CN110699411A - 一种蛋壳膜多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋壳膜多肽的制备方法，属于食品领域。本发明采用挤压膨化、稀碱及酶解的一种联合技术，即首先对蛋壳膜进行挤压膨化和稀碱预处理，再进行酶解，以期提高酶解效率，并避免使用离子液体、有机溶剂等有毒试剂，从而制备具有抗氧化性的壳膜多肽，且含有丰富的粘多糖，粘多糖的得率达到23.58mg/g蛋壳膜，总氮回收率达到78.09％。产物蛋壳膜多肽具有良好的抗氧化活性，分子量主要在1000Da以下，占89.54％。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋壳膜多肽的制备方法，属于食品领域。
背景技术
蛋壳膜的主要组成成分是蛋白质，占膜总重的90％左右，主要以糖蛋白形式存在，另外还含有约3％的脂质体及2％的粘多糖类。蛋白质以角蛋白为主，还含有胶原蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白等，种类非常丰富。粘多糖主要是透明质酸和硫酸软骨素两种。其中，透明质酸被誉为最理想的天然保湿因子，具有极好的保湿作用，可抗皮肤衰老和皱纹的生成。硫酸软骨素具有调节代谢、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生理功能，目前已被用于风湿病、肾炎、消化性溃疡等疾病的临床治疗。
尽管蛋壳膜具有很高的营养价值，但在食品领域中的应用非常有限，主要是因为其主要成分角蛋白分子中含有大量的二硫键，导致其水溶性极差，仅5％左右。据此，许多研究工作者采用水解工艺来提高蛋壳膜的水溶性。在水解过程中，角蛋白分子链被切成分子量较小的肽段，与环境溶液中的水分子间作用力增强，水溶性增加。此外，产物壳膜多肽具有一定的生理活性，如抗氧化性、抗炎活性等。传统的水解工艺是酸碱处理法、还原法和氧化法等化学法，具有生产能力大、资金投入少、周期短、便于连续操作、容易实现自动化等优点，但生产过程中易产生对环境有毒有害的废弃物，后期的提纯难度较大，且反应过程剧烈、难以控制，蛋白分子结构破坏严重，导致营养价值损失较大。酶水解工艺属于生物法，具有反应条件温和，过程易于控制，对环境友好，提纯成本低，酶解产物稳定等优点。但由于角蛋白水溶性太差，与酶作用的活性位点少，导致反应耗时长，酶解效率低。因此可对蛋壳膜进行预处理来提高酶解效率，如使用强碱、离子液体、有机试剂等，但这些前处理方法会给产品分离纯化及废水处理带来负担且存在安全隐患。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过采用挤压膨化、稀碱及酶解的一种联合技术，即首先对蛋壳膜进行挤压膨化和稀碱预处理，再进行酶解，以期提高酶解效率，并避免使用离子液体、有机溶剂等有毒试剂，从而制备具有抗氧化性的壳膜多肽，且含有丰富的粘多糖。挤压膨化常作为酶解法制备大豆多肽的前处理步骤，主要作用是促进大豆中蛋白质的溶出。在本专利中，挤压膨化的目的是促使角蛋白分子间或分子内二硫键发生断裂，提高角蛋白的溶解性，有利于后续的酶处理；同时破坏蛋白质与多糖的结合状态，释放出更多的粘多糖，提高产物的营养价值。
本发明的第一个目的是提供一种蛋壳膜的预处理方法，所述方法是将壳膜分离、粉碎后，采用挤压膨化和稀碱对蛋壳膜进行预处理；所述稀碱是浓度为0.1～0.25M的碱溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述挤压膨化条件是：转速为100～140r/min，温度为120℃～160℃。
在本发明的一种实施方式中，所述预处理方法包括以下步骤：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50～80℃条件下烘干6～12h后粉碎，过60～100目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量在10％～30％之间，控制螺杆转速为100～140r/min，在温度120℃～160℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎过60目筛后采用稀碱溶液进行碱处理，所述稀碱溶液的浓度为0.1～0.25M。
