE2000A，巩义市予华仪器有限公司)，Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)，ZS90型激光散射粒度分析仪(英国Malvern公司)。
2.方法
2.1HPLC方法
2.1.1槲皮素方法
色谱柱：COSMOSIL C18柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：甲醇:0.2％磷酸水溶液(70:30，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：370nm；进样量：10μL。
标准曲线
精密称取槲皮素10.2mg至50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线得200μg/mL储备液，用甲醇稀释得系列不同浓度(160，80，50，20，10，4μg/mL)的标准溶液，于上述色谱条件测定其峰面积，以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程y＝36.575x+1.0799,R2＝0.9992，如图1所示，表明槲皮素在4-200μg/mL范围内线性关系良好。
专属性
分别将槲皮素胶束，空白胶束用甲醇超声破乳10min，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进行HPLC分析。
结果如图2所示，槲皮素保留时间大约为4.2min，峰形良好，不受辅料干扰。
2.1.2槲皮素衍生物方法
色谱柱：COSMOSIL 5C18柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：乙腈:水(90:10，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：255nm；进样量：10μL。
标准曲线
标曲溶液配置同2.1.1项下，标准曲线方程y＝18.9798x-91.7299,R2＝0.9992，如图3所示，表明槲皮素衍生物在4-200μg/mL范围内线性关系良好。
专属性
结果如图4所示，槲皮素衍生物保留时间大约为7.1min，峰形良好，不受辅料干扰。
2.1槲皮素胶束的制备
采用薄膜分散法制备混合胶束。称取120mg卵磷脂，80mg胆盐，10mg槲皮素原料药于100mL圆底烧瓶中，加入3mL四氢呋喃/甲醇混合溶剂(2/1，v/v)，超声溶解。40℃旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜。真空干燥箱放置备用，37℃加入4mL PBS(pH 7.4)水化5min，涡旋10min得载槲皮素磷脂/胆盐混合胶束溶液。
由于槲皮素衍生物在甲醇中不稳定，故将槲皮素衍生物与卵磷脂溶于四氢呋喃，胆盐溶于甲醇，超声溶解后将两者混合均匀，其余同槲皮素胶束的制备。
由图5可知，空白胶束透亮，槲皮素胶束呈黄色且透亮，而槲皮素衍生物具束具有较明显的乳光。
粒径与电位
将胶束溶液稀释五倍后，取1mL于激光粒度仪下测量平均粒径与电位，结果见图6与表2。
载药量与包封率
吸取槲皮素衍生物胶束1mL，用纯化水稀释5倍，取稀释后的溶液1mL，置于纯化水浸泡过的超滤内管(30kDa)中，3500rpm离心15min，取外管溶液进样进行HPLC分析，计算游离槲皮素衍生物记为Wfree，HPLC测定含量。吸取0.2mL胶束用甲醇稀释，超声破乳后，0.22μm滤膜过滤，HPLC测得含量记为Wtotal，脂质材料记为Wlipid。
包封率计算：EE％＝(Wtotal-Wfree/Wtotal)×100％
载药量计算：DL％＝{(Wtotal-Wfree)/[Wlipid+(Wtotal-Wfree)]}×100％
表2.载药胶束与空白胶束一般性质(mean±S.D,n＝3)
Figure BDA0002284371450000071
三种胶束平均粒径均介于10-53nm之间，粒度分布均匀。随着载药量的增加，粒径逐渐增大，PDI逐渐增大，电位约为-30mV，槲皮素胶束的载药量远小于槲皮素衍生物胶束载药量，说明脂溶性的槲皮素衍生物制备成磷脂胆盐混合胶束具有很高的包封率和载药量。
