CN107118340B - 基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于δ‑戊内酯的聚合物，其结构由红外、核磁和凝胶渗透色谱表征。本发明还公开了基于δ‑戊内酯的聚合物的制备方法及应用，通过Click反应，开环聚合反应制备，反应简单方便、产率高。本发明的基于δ‑戊内酯的聚合物在一定条件下可降解，与核酸作用形成易于细胞摄取的纳米颗粒；绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)表达实验证明了这类聚合物可以作为可降解的非病毒基因载体，且具有较高的转染效率；聚合物和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控。

Description

基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因载体技术领域，具体涉及一种可作为非病毒基因载体的基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用。
背景技术
基因治疗是将外源正常基因导入病体细胞以替换或修补缺陷的基因，从而达到治疗相应疾病的目的。在细胞膜上有很多带有负电荷的糖蛋白和糖脂化合物，核酸的骨架结构中的磷酸基团也带有负电荷，并且核酸本身具有较大的体积，因此裸露的核酸难以被细胞吞噬。为了解决裸露核酸难以被细胞摄取的难题，科研工作者们发展了基因载体。基因载体可以有效的将细胞外的核酸带入细胞内，并可以一定程度上保护核酸在细胞核不被核酸酶水解。另外，基因载体在运输核酸进入细胞后，也可以将核酸释放，而被释放的核酸又可以进入细胞核进行相应的蛋白表达，最终达到基因治疗的目的。
基因载体一般可分为两类，一类是病毒型载体，一类是非病毒载体。通常，病毒型载体的转染效率很高，并且可进行迅速表达，因而病毒型载体在临床试验中被广泛使用。但是，病毒型载体也有其固有的缺陷，如：潜在的免疫原性和致瘤性；携带的核酸尺寸有限(通常为2-3kb)；制备和存储困难复杂等。而非病毒型载体不仅仅可以完全避免上述缺陷，且其本身还有很多其他优点，如结构可调、可大规模生产和具有靶标性。这些特性更利于非病毒载体在基因治疗中的应用。但是非病毒基因载体也有一些问题需要解决，就是转染效率相对病毒基因载体低、毒性相对较大。因此，发展高效低毒的非病毒基因载体是非常重要的。
目前，非病毒类载体有很多种，包括阳离子化合物，阳离子脂质体，阳离子聚合物，功能纳米粒子，无机配合物以及量子点等。在阳离子聚合物中，聚酯类由于其酯键可水解，容易被降解，所以应用到临床的可能性更大。所以，基于聚酯的非病毒基因载体的设计与合成对可降解的非病毒基因载体具有重要意义。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，α,β-不饱和δ-戊内酯上连接不同的侧链，按照不同比例开环聚合得到不同聚合物，它们可以有效凝聚DNA，并与DNA形成纳米颗粒通过内吞作用进入细胞中，利于跨膜，采用该聚合物形成的基因载体具有较高的转染效率，具有较低的细胞毒性。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种制备基于δ-戊内酯的聚合物的方法，在α,β-不饱和δ-戊内酯的基础上，连接不同的侧链，按照不同比例开环聚合得到不同聚合物，制备方法简单方便，产率高；制得的聚合物可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，利于细胞摄取。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于δ-戊内酯的聚合物，所述基于δ-戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：
[化学式1]
其中，R2是选自含硫的直链烷基中的任意一种，n大于或等于1，m大或等于0。
优选的是，其中，R2是选自含有硫的C4、C8、C12和C16直链烷基中的一种。
优选的是，其中，R2为 和中的一种。
优选的是，其中，所述聚合物为嵌段共聚物，无规共聚物和均聚物中的一种。
本发明的目的还可以进一步由基于δ-戊内酯的聚合物的制备方法来实现，所述方法包括以下步骤：
步骤一、通过click反应制备下面显示的[化学式2]与[化学式3]的单体化合物；
步骤二、[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物进行开环聚合反应制备[化学式1]所示的基于δ-戊内酯的聚合物；
其中，
[化学式2]
[化学式3]
其中，a为2，6，10或14。
优选的是，其中，所述步骤一中，具体包括以下步骤：
S1.按比例称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入溶剂，在氩气氛围下反应，反应后减压浓缩干，减压蒸馏，得到化合物[化学式2]单体化合物；
S2.按比例分别称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇，催化剂，加入溶剂溶解，在氩气氛围下反应8-10h，反应结束后，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到[化学式3]单体化合物。
优选的是，其中，所述步骤二中，基于δ-戊内酯的聚合物为嵌段聚合物，无规共聚物或均聚物，其中，嵌段聚合物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，当转化率为80％以上时，再按比例加入[化学式3]单体化合物，形成嵌段聚合物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为20:20-30:1；无规共聚物的合成步骤具体为：分别称取[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成无规共聚物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为10:10:1；均聚物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成均聚物，其中，[化学式2]单体化合物与引发剂的摩尔比为40:1。
