CN110699434A - 一种快速同时定量检测多种抗生素抗性基因的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的试剂盒及其检测方法，所述检测方法包括：(1)以环境样品中的DNA为模板，加入Solution I、Solution II、Solution III。(2)标准质粒(Solution IV)稀释后，加入Solution I、Solution II、Solution III。(3)调节StepOneTMReal‑Time PCR仪反应条件，同时开始以上两个反应。根据标准质粒的Ct值和拷贝数做出每个抗性基因的标准曲线，推算出样品中多种抗性基因的拷贝数。使用本发明的检测方法巧妙地将核酸扩增、探针杂交及光谱技术结合在一起，可以快速定量环境中多种抗生素抗性基因的拷贝数，不仅特异性好，而且定量精确，大大提高了实验操作效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种快速同时定量检测多种抗生素抗性基因的试剂盒及其检测方法。
背景技术
抗生素在近百年的使用历史中为人类解决了诸多问题，如人类疾病的治愈和畜牧养殖的增产。但是随着抗生素滥用的出现，中国成为了世界第一抗生素使用大国，虽然抗生素残留较多的养殖废水、医院废水、抗生素生产废水等都会汇入到污水处理系统进行处理，达标后最终排入江河湖海自然净化。但是传统的污水处理方式并不能有效除去抗生素残余，人们已经在水环境和土壤环境中检测出了相当浓度的抗生素残余。在过量的抗生素残余暴露下，普通的细菌为了生存逐渐演化成耐高浓度抗生素的抗性细菌，而抗性细菌的抗性机制主要包括外排泵、核糖体结合蛋白、裂解酶、细胞外膜通透性改变等，这种分布在各种各样环境媒介中的抗性基因可以通过噬菌体、转座子、质粒实现水平基因转移，直接或者间接在细菌类群之间传递，甚至可能通过微生物进入动物体和人体，构成健康威胁。因此快速高效的定量检测环境中的抗生素抗性基因，对环境健康风险评估具有至关重要的意义。
环境中抗性基因的定量检测方法主要有实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chainreaction，qPCR)、宏基因组测序技术、基因芯片技术。宏基因组测序和基因芯片技术价格昂贵、耗时较长，现多用于综合性的分子研究。qPCR技术根据原理分为染料法和探针法，现在市场上多用的是染料法，但是在该方法中任何双链DNA都会结合染料从而产生信号，易受非特异性产物和引物二聚体的影响，而且染料的结合是非选择性的，仪器检测的也是反应体系中总荧光值的变化，无法对不同的产物分别进行同时检测。探针法中的荧光信号仅来源于靶序列，增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号。而探针法不受非特异性扩增和引物二聚体的影响，在一个体系中可以使用不同的荧光探针标记多种抗性基因，荧光收集系统中的电机带动激发光源组件和荧光检测组件旋转，设置在样品反应池侧壁上的激发光传输光纤和发射光传输光纤是固定的，通过将激发光源组件和荧光检测组件旋转至与样品反应池对应的传输光纤的孔位完成荧光的采集和检测。通过在电机转盘上设置多个激发光源组件和荧光检测组件，可通过设置不同的波长来实现多通道检测，相比于现有技术中通过切换滤光片来实现，多通道检测的结构，实现了多种抗性基因的快速同时定量，不仅节约了成本，同时还提高了实验效率。现如今，探针法也逐渐成为基因定量检测的一种主要方法。
抗性基因探针法定量过程包括引物的设计、探针的选择和制作、标准质粒的构建、反应体系的确立和反应条件的优化。繁琐的过程带来的是抗性基因的定量分析过程中诸多的麻烦。目前的研究中，qPCR中涉及到的合成原料、引物、探针、dNTP和酶等多需要单独保存，由于反应体积小，导致加样过程非常繁琐，而且样品反复冻融带来的样品污染、DNA断裂、酶活降低、实验重复性等问题均是我们需要考虑的因素。探针的选择和制作、标准质粒的构建也都是现在小批量实验中不得不克服的时间、技术和经济问题。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种抗生素抗性基因的定量检测方法及试剂盒。
本发明提出了一种快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的试剂盒，所述试剂盒含有：Solution I、Solution II、Solution III和Solution IV。
本发明中，所述Solution I是由Premix Taq DNA Polymerase、dNTP、MgCl2及缓冲液构造成的扩增体系。
其中，所述Premix Taq DNA Polymerase指高度热稳定的DNA聚合酶，主要包括TaqDNA聚合酶，Super Taq DNA聚合酶，TthTaq DNA聚合酶，LA Taq DNA聚合酶，Ultra PFTMTaqDNA聚合酶；优选地，为Taq DNA聚合酶。
其中，所述Premix Taq DNA Polymerase的浓度为0.01-0.05U/μl；优选地，为0.05U/μl，
其中，所述dNTP指脱氧核糖核苷三磷酸，是DNA合成的原料。
其中，所述dNTPs包括dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs，各个dNTPs的摩尔量比为1:1:1:1，且各个dNTPs的摩尔浓度分别为20-200μM；优选地，为50μM。