形态观察
取制备的上述三种胶束，用纯化水稀释至0.5mg/mL，将溶液滴在铜网上，然后用磷钨酸染色，多余的液体用滤纸吸去，自然晾干后于透射电镜下观察胶束形态，结果如图7所示。
三种胶束均呈类球形，具有明显的核壳结构。空白胶束与槲皮素胶束粒径稍大于DLS所测得的结果，是因为在拍摄TEM时，样品稀释倍数较大，使得粒径增大，此结果与稀释稳定性相吻合。而槲皮素衍生物胶粒径大约在50nm左右。
稀释稳定性考察
取上述槲皮素与槲皮素衍生物胶束，用纯化水分别稀释5、10、50、100、200倍，以粒径与PDI为考察指标，模拟载药胶束在体内被大量稀释的条件下，保持胶束结构和粒径的能力，结果如图8所示。
槲皮素衍生物胶束在稀释100倍时，仍能保持一定的稳定性，粒径与PDI无显著变化，可能由于槲皮素衍生物胶束与磷脂的良好相容性使得体系较稳定；在200倍时，胶束的粒径与PDI均减小，胶束不稳定。而槲皮素胶束随着稀释倍数的增加，粒径逐渐增大，PDI在5-100倍时变化不明显，在200倍时，显著增加，胶体体系不稳定。
放置稳定性
以胶束的粒径与PDI值为考察指标，将槲皮素胶束与槲皮素衍生物胶束分别放置在4℃与25℃环境下，初步考察胶束的放置稳定性。结果表明槲皮素胶束(图9)在前三天放置在4℃与25℃环境下，粒径与PDI变化无明显差别，在第5天时，肉眼可见胶束溶液中有药物析出，因此粒径增大。
随着时间的增加，槲皮素衍生物胶束(图10)的粒径与PDI分别增大，放置三周时，胶束的PDI值大于0.3，此时胶束体系中不稳定，有部分沉淀。但4℃放置条件下胶束的粒径与PDI值均小于25℃，结果初步表明低温有利于维持槲皮素衍生物胶束的稳定性。
2.3体外释放行为取1mL槲皮素胶束与1mL胰酶/胃蛋白酶液(按照2015版中国药典，两种酶浓度单位均为3000U/g，浓度一致)置于预处理过的透析袋中(12000-14000Da)，将两头扎紧后置于150mL含0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的人工肠液/胃液中(pH1.2)，37℃恒温震荡(100rpm)2h后转入0.5％SDS人工肠液中。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72h取样5mL同时补充等量释放介质。样品经0.22μm滤膜过滤取续滤液进行HPLC检测。
结果如图11、12所示。
前期实验结果表明，槲皮素衍生物在无胰酶/胃蛋白酶的人工肠液/胃液中均无法释放，释放介质中既检测不到槲皮素衍生物，也检测不到槲皮素，表明槲皮素衍生物的酯键在无酶水解的条件下在酸性或碱性条件下均无法断裂。由于胃蛋白酶与胰酶均为大分子，将其置于介质中，无法透过透析袋，为了不影响胶束的稳定性，所以加1mL酶液与胶束溶液混合，测定累积释放。
当透析袋内加入胰酶/胃蛋白酶时，释放介质中检测不到槲皮素衍生物，药物以槲皮素的形式释放在介质中。槲皮素衍生物胶束在两种释放介质中释放缓慢，无明显突释现象。在6h之前，槲皮素衍生物胶束释放较槲皮素胶束快，8h后槲皮素衍生物胶束迅速释放，24h之后缓慢释放，释放完全。而在人工肠液中释放较缓慢，释放结束后，透析袋内胶束溶液稳定，无沉淀析出，经测定药物仍以槲皮素衍生物的形式被包裹在胶束中，表明胃蛋白酶催化酯键断裂较胰酶快，可能是因为酯键的pH敏感型，在酸性条件下容易被胃蛋白酶水解释放出来；相反，槲皮素衍生物胶束在人工胃液中释放缓慢，则保证了槲皮素衍生物胶束在肠道中保持稳定的结合物形式，有利于增加口服生物利用度
槲皮素胶束在两种释放介质中均缓慢释放，无明显突释现象，在人工肠液中释放速率较人工胃液中快，但在人工胃液中释放不完全。
试验例2本发明纳米胶束体内评价(生物利用度研究)
槲皮素原料药(西安天一生物技术股份有限公司)，槲皮素标准品(南京景竹生物科技有限公司，HPLC≥98％，JZ17092605)，β-葡萄糖醛酸酶与硫酸酯酶均购自Sigma-Aldrich公司，羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，20120928)，甲醇，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，乙酸乙酯(色谱纯，天津大茂)，所用水为纯化水(实验室自制)。
