CN110724699B - 一种包载凋亡基因的pcadk复合微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，具体步骤包括：（1）称取200 mg PCADK溶于2 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取20µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5µg/µL；量取60 mL，浓度为1%PVA水溶液作为外水相备用；（2）在13500 rpm/min的均质条件下，将20µL的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌2 min，得到乳液；（3）以1500 rpm/min速率不断搅拌1%PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，‑20℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。本发明利用PCADK包载具有治疗作用的质粒，实现了基因的可控递送，提高了基因转染效率。
Description
技术领域
本发明属于药用材料技术领域，具体涉及一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法。
背景技术
随着科技的进步，从分子层面治疗疾病的方式——基因治疗，越来越受到科研人员的关注，其原理是将有治疗效果的核酸分子（DNA 或 siRNA 等）导入靶细胞内，利用其特异选择性，调控基因表达，进而发挥治疗作用。基因治疗的关键是基因必须有效地靶向目标细胞才能高效的发挥作用，但游离的核酸分子存在诸多缺陷限制其广泛应用，包括体内稳定性差，易被快速清除或被核酸酶降解以及其负电性阻碍与细胞膜相互作用，不能有效地到达靶细胞，导致转染效率低。因此，基因治疗的首要挑战就是发展安全高效的基因载体来保护核酸分子，提高体内循环稳定性，促进核酸分子被靶标细胞摄取，实现高效转染，发挥基因治疗的作用。
基因递送载体系统主要分为两类：病毒性载体和非病毒性载体。病毒性载体如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，已经逐步利用多种专门的分子学机制来克服细胞内屏障，实现高效的基因转染。然而由于病毒性载体具有一些固有缺点，包括安全性问题、非特异性、价格昂贵，限制了其广泛的应用。而非病毒性载体由于其低免疫原性、高包载能力以及能大规模生产的潜力，被广泛关注。相比较于病毒性载体，非病毒载体虽易被功能化，但难以有效地克服基因递送过程中的各种屏障，基因转染效率低。
所以，怎样利用非病毒载体包载基因，实现基因的可控递送，提高基因转染效率是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的就在于提供一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，制备得到的PCADK复合微球实现了基因的可控递送，提高了基因转染效率。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）称取100~400 mg PCADK溶于1~4 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取10~50 µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取40~100 mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在10000-15000 rpm/min的均质条件下，将包含凋亡基因的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌1~5 min，得到乳液；
（3）以1000~5000 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。
进一步地，所述PCADK按如下方法制备得到：
（1）称取1,4-环己烷二甲醇5~8 g，搅拌溶解在60~100 mL苯中形成苯溶液，升温至90~100 ℃；
（2）将20~30 mg对甲苯磺酸溶解在1~2 mL乙酸乙酯中后加入到上述苯溶液中，升温至100~110 ℃，保持温度稳定4~8 min，蒸除乙酸乙酯；
（3）降温至90~100 ℃，加入5.0~8.0 mL 2,2-二甲氧基丙烷反应，后每隔1 h补加2.5 mL 2,2-二甲氧基丙烷及适量的苯，使反应体系的溶液体积保持不变，直到反应结束；
（4）然后在氮气保护条件下，搅拌反应24~72 h，再升温至105 ℃，蒸除部分苯，降温至60 ℃，然后加入0.45 mL三乙胺，搅拌0.5 h，终止反应；冷却至室温，将反应液加入到400 mL4℃预冷的正己烷中，搅拌析出淡黄色固体，离心干燥即得PCADK。
这里采用4℃预冷的正己烷，主要是降低PCADK在正己烷中的溶解度，利于PCADK析出。
进一步地，所述凋亡基因为BBC3、Bax或Noxa。
具体地，用双酶切凋亡基因和质粒，使得它们具有相同的黏性末端，然后利用DNA连接酶将凋亡基因和质粒连接在一起形成包含凋亡基因的质粒溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用可降解的非病毒载体PCADK依靠物理作用包载凋亡基因的质粒，实现了基因的可控递送，并利用PCADK的酸敏感性，实现在肿瘤组织周围的定点释放，提高了基因转染效率，从而提高了对肿瘤生长的抑制率。
附图说明
图1-制备得到的聚缩酮PCADK。
图2-PCADK的紫外全波长扫描曲线。
图3-PCADK的红外表征图谱。
图4-PCADK的1H NMR图谱。