其中，所述Solution I中Mg2+的浓度为1.5-3mM；优选地，为2mM。
其中，所述缓冲液具体指200mM Tris HCl pH 8.3，500mM KCl，40mM MgCl2，2μg/ml BSA，1.5M Sorbitol，0.1％TritonX-100。
本发明中，所述Solution II是由不同抗性基因的正向引物和反向引物组成，且这些引物的退火温度一致。
其中，所述退火温度为55-62℃；优选地，为62℃。
其中，所述Solution II中不同抗性基因的所有正反引物的浓度均为1-20μM；优选地，为10μM。
其中，所述正反引物选取的是环境中丰度较高的反应条件一致的几大类抗生素抗性基因(如ereA，ereF，ereB，tetA，tetM，tetL，tetX，blaTEM，blaCTX-M，qnrA，qnrS，blaTEM，sul1，sul2，aadA，lnuA，lnuB，intI1，ISCRI等)的引物。
本发明测试方法中的试剂盒可以按照客户需求定制不同抗性基因组合的Solution II、Solution III和Solution IV。
本发明中，所述Solution III中探针的浓度为200-400nM；优选地，为300nM。
其中，所述探针由环状区、茎干区、荧光基团和淬灭基团组成，且探针的种类和Solution II中的引物种类相对应的。
所述环状区指由15～30个可以与目的基因特异结合的核苷酸。所述目的基因指Solution II中相应引物对应的抗生素抗性基因；特异结合指仅能和目的基因结合，而不识别其他基因。
所述茎干区指能与目的基因特异结合的5～8个可发生可逆性解离的碱基对。所述目的基因指Solution II中相应引物对应的抗生素抗性基因；特异结合指仅能和目的基因结合，而不识别其他基因。
所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5、LCRED705等。
所述淬灭基团包括TAMRA、MGBNFQ、BHQ-1、BHQ-2等。
其中，不同引物对应的探针有不同的荧光标记，根据客户要求可以设计携带FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5、LC RED705等不同荧光基因和淬灭基因的探针，以同时满足同一个反应体系中不同荧光基团的检测和基因的定量。
本发明中，所述Solution IV是与Solution II对应使用的多种抗性基因的由pMD19-T质粒载体构建的质粒标准品。
原始标准质粒的浓度为1010copies/μl，使用时，需要将其按照10倍稀释6-8个梯度，根据定量结果将Ct与标准质粒拷贝数做成标准曲线，要求R2≥0.99。
所述“Ct”为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明提出的快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的试剂盒与现有技术公知的检测环境中抗生素抗性基因的试剂盒相比，该反应中的荧光信号仅来源于靶序列，增加了收集信号的特异性，显著提高了实验的准确性，同时可以在一个反应体系中添加多种抗性基因的引物和对应的标记不同荧光基团的探针，实现了不同种类抗性基因的同时定量检测，大大提高了实验操作效率。
本发明还提供了一种快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的方法，具体步骤如下：
(1)向DNA样品中加入Solution I、Solution II、Solution III，构成完整的qPCR反应体系；
(2)向多种抗性基因对应的Solution IV混合体系中按照步骤(1)添加相应体积的Solution I、Solution II、Solution III；
(3)将步骤(1)、(2)中加入样品的八联排管放入qPCR仪中，设置反应程序为两步法：①预变性：95℃，300s；②40个循环包括：变性：95℃，10s；退火延伸60℃，30s；③溶解曲线：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s；
(4)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log10值和对应Ct值(循环阈值)做出所有目的基因的标准曲线；
(5)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品中所有抗性基因的拷贝数。
所述快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的方法的具体步骤为：
(1)将检测合格的DNA样品稀释到一定的浓度，加入到八连管中，随后依次按比例加入Solution I、Solution II、Solution III，构成完整的qPCR反应体系；
(2)将多种抗性基因对应的Solution IV混合体系分别稀释8个浓度梯度，分别加入八连管中，同时按照步骤(1)先后添加相应体积的Solution I、Solution II、SolutionIII；
(3)将步骤(1)、(2)中加入样品的PCR八联排管放入qPCR仪中，设置反应程序为两步法：①预变性：95℃，300s；②40个循环包括：变性：95℃，10s；退火延伸60℃，30s；③溶解曲线：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s；