优选的是，其中，所述S2步骤中，环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩尔比为1:1，催化剂为三丁基膦，溶剂为二氯甲烷。
优选的是，其中，引发剂为卞醇，催化剂为1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯。
本发明的目的还可以进一步由基于δ-戊内酯的聚合物在非病毒基因载体中的应用来实现。
本发明至少包括以下有益效果：
1、提供不同的基于δ-戊内酯的聚合物，可以有效凝聚DNA，并利用静电作用与DNA形成合适大小的纳米颗粒通过内吞作用进入细胞中；
2、以基于δ-戊内酯的聚合物作为基因载体细胞毒性较低，表现出很好的转染效果，有些甚至超过商品化的PEI 25k，这为聚酯类作为基因载体的进一步研究做了很好的铺垫；
3、基于δ-戊内酯的聚合物的制备方法简单、成熟、易于掌控；
4、基于δ-戊内酯的聚合物与细胞具有好的相容性，具有作为基因治疗中非病毒载体的潜力；
5、基于δ-戊内酯的聚合物能全部包裹DNA，可作为DNA跨膜、转运的良好载体；
6、基于δ-戊内酯的聚合物与DNA凝聚后的粒径，与DNA形成100-250nm大小的颗粒，这对成功穿入细胞膜实现基因转染具有重要的意义；
7、基于δ-戊内酯的聚合物在一定条件下可以降解，这为可降解的聚合物作为非病毒基因载体的研究提供了一个平台。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图2为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；
图3为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；
图4为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物在A549、Hek293T、HeLa与HepG2细胞中细胞毒性图；
图5为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；
图6为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图7为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物在A549、Hek293T、HeLa与HepG2细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图；
图8为本发明的基于δ-戊内酯的聚合物用HCl处理降解前后的分子量测定图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
一种基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，所述基于δ-戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：
[化学式1]
其中，R2为和中的一种，n大于或等于1，m大或等于0。n和m是根据两部分的比例的变化而变化的。
[化学式1]聚合物具体合成路线为：
其中，[化学式2]化合物为合成路线中的化合物1，[化学式3]化合物中，a为2，6，10或14分别对应的合成路线中的化合物为2，3，4，5；
得到的基于δ-戊内酯的聚合物的数均分子质量处于2,000-10,000范围内，结构末端是羟基。
具体合成步骤如下：
步骤一、按摩尔比为1:1称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入四氢呋喃溶剂，在氩气氛围下反应。反应后减压浓缩干，用微量蒸馏仪减压蒸馏，得到化合物1；
步骤二、按比例分别称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇、催化剂，加入溶剂溶解，在氩气氛围下反应8-10h，反应结束后，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到化合物2-5，其中，环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩尔比为1:1，催化剂为三丁基膦，溶剂为二氯甲烷，硅胶柱层析所用洗脱剂分别为石油醚/乙酸乙酯比例20/1、6/1、15/1、6/1；
步骤三、称取化合物1，加入一定量的引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，待转化率达到80％以上后，再分别按比例加入化合物2-5，形成基于δ-戊内酯的嵌段聚合物B1-B6，对于B1-B4，加入的两种单体与引发剂的比例(化合物1/化合物2-5/引发剂)为20:20:1，对于B5-B6，加入的两种单体与引发剂的比例(化合物1/化合物3-4/引发剂)为20:30:1，其中，催化剂用量为单体摩尔量的1/20；
步骤四、分别称取化合物1和不同比例的化合物2-5，加入一定量的引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成基于δ-戊内酯的无规共聚物C1-C4，加入的两种单体与引发剂的比例(化合物1/化合物2-5/引发剂)为10:10:1；
骤五：仅有化合物1，加入一定量引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成基于δ-戊内酯的均聚物P1，单体与引发剂的比例为40:1。