图5-实施例1制备得到的BBC3@PCADK复合微球的SEM扫描电镜图。
图6-PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球的Zeta电位表征图。
图7-PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球的DLS表征图。
图8-PCADK空白微球的细胞毒性检测实验结果。
图9-实施例1制备得到的BBC3@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。
图10-实施例2制备得到的Bax@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。
图11-实施例3制备得到的Noxa@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
制备聚缩酮PCADK
聚缩酮PCADK的合成路线为：
具体制备方法如下：
称取1,4-环己烷二甲醇6.3431 g，搅拌溶解在78 mL苯中，升温至92 ℃；再将21.4mg对甲苯磺酸溶解在1.5 mL乙酸乙酯后加入到上述苯溶液中，升温至105 ℃，保持温度稳定5 min，蒸除乙酸乙酯；然后降温至92 ℃，加入5.4 mL 2,2-二甲氧基丙烷反应，后每隔1h补加2.5 mL 2,2-二甲氧基丙烷及适量的苯，使反应体系的溶液体积保持不变；然后在氮气保护条件下，搅拌反应24~72 h，再升温至105 ℃，蒸除部分溶剂，降温至60 ℃，然后加入0.45 mL三乙胺，搅拌0.5 h，终止反应；冷却至室温，将反应液加入到400 mL4℃预冷的正己烷中，搅拌析出淡黄色固体，离心干燥即得PCADK，离心后得到的PCADK如图1所示。
所得到的的PCADK的紫外全波长扫描曲线、红外表征图谱和1H NMR图谱分别如图2、图3和图4所示，由图2可知，PCADK在可见光以及红外光区域没有吸收峰，只有在200-400nm波长范围内存在紫外吸收；由图3可知，3440 cm-1 为-OH的伸缩振动峰，2800-3000cm-1和1450 cm-1 为亚甲基和甲基的碳氢伸缩振动峰以及亚甲基的变形振动峰，1044 cm-1为缩酮键-C-O-C-的吸收峰；由图4可知，δ=3.19-3.28 ppm 为缩酮键氧原子相连的-CH2-对应的峰，δ=1.82 ppm 为环己烷上-CH-对应的峰，δ=0.93-1.58为环己烷上-CH2-对应的峰，δ=1.32为缩酮键碳原子连接的-CH3对应的峰。
实施例1
制备包载凋亡基因BBC3@PCADK复合微球
（1）称取200 mg PCADK溶于2 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取20 µL包含基因BBC3的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取60mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在13500 rpm/min的均质条件下，将20 µL的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌2 min，得到乳液；
（3）以1500 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20 ℃保存，即得到所述包载凋亡基因的BBC3@PCADK复合微球。
将本实施例得到的BBC3@PCADK复合微球的SEM扫描电镜图如图5所示，由图可知：复合微球表面凹凸不平。
实施例2
制备包载凋亡基因Bax@PCADK复合微球
（1）称取250 mg PCADK溶于3 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取25 µL包含基因Bax的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取80mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在14500 rpm/min的均质条件下，将25 µL的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌3 min，得到乳液；
（3）以2500 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20 ℃保存，即得到所述包载凋亡基因的Bax@PCADK复合微球。
实施例3
制备包载凋亡基因Noxa@PCADK复合微球
（1）称取100 mg PCADK溶于2 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取20 µL包含基因Noxa的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取60mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在13500 rpm/min的均质条件下，将20 µL的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌2 min，得到乳液；
（3）以3000 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20 ℃保存，即得到所述包载凋亡基因的Noxa@PCADK复合微球。
PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球的Zeta电位表征图和DLS表征图分别如图6和图7所示，由图6可知，空白微球、BBC3@PCADK复合微球、Bax@PCADK复合微球和Noxa@PCADK复合微球的Zeta电位均在0 mV左右，证明制备得到复合微球是依靠物理作用包载含凋亡基因的质粒形成的；由图7可知，制备的复合微球水合动力学半径在2~3μm左右。