(4)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log10值和对应Ct值(循环阈值)做出所有目的基因的标准曲线；
(5)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品中所有抗性基因的拷贝数。
步骤(1)中，所述“合格的DNA样品”具体指A260/A280介于1.7-1.9之间，浓度>50ng/μl，样品DNA条带清晰且分子量较大。
步骤(1)中，所述一定的浓度为10～20ng/μl；优选地，为20ng/μl。
步骤(1)中，所述DNA、Solution I、Solution II、Solution III的体积比为5:24:20:1。
步骤(2)中，所述8个浓度梯度分别为109copies/μl、108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl。
本发明在步骤(1)之前还包括预处理步骤：根据环境样品的类型选择合适的DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作步骤得到DNA后，检测DNA样品的浓度和纯度及DNA样品的完整性；
本发明优选采用超微量紫外分光光度计检测DNA样品的浓度和纯度。
本发明选用琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶电泳、超微量分光光度法等检测DNA样品的完整性；优选采用琼脂糖凝胶检测DNA样品的完整性。
其中，所述“琼脂糖凝胶检测DNA样品的完整性”的具体步骤为凝胶的制作；DNA样品的添加；凝胶电泳；凝胶的成像。
其中，所述琼脂糖凝胶优选为0.7％(w/v)的琼脂糖凝胶。
本发明中DNA样品和solution相应体积的精准添加和按步骤顺序添加对本发明快速、高效、准确的对不同环境中抗性基因进行定量检测至关重要。
在一个具体实施方式中，所述快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的方法的具体步骤如下：
(1)根据环境样品的类型(固体、液体)，选择合适的DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作步骤得到DNA后，用超微量紫外分光光度计检测DNA样品的浓度和纯度，用0.7％(w/v)的琼脂糖凝胶(60V，120A，45min)检测DNA的完整性；
其中，“试剂盒操作步骤”具体指样品的破碎均质；样品碎屑的去除；杂志蛋白质和RNA的去除；DNA样品的过滤；DNA样品的洗涤和洗脱。
(2)将检测合格的DNA样品稀释到合适的浓度(建议模板浓度为10～20ng/μl)，取2μl加入到八连管中，随后依次按比例加入Solution I(10μl)、Solution II(每种引物上下游共1μl，10μmol/L(可根据试剂盒同时添加多种引物))、Solution III(每种探针0.5μl，10μmol/L(可根据试剂盒同时添加多种探针))，qPCR反应体系为20μl，每个反应设置3个平行以上；
(3)将抗性基因对应的Solution IV分别稀释8个浓度梯度，各取2μl加入八连管中，同时按照步骤(2)添加相应体积的Solution I、Solution II、Solution III；
(4)将(2)、(3)步骤中加入样品的八连管中放入qPCR仪中，设置反应程序为两步法：①预变性：95℃，300s；②40个循环包括：变性：95℃，10s；退火延伸60℃，30s；③溶解曲线：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s。
(5)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log10值和对应Ct值(循环阈值)做出所有目的基因的标准曲线；
(6)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品中所有抗性基因的拷贝数。
本发明的有益效果在于：使用本发明公开的检测方法巧妙地将核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起，可以快速定量环境中多种抗生素抗性基因的拷贝数，不仅特异性好，而且定量精确，本发明使用的4色、48孔StepOneTMReal-Time PCR体系采用基于LED的长效光学系统，可以同时记录和ROXTM染料的荧光。按照客户的需求，可以在一个反应体系中同时添加多种抗性基因的引物和对应的标记不同荧光基团的探针，实现了不同种类抗性基因的同时定量检测，快速、高效、准确，大大提高了实验操作效率。并且无需依赖计算机实施数据监控、发布、存储和分析，还可以方便地导出为和图形图像文件。
附图说明
图1：闵行区典型污染水体中抗生素抗性基因的丰度图。
图2：上海市典型景观水体中抗生素抗性基因的丰度图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：上海市闵行区典型污染水体中多种抗生素抗性基因(blaTEM，blaCTX-M，sul1)的测定