METTLER PL203型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，QL-861型涡旋仪(其林贝尔仪器制造有限公司)，Agilent1220Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，LEGNED MICRO17高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)，CT15RE台式微量冷冻离心机(日本日立公司)，雌性SD大鼠(SCXK(NING)2015-0002)。
1.色谱条件
色谱柱：COSMOSIL 5C18柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：0.4％磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0-5min，60％A；5-11min 30％A；11-13min，60％A)；流速：1.0mL/min；检测波长：370nm；进样量：20μL。
1.1槲皮素对照品溶液配置
精密称取槲皮素10.2mg至50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线得200μg/mL储备液，用甲醇稀释得系列不同浓度(200，100，50，10，2，0.4，0.1μg/mL)的标准溶液
1.2姜黄素(内标)配置
精密称取姜黄素标准品10mg，加入甲醇定容至10mL得到1000μg/mL的母液，稀释得到10μg/mL的姜黄素(内标)储备液。
1.3酶工作液的配置
取醋酸铵3.544g，加入纯化水100mL，用醋酸调节pH至5.0。精密称取硫酸酯酶0.65g，于5mL容量瓶中，用上述醋酸铵溶液定容；吸取葡萄糖醛酸酶(90kU/mL)100μL，加入上述硫酸酯酶工作液1.7mL，得到500U/mL与50kU/mL的硫酸酯酶与葡萄糖醛酸酶工作液。
1.4血浆样品的处理
精密吸取血浆样品100μL，加入20μL含维生素C 0.2mg/mL的醋酸溶液(含醋酸0.5mol/L)调节血浆pH约为5.0，加入20μL酶工作液(硫酸酯酶10U，葡萄糖醛酸酶100U)，涡旋2min，于37℃震荡孵育30min取出，加入甲醇与内标各20μL，乙酸乙酯400μL，混合后震荡5min，12000rpm离心(10min，4℃)，吸取上清液吹干，加入100μL甲醇溶解残渣，12000rpm离心(10min，4℃)，吸取上清液于HPLC检测。
1.5专属性考察
结果如图13所示，槲皮素保留时间在5.7min左右，姜黄素(内标)保留时间约在9.8min左右，空白血浆对上述两种药物出峰时间没有影响，专属性良好。
1.6标准曲线绘制
吸取1.1项下的槲皮素标品20μL，加入20μL内标，20μL醋酸铵与20μL维生素C溶液，空白血浆100μL，使槲皮素在血浆中的浓度为0.02，0.1，0.4，2，10，20，40μg/mL，其余操作同1.4项下操作。以槲皮素峰面积与内标物峰面积的比值A1/A2与槲皮素浓度C进行线性回归，得血浆样品标准曲线。
槲皮素在0.02-40μg/mL之间浓度与峰面积之比线性关系良好，血浆样品标准曲线为y＝0.599019x+0.256395R2＝0.999529，如图14所示。检测限为0.007μg/mL(信噪比为3)，定量限为0.01μg/mL(信噪比为10)。
1.7精密度与准确度
取20μL高中低三个不同的槲皮素对照品，加入100μL空白血浆，按照1.6项下方法处理，得到浓度为0.003、4、35μg/mL的质控样品，各五份，测定槲皮素浓度，在日内连续测定三次，连续测定三天，根据当日工作曲线，测定QC浓度，计算RSD，得精密度；计算所得QC浓度与已知样品配制浓度比值的百分数，得方法回收率(准确度)。
表3精密度与准确度
Figure BDA0002284371450000101
1.8提取回收率