细胞毒性检测实验
使用MCF-7细胞分别检测PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球对肿瘤生长的抑制效果。
具体方法为：复苏冻存的MCF-7细胞，在42℃水浴条件下，快速晃动细胞冻存管，使之尽快融化，然后加入到含有PBS的离心管中，离心速率为800 rpm/min，离心5min，弃上清，加入含有10% FBS的高糖DMEM培养基重悬，将细胞重悬液加入到培养瓶中，在37℃，5% CO2的恒温细胞培养箱中培养细胞，待到细胞融合度到70~80%时，消化细胞，然后细胞计数，按照每孔细胞5000 cells/100µL种到96孔板中，恒温培养12 h左右，使细胞贴壁。将PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球按照下列浓度：12.5µg/mL、25µg/mL、50µg/mL、100µg/mL、200 µg/mL加入到预先安排好的96孔板中，每孔体积100 µL。
共做两组，一组与细胞共培养48 h，另一组与细胞共培养72 h。然后每孔加入10 µL MTT溶液，37℃孵育4 h，再小心吸取上清，每孔加入100 µL DMSO溶解甲臜，震荡10 min，酶标仪读取490 nm的吸光光度值，最后根据对照，计算每组不同浓度的PCADK空白微球和复合微球对肿瘤细胞的抑制率。
PCADK空白微球的细胞毒性检测实验结果如图8所示，从图中可以看出，随着空白微球浓度的升高，PCADK空白微球毒性逐渐增高，当浓度为200 μg/ml，与细胞共培养48h时，细胞存活率仍然高达70%左右，证明制备得到的PCADK的毒性较低。
实施例1制备得到的BBC3@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果如图9所示，从图中可以看出，随着BBC3@PCADK复合微球浓度的升高和与细胞培养的时间越长，BBC3@PCADK复合微球对细胞的抑制率逐渐增大，当浓度为200 μg/ml，与细胞在72 h后，细胞大部分死亡，存活率大概只有40%左右，说明BBC3@PCADK复合微球对MCF-7细胞的生长具有良好的抑制作用。
实施例2制备得到的Bax@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果如图10所示，从图中可以看出，随着Bax@PCADK复合微球浓度的升高和与细胞培养的时间越长，BBC3@PCADK复合微球对细胞的抑制率逐渐增大，当浓度为200 μg/ml，与细胞在72 h后，细胞大部分死亡，存活率大概只有40%左右，说明Bax@PCADK复合微球对MCF-7细胞的生长具有良好的抑制作用。
实施例3制备得到的Noxa@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果如图11所示，从图中可以看出，随着Noxa@PCADK复合微球浓度的升高和与细胞培养的时间越长，BBC3@PCADK复合微球对细胞的抑制率逐渐增大，当浓度为200 μg/ml，与细胞在72 h后，细胞大部分死亡，存活率大概只有40%左右，说明Noxa@PCADK复合微球对MCF-7细胞的生长具有良好的抑制作用。
由此可见，PCADK通过物理作用包载凋亡基因形成的BBC3@PCADK复合微球、Bax@PCADK复合微球和Noxa@PCADK复合微球对MCF-7细胞的生长具有良好的抑制作用。
最后需要说明的是，本发明的上述实施例仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）称取100~400 mg PCADK溶于1~4 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取10~50 µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取40~100 mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在10000-15000 rpm/min的均质条件下，将包含凋亡基因的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌1~5 min，得到乳液；所述凋亡基因为BBC3、Bax或Noxa；
（3）以1000~5000 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20 ℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。
2.根据权利要求1所述的一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，所述PCADK按如下方法制备得到：
（1）称取1,4-环己烷二甲醇5~8 g，搅拌溶解在60~100 mL苯中形成苯溶液，升温至90~100 ℃；
（2）将20~30 mg对甲苯磺酸溶解在1~2 mL乙酸乙酯中后加入到上述苯溶液中，升温至100~110 ℃，保持温度稳定4~8 min，蒸除乙酸乙酯；
（3）降温至90~100 ℃，加入5.0~8.0 mL 2,2-二甲氧基丙烷反应，后每隔1 h补加2.5mL 2,2-二甲氧基丙烷及适量的苯，使反应体系的溶液体积保持不变，直到反应结束；
（4）然后在氮气保护条件下，搅拌反应24~72 h，再升温至105 ℃，蒸除部分苯，降温至60 ℃，然后加入0.45 mL三乙胺，搅拌0.5 h，终止反应；冷却至室温，将反应液加入到400mL冷的正己烷中，搅拌析出淡黄色固体，离心干燥即得PCADK。
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