从闵行区某污水处理厂、淀浦河、闵行区某养猪场废水(五点取样法)的两个季节(冬季和夏季，每个季节采集三次，以此设置3个平行)采集样品，共12个样品。采集的水样立即放入冰盒中，并按照OMEGA Water DNAKit操作说明进行提取DNA。
将提取好的DNA按照本发明中所描述的检测方法进行实验操作，研究采用20μl的qPCR反应体系，设置阴性对照。荧光定量PCR仪型号为StepOne Real-Time PCR system。Solution II和Solution III选择磺胺类抗性基因sul1和β-内酰胺类抗性基因blaTEM、blaCTX-M的引物和探针，其序列如表1所示。
表1抗生素抗性基因选用引物及探针
Solution IV所含标准质粒与Solution II对应，抗性基因blaTEM，blaCTX-M和sul1的标准曲线如表2所示。
表2抗生素抗性基因qPCR标准曲线
将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，抗性基因的丰度结果如图1所示，β-内酰胺类抗性基因blaTEM和blaCTX-M的绝对丰度分别为6.3×105～1.77×106copies/ml和1.06×106～4.26×106copies/ml，它们的抗性机制为水解酶机制，细菌拥有这种抗性基因即可以行使水解抗生素的功能，所以抗性基因丰度的高低并不代表此类抗生素污染的强弱。磺胺类抗性基因sul1的绝对丰度较高，达到4.72×108～6.48×108copies/ml，sul1在很多未污染的水体和原始森林也被检测具有较高的丰度，可能是含有该基因的细菌的固有耐药现象比较普遍，这与文献报道中的结果较为一致。
实施例2：闵行区典型景观水体中多种抗生素抗性基因(blaTEM，blaCTX-M，sul1)的测定
从上海市长风公园、梦清园、剑河路泵站(五点取样法)的两个季节(冬季和夏季，每个季节采集三次，以此设置3个平行)采集样品，共12个样品。采集的水样立即放入冰盒中，并按照OMEGA Water DNAKit操作说明进行提取DNA。Solution II和Solution III选择喹诺酮类抗性基因qnrA和qnrS和引物和探针，其序列如表3所示。
表3抗生素抗性基因选用引物及探针
Solution IV所含标准质粒与Solution II对应，抗性基因blaTEM，blaCTX-M和sul1的标准曲线如表4所示。
表4抗生素抗性基因qPCR标准曲线
将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，抗性基因的丰度结果如图2所示，
喹诺酮类抗生素作为医院常用的抗菌剂，由于其难分解特性，在环境中存在的时间较长、浓度也较高，但是相应抗性基因qnrA、qnrS的绝对丰度并不是很高，分别为9.3×104～1.47×105copies/ml，2.11×104～3.4×104copies/ml，这可能与当地的水质特性和水质来源有关。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种快速同时定量检测多种抗生素抗性基因的试剂盒及其检测方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
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Claims (12)
1.一种快速同时定量环境中多种抗生素抗性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有Solution I、Solution II、Solution III和Solution IV。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Solution I是由Premix Taq DNAPolymerase、dNTP、MgCl2及缓冲液构造成的扩增体系。
3.根据权利要求书2所述的试剂盒，其特征在于，所述Premix Taq DNA Polymerase的浓度为0.01-0.05U/μl；和/或，所述Solution I中Mg2+的浓度为1.5-3mM；和/或，所述dNTPs包括dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs，所述dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs的摩尔量比为1:1:1:1，所述dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs的摩尔浓度分别为20-200μM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Solution II是由不同抗性基因的正向引物和反向引物组成，所述Solution II中不同抗性基因的所有正反引物的浓度均为1-20μM。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述正反引物选取的是抗生素抗性基因的引物，所述抗生素包括ereA，tetM，blaTEM，qnrA，qnrS，blaCTX-M，sul1，aadA。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Solution III中探针的浓度为200-400nM，所述探针由环状区、茎干区、荧光基团和淬灭基团组成，所述探针的种类和所述Solution II中的引物种类相对应。