其中，在所述步骤三、四和五中，开环聚合反应所用引发剂卞醇，所用催化剂为1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)，催化剂用量为单体摩尔量的1/20；
其中，在所述步骤三、四和五中，开环聚合反应结束后，用乙酸/二氯甲烷溶液进行淬灭，搅拌5min；
其中，在所述步骤三、四和五中，开环聚合反应结束后，得到的聚合物用乙醇进行渗析，将产物溶于10mL乙醇中，置于1000Da透析袋中，用乙醇透析1天。得到无色油状液体聚酯。
其中化合物表征如下：
化合物1：FT-IR(KBr,cm-1):2942(s),2858(m),2816(m),2765(s),1750(vs),1461(m),1258(m),1246(m),1152(s),1077(m),964(m).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.33(m,2H),3.08(m,1H),2.72(m,2H),2.59(m,2H),2.40(m,2H),2.26(m,6H),1.93(m,2H),1.80(m,2H),1.71(m,2H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ173.01,77.44,77.13,76.81,68.74,58.27,45.21,40.46,33.77,30.86,27.42,24.21,22.01.ESI-MS:m/z C11H22NO2S[M+H]+,calcd.231.13,found232.13.产率84％。
化合物2：产率58％.FT-IR(KBr,cm-1):3329(w),2957(m),2930(m),2872(w),1732(s),1452(w),1246(m),1157(m).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.34(m,2H),3.09(m,1H),2.77-2.63(m,2H),2.56(t,J＝7.3Hz,2H),2.27(m,1H),1.92(m,2H),1.70(m,1H),1.57(m,2H),1.41(m,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ173.12,68.83,40.55,33.78,32.82,31.75,24.26,22.06,21.93,13.66.ESI-MS:m/z C10H19O2S[M+H]+,calcd.202.10,found 203.10.
化合物3：产率78％.FT-IR(KBr,cm-1):3340(w),2957(m),2955(m),2926(m),2852(w),1737(m),1246(m),1149(w).1HNMR(CDCl3,400MHz):δ4.39-4.27(m,2H),3.08(t,J＝8.7Hz,1H),2.71(m,2H),2.55(t,J＝7.5Hz,2H),2.27(m,1H),1.93(m,2H),1.70(m,1H),1.58(m,2H),1.36(m,2H),1.28(m,8H),0.88(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ173.11,68.83,40.56,33.81,33.18,31.80,29.69,29.18,28.85,24.27,22.64,22.07,14.09.ESI-MS:m/z C14H27O2S[M+H]+,calcd.258.17,found 259.18.
化合物4：产率82％.FT-IR(KBr,cm-1):3308(w),2957(m),2916(m),2850(w),1741(w),1666(w),1361(w),1149(w),1078(w).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.34(m,2H),3.09(m,1H),2.76-2.62(m,2H),2.55(t,J＝7.3Hz,2H),2.27(m,1H),2.03-1.81(m,2H),1.77-1.61(m,1H),1.58(m,2H),1.41-1.30(m,2H),1.26(m,14H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).13C-NMR(CDCl3,100MHz):δ173.12,68.83,40.57,33.82,33.19,31.92,29.71,29.65,29.63,29.60,29.53,29.23,28.86,24.28,22.69,22.08,14.12.ESI-MS:m/z C18H35O2S[M+H]+,calcd.314.23,found 315.22.
化合物5：产率84％.FT-IR(KBr,cm-1):3333(w),2955(w),2920(s),2848(m),1709(m),1467(w),1159(w),1062(w),960(w).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.33(m,2H),3.08(m,1H),2.70(m,2H),2.54(t,J＝7.4Hz,2H),2.27(m,1H),1.98(m,J＝7.4Hz,2H),1.69(m,1H),1.58(m,2H),1.37(m,2H),1.25(m,24H),0.88(t,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ173.11,68.83,40.57,33.82,33.19,31.93,29.70,29.69,29.68,29.66,29.61,29.54,29.37,29.24,28.87,24.29,22.70,22.09,14.13.ESI-MS:m/z C22H43O2S[M+H]+,calcd.370.29,found 371.29.