按1.6项下处理质控样品，每一浓度5样本进样分析，得相应的峰面积A1；另取空白血浆，按照1.6项下处理，再加入质控样品与内标，进样分析得到峰面积A2；以A1/A2计算槲皮素在血浆中的提取回收率。
表4提取回收率结果(n＝5)
Figure BDA0002284371450000102
1.9稳定性
取1.6项下血浆样品，室温放置4h，按照1.4方法处理后进行HPLC检测，计算RSD值，高中低三个浓度的RSD分别为9.27％、7.00％、8.04。另取处理后的血浆样品处理后室温放置12h，计算RSD，高中低分别为8.84％、4.40％、6.76％；取1.6项下血浆样品，反复冻融三次，计算RSD，高中低分别为7.49％、4.88％、5.73％。
2体内药动学研究
给药方式，分别将18只雌性SD大鼠(250±10g)随机分为三组每组6只，给药前进食12h，自由饮水。灌胃给予混悬液(混悬于0.4％CMC-Na)、槲皮素胶束、槲皮素衍生物胶束，给药剂量为40mg/kg(相当于槲皮素)，分别于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，24，48，72小时自大鼠眼眶静脉丛取血0.3mL至肝素化离心管中，5000rpm离心5min得血浆样品，按照1.4项下处理，以当日标准曲线计算各点的血药浓度-时间曲线，采用DAS2.0计算药动学参数。利用SPSS21.0对所得参数进行方差分析。
结果如图15、表5所示。
表5大鼠灌胃槲皮素混悬液、槲皮素胶束以及槲皮素衍生物胶束药动学参数(mean±S.D,n＝6)
Figure BDA0002284371450000111
*与混悬液比较，P＜0.01(one-way ANOVA)
#与槲皮素胶束比较，P＜0.01
大量研究结果表明，槲皮素在血浆中主要以ⅱ相结合形式存在，且90％为葡萄糖苷酸与硫酸结合物。固本研究通过在血浆中加入葡萄糖醛酸酶与硫酸酯酶是结合物水解为槲皮素，以测定血浆中的槲皮素浓度。
实验结果显示，制剂组中槲皮素衍生物胶束组在72h仍可以检测到槲皮素血药浓度(未显示，见实验记录数据)，而槲皮素胶束在能在24h检测到，混悬液24h时检测不到药物浓度，表明混悬液在体内消除较槲皮素、槲皮素衍生物胶束快。消除速度：混悬液＞槲皮素胶束＞槲皮素衍生物胶束，表明槲皮素衍生物胶束能在较长时间缓慢持续释放槲皮素。达峰时间分别为6、0.333、0.750h，表明将槲皮素(槲皮素衍生物)制备成磷脂胆盐胶束后，能显著缩短槲皮素的达峰时间。混悬液、槲皮素胶束、槲皮素衍生物胶束AUC0-t分别为8.306、72.79、14.384μg/mL，制剂组AUC分别是混悬液的13.38、19.04倍，表明将槲皮素包裹在磷脂胆盐胶束中，能够促进药物吸收，而将槲皮素以槲皮素衍生物的形式包裹在磷脂胆盐中，槲皮素衍生物胶束AUC是槲皮素胶束的1.42倍，具有统计学意义，表明槲皮素衍生物胶束的口服生物利用度高于槲皮素胶束。

Claims (4)

1.一种槲皮素衍生物纳米胶束，其特征在于：包括以下原料：
A、槲皮素衍生物20mg、卵磷脂120mg、牛磺胆酸钠80mg；
B、四氢呋喃、甲醇，四氢呋喃：甲醇＝2：1V/V；四氢呋喃与甲醇的总体积为3mL；
C、4mL的pH7.4的PBS缓冲液；
所述槲皮素衍生物为2-羟基-4-(3,5,7-三羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基十二
烷酸酯。
2.一种如权利要求1所述的槲皮素衍生物纳米胶束的制备方法，其特征在于：它包括如下内容：
(1)槲皮素衍生物、卵磷脂、四氢呋喃，混合溶解；
(2)牛磺胆酸钠、甲醇，混合溶解；
(3)将(1)和(2)混合均匀，除去溶剂；
(4)与C混合，水化，得到纳米胶束。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述水化是指，在37℃下，充分混合至形成纳米胶束。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：混合的方式可以选自涡旋、摇晃或震荡。
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