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述环状区指由15～30个可以与目的基因特异结合的核苷酸；所述茎干区指能与目的基因特异结合的5～8个可发生可逆性解离的碱基对；所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5、LCRED705；和/或，所述淬灭基团包括TAMRA、MGBNFQ、BHQ-1、BHQ-2。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Solution IV是与所述Solution II对应使用的多种抗性基因的由pMD19-T质粒载体构建的质粒标准品。
9.一种快速同时定量检测环境中多种抗生素抗性基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)向DNA样品中加入Solution I、Solution II、Solution III，构成完整的qPCR反应体系；
(2)向多种抗性基因对应的Solution IV混合体系中按照步骤(1)添加相应体积的Solution I、Solution II、Solution III；
(3)将所述步骤(1)、(2)中加入样品的八联排管放入qPCR仪中，设置反应程序为两步法：①预变性：95℃，300s；②40个循环包括：变性：95℃，10s；退火延伸60℃，30s；③溶解曲线：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s；
(4)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log10值和对应Ct值做出所有目的基因的标准曲线；
(5)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品中所有抗性基因的拷贝数。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)将检测合格的DNA样品稀释到一定的浓度，加入到八连管中，随后依次按比例加入Solution I、Solution II、Solution III，构成完整的qPCR反应体系；
(2)将多种抗性基因对应的Solution IV混合体系分别稀释8个浓度梯度，分别加入八连管中，同时按照步骤(1)依次添加相应体积的Solution I、Solution II、Solution III；
(3)将步骤(1)、(2)中加入样品的PCR八联排管放入qPCR仪中，设置反应程序为两步法：①预变性：95℃，300s；②40个循环包括：变性：95℃，10s；退火延伸60℃，30s；③溶解曲线：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s；
(4)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log10值和对应Ct值做出所有目的基因的标准曲线；
(5)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品中所有抗性基因的拷贝数。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA、Solution I、Solution II、Solution III的体积比为5:24:20:1；所述一定的浓度为10～20ng/μl。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述8个浓度梯度分别为109copies/μl、108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911076198.0A CN110699434A (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种快速同时定量检测多种抗生素抗性基因的试剂盒及其检测方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111607655A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-01 | 河北工程大学 | 一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法 |
| CN116004351A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-04-25 | 安徽师范大学 | 一种抗生素抗性基因检测试剂盒及其使用方法 |
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2019
- 2019-11-06 CN CN201911076198.0A patent/CN110699434A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
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