<实例2>
分别配制不同浓度聚合物(B1-B6、C1-C4、P1)的溶液，将不同浓度的聚合物的溶液和PGL-3质粒DNA(9μg/mL)置于37℃水浴中，作用1h，进行DNA琼脂糖凝胶阻滞实验得到不同浓度的聚合物(B1-B6、C1-C4、P1)对PGL-3DNA的凝胶阻滞结果。
图1a～1k分别是本发明聚合物B1-B6、C1-C4、P1的PGL-3DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验结果；其中，图1a为本发明实施例1中聚合物B1对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1b为本发明实施例1中聚合物B2对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1c为本发明实施例1中聚合物B3对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1d为本发明实施例1中聚合物B4对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1e为本发明实施例1中聚合物B5对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1f为本发明实施例1中聚合物B6对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1g为本发明实施例1中聚合物C1对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1h为本发明实施例1中聚合物C2对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1i为本发明实施例1中聚合物C3对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1j为本发明实施例1中聚合物C4对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1k为本发明实施例1中聚合物P1对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图1a～1k表明聚合物B1-B6、C1-C4、P1均可在较低质量比下完全阻滞DNA在琼脂糖中迁移；聚合物B1-B6、C1-C4、P1的最低阻滞的聚合物/DNA质量比分别为：4、4、3、5、5、4、6、5、5、5和2。
从图1可以得出，本发明制备的基于δ-戊内酯的聚合物在水中可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，可以作为非病毒基因载体。
<实例3>
别配制不同浓度聚合物(B1-B6、C1-C4、P1)的溶液，将不同浓度的聚合物的溶液和PGL-3质粒DNA(9μg/mL)置于37℃水浴中，作用1h，进行动态激光光散射技术研究，我们研究了聚合物与DNA凝聚后的粒径。
图2a～2k分别是本发明聚合物B1-B6、C1-C4、P1的PGL-3DNA的动态光散射实验结果；图2a为本发明所述聚合物B1与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2b为本发明所述聚合物B2与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2c为本发明所述聚合物B3与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2d为本发明所述聚合物B4与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2e为本发明所述聚合物B5与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2f位本发明所述聚合物B6与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2g为本发明所述聚合物C1与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2h为本发明所述聚合物C2与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2i为本发明所述聚合物C3与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2j为本发明所述聚合物C4与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图2k为本发明所述聚合物P1与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图。
结果表明聚合物均可与DNA形成100-200nm大小的颗粒，说明复合物比较容易进入细胞。
<实例4>
别配制不同浓度聚合物(B1-B6、C1-C4、P1)的溶液，将不同浓度的聚合物的溶液和PGL-3质粒DNA(9μg/mL)置于37℃水浴中，作用1h，进行扫描电镜实验，直接把转聚合物与DNA的复合物滴加到硅片上，室温自然晾干。
图3a～3k分别是本发明聚合物B1-B6、C1-C4、P1的PGL-3DNA的扫描电子显微镜实验结果；图3a为本发明所述聚合物B1与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3b为本发明所述聚合物B2与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3c为本发明所述聚合物B3与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3d为本发明所述聚合物B4与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3e为本发明所述聚合物B5与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3f位本发明所述聚合物B6与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3g为本发明所述聚合物C1与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3h为本发明所述聚合物C2与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3i为本发明所述聚合物C3与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3j为本发明所述聚合物C4与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图3k为本发明所述聚合物P1与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图。
结果表明聚合物均可与DNA形成100-200nm大小的颗粒，说明复合物比较容易进入细胞。
<实例5>
配制不同浓度的聚合物溶液，加入培养24h的Hek293T、HeLa、A549和HepG2细胞，采用不含聚合物的DMEM培养基作为空白对照，采用商业化PEI 25k作为阳性对照。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％FBS的DMEM，于培养箱中培养24小时后，向每孔加入10μL MTT溶液，4小时后吸出所有加入液，生成的紫蓝色结晶用150μL DMSO溶解，于摇床上震荡10分钟后用酶标仪测定每一孔在490nm处的吸光度值。按如下公式计算细胞存活率(％)＝[A490test-空白]/[A490control-空白]×100。
如图4所示，图4a为不同浓度的聚合物B1-B6、C1-C4、P1以及参照PEI 25k与质粒DNA的复合物在A549细胞中测定的细胞毒性；图4b为不同浓度的聚合物B1-B6、C1-C4、P1以及参照PEI 25k与质粒DNA的复合物在Hek293T细胞中测定的细胞毒性，图4c为不同浓度的聚合物B1-B6、C1-C4、P1以及参照PEI 25k与质粒DNA的复合物在HeLa细胞中测定的细胞毒性，图4d为不同浓度的聚合物B1-B6、C1-C4、P1以及参照PEI 25k与质粒DNA的复合物在HepG2细胞中测定的细胞毒性；经过在Hek293T、HeLa、A549和HepG2细胞中测定上述十一种聚合物的细胞毒性，发现细胞毒性都比较低，尤其是都比PEI 25k的低。在HepG2细胞中，聚合物浓度为20μg/mL的时候，细胞的成活率都在70％左右。总体呈现的规律是：随着聚合物浓度的增加，细胞死亡数目增加，这是由于聚合物氮原子可以增加细胞毒性；因此为了达到细胞毒性小并且转染率高的目的，选择比较合适的浓度相当重要。
<实例6>
Hek293T细胞对聚合物B1-B6、C1-C4、P1凝聚的DNA的纳米颗粒的摄取实验
将聚合物与DNA按照质量比为5:1配制，其中DNA的浓度为1μg/mL，配好的溶液与Hek293T细胞作用30min，对细胞进行共聚焦显影得到相应的细胞显像图；聚合物B1-B6、C1-C4、P1的细胞显像如图5a～5k；图5a为本发明所述聚合物B1与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5b为本发明所述聚合物B2与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5c为本发明所述聚合物B3与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5d为本发明所述聚合物B4与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5e为本发明所述聚合物B5与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5f位本发明所述聚合物B6与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5g为本发明所述聚合物C1与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5h为本发明所述聚合物C2与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5i为本发明所述聚合物C3与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5j为本发明所述聚合物C4与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图5k为本发明所述聚合物P1与质粒DNA的复合物的细胞摄取图。
由图5a～5k表明，聚合物与DNA的凝聚颗粒可以被细胞有效摄取，是优良的非病毒基因载体材料；
<实例7>
将聚合物与pEGFP按照质量比为5:1配制，其中pEGFP的浓度为1μg/mL，配好的溶液在37℃条件下作用30min，加入到Hek293T细胞中培养4h，然后将Hek293T细胞的培养液换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液培养24h；用1mL PBS将Hek293T细胞洗涤五次后，将细胞置于共聚焦显微镜下进行拍照(10倍放大)；
对商业转染试剂PEI 25k的绿色荧光蛋白表达图采用上述同样的实验方法，作为效果对照组；
图6a～6k为聚合物B1-B6、C1-C4、P1的绿色荧光蛋白表达图；图6l为商业转染试剂PEI 25k的绿色荧光蛋白表达图；图6a为本发明所述聚合物B1本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6b为本发明所述聚合物B2本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6c为本发明所述聚合物B3本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6d为本发明所述聚合物B4本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6e为本发明所述聚合物B5本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6f为本发明所述聚合物B6本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6g为本发明所述聚合物C1本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6h为本发明所述聚合物C2本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6i为本发明所述聚合物C3本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6j为本发明所述聚合物C4本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6k为本发明所述聚合物P1本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图6l为本发明PEI 25k本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图。
由图6a～6k可以看出，聚合物B1-B6、C1-C4、P1都观察到了绿色荧光蛋白的表达；表明本发明公开的聚合物可以作为优良的非病毒基因载体；另外，分析结果可以看出，聚合物B1和聚合物B5的转染效果比其他聚合物较好，P1的最差。
<实例8>
将聚合物B1-B6、C1-C4、P1与pGL-3质粒DNA(DNA的浓度为1μg/mL)按照不同质量比在37℃条件下，作用30min后，加入到HepG2、HeLa、A549和HEK293T细胞中培养4h；然后将细胞的培养液换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液培养24h；除去培养基后，加入20μL细胞裂解液将细胞裂解细胞，再分别测定相对发光强度和蛋白含量，最终以每毫克蛋白的相对发光强度(RLU/mg protein)表示聚合物B1-B6、C1-C4、P1对pGL-3的转染效率。
图7a～7d是本发明聚合物B1-B6、C1-C4、P1作为非病毒基因载体，在与DNA的最佳质量比下，在不同细胞中的荧光素酶表达结果；以商业化转染试剂PEI 25k为参照。图7a为本发明所述聚合物与质粒DNA的复合物在A549细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图；图7b为本发明所述聚合物与质粒DNA的复合物在Hek293T细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图；图7c为本发明所述聚合物与质粒DNA的复合物在HeLa细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图；图7d为本发明所述聚合物与质粒DNA的复合物在HepG2细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图。
图中X轴表示不同的聚合物B1-B6、C1-C4、P1，在整个图中由左到右，条形柱对应的X轴分别表示PEI 25k、B1-B6、C1-C4、P1；Y轴表示荧光素酶表达量。
(1)结果表明在Hek293T细胞中，聚合物B1-B6、C1-C4、P1的最佳转染效率分别是PEI 25k的78％，84％，85％、11％、220％、47％、88％、9.4％、96％、1.1％和0.67％，如图7b。
(2)其中，在HeLa细胞中，聚合物B5的转染效率也是最高的，可以达到PEI 25k的1.5倍，如图7c。
(3)在Hek293T细胞和HeLa细胞中，含有短脂肪链的嵌段聚合物比含有长脂肪链的嵌段聚合物转染效果好，而且嵌段聚合物的转染效果比无规共聚物的好，均聚物的转染效果最差。
(4)聚合物在不同细胞中的转染效果也不一样；在Hek293T细胞中转染效果最好，其次是HeLa，接着是A549和HepG2细胞，如图7a为聚合物B1-B6、C1-C4、P1作为非病毒基因载体在A549细胞转染效果图，如图7d为聚合物B1-B6、C1-C4、P1作为非病毒基因载体在HepG2细胞中的转染效果图。
<实例9>
将聚合物B5在HCl存在条件下，摇床上摇24h，对降解前后的聚合物进行凝胶渗透色谱检测分子量，见图8，HCl处理后B5的分子量明显变小，说明聚合物很容易降解。这对其作为非病毒基因载体非常有意义，因为聚合物容易降解，可以提高生物相容性、减小毒性。
综上所述，本发明提供的基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用，本发明基于δ-戊内酯的聚合物可作为可降解的聚酯类非病毒基因载体在基因转染中应用，聚合物是基于含有胺官能团和不同长度脂肪链的δ-戊内酯，通过开环聚合形成不同的嵌段共聚物、无规共聚物和均聚物，可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，并进入细胞进行基因转染。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，所述基于δ-戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：
[化学式1]
其中，R2是选自含硫的直链烷基中的任意一种，n大于或等于1，m大于或等于0。
2.如权利要求1所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，R2是选自含有硫的C4、C8、C12和C16直链烷基中的一种。
3.如权利要求2所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，R2为
中的一种。
4.如权利要求1所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，所述聚合物为嵌段共聚物，无规共聚物和均聚物中的一种。
5.一种制备如权利要求1～4任意一项所述基于δ-戊内酯的聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、通过click反应制备下面显示的[化学式2]与[化学式3]的单体化合物；
步骤二、[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物进行开环聚合反应制备[化学式1]所示的基于δ-戊内酯的聚合物；
其中，
[化学式2]
[化学式3]
其中，a为2，6，10或14。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤一中，具体包括以下步骤：
S1.按比例称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入溶剂，在氩气氛围下反应，反应后减压浓缩干，减压蒸馏，得到化合物[化学式2]单体化合物；
S2.按比例分别称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇，催化剂，加入溶剂溶解，在氩气氛围下反应8-10h，反应结束后，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到[化学式3]单体化合物。
7.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤二中，基于δ-戊内酯的聚合物为嵌段聚合物，无规共聚物或均聚物，其中，嵌段聚合物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，当转化率为80％以上，再按比例加入[化学式3]单体化合物，形成嵌段聚合物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为20:20-30:1；无规共聚物的合成步骤具体为：分别称取[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成无规共聚物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为10:10:1；均聚物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成均聚物，其中，[化学式2]单体化合物与引发剂的摩尔比为40:1。
8.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述S2步骤中，环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩尔比为1:1，催化剂为三丁基膦，溶剂为二氯甲烷。
9.如权利要求7所述方法，其特征在于，引发剂为苄醇，催化剂为1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯。
10.一种如权利要求1至4任一项所述基于δ-戊内酯的聚合物在非病毒基因载体中的应用。
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