本发明的第二个目的是提供一种预处理方法在蛋壳膜多肽、粘多糖、角蛋白和胶原蛋白提取方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种蛋壳膜多肽的制备方法，该方法采用上述预处理方法结合酶解制备蛋壳膜多肽，且产物中含有丰富的粘多糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50～80℃条件下烘干6～12h后粉碎，过60～100目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量为10％～30％，控制螺杆转速为100～140r/min，在温度120℃～160℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎后采用稀碱溶液进行碱处理；稀碱溶液的浓度为0.1～0.25M，将经过挤压膨化、粉碎过筛后的蛋壳膜粉与稀碱溶液在温度为30～40℃的条件下，按固液比1:10～1:20(w/w)混合均匀，恒温搅拌2～6h得到混合料；
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至45～65℃，pH至8.0～10.5后加入蛋白酶酶解；
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机4500～10000r/min离心10～30min，除去不溶性沉淀后收集上清液；
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液；
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩；
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶，蛋白酶的用量为碱性蛋白酶的用量为3000～8000U/g蛋壳膜，恒温45℃～65℃下搅拌酶解6～8h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
本发明的第四个目的是提供一种上述制备方法制备得到的蛋壳膜多肽。
本发明的第五个目的是提供一种蛋壳膜多肽在作为保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、日化用品中抗氧化剂方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本专利开发了挤压膨化、稀碱及酶解的联合技术，有利于蛋白质及粘多糖的溶出，提高了酶解效率，避免使用有毒有害试剂，产物安全，易实现工业化；并降低碱浓度，减少灰分，更加经济环保。
(2)本发明在制备蛋壳膜多肽的同时，也保留了粘多糖成分，粘多糖的得率达到23.58mg/g蛋壳膜，总氮回收率达到78.09％。产物蛋壳膜多肽具有良好的抗氧化活性，分子量主要在1000Da以下，占89.54％。
附图说明
图1为挤压膨化温度对蛋壳膜中粘多糖得率及总氮回收率的影响。
图2为挤压膨化转速对蛋壳膜中粘多糖得率及总氮回收率的影响。
图3为挤压膨化处理中蛋壳膜含水量对蛋壳膜中粘多糖得率及总氮回收率的影响。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
碱性蛋白酶：AP-200a，酶活20万U/g，安琪酵母股份有限公司。
1.粘多糖含量测定方法
蛋壳膜中的粘多糖主要为透明质酸和硫酸软骨素，它们都含有固定比例的D-葡萄糖醛酸，因此，通过测定D-葡萄糖醛酸的含量可间接表示这两种粘多糖的总含量。具体测定方法参照企标QB/T 4576-2013《透明质酸钠》。
2.总氮回收率测定方法
采用凯氏定氮法进行测定。
3.抗氧化活性测定方法
3.1ABTS+自由基的清除能力测定方法
取5ml 7.4mM的ABTS+储备液和88ul 2.6mM K2S2O8储备液混合，在室温、避光条件下放置16h，形成ABTS+工作液。使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)将储备液稀释为工作液，使其在734nm波长处的吸光度为0.70±0.02，此为对照。每支试管加入0.5ml样品与3mlABTS+工作液混合，混匀10s，室温下反应6min后在734nm下测吸光度的变化。
ABTS+自由基清除能力以IC50来计，表示清除率达到50％时样品的浓度，mg/ml。
3.2Fe2+螯合能力测定方法
取1ml样品(0.1、0.5、1、1.5、2mg/ml)，0.05ml 2mM的氯化亚铁，1.85ml去离子水混合后加入0.1ml 5mM菲咯嗪溶液充分混合，室温下放置10min后，在562nm处测定其吸光度。用去离子水代替样品的溶液做为对照。
Fe2+螯合能力以IC50来计，表示Fe2+螯合能力达到50％时样品的浓度，mg/ml。
实施例1：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50℃条件下烘干8h后粉碎，过100目筛网得到蛋壳膜粉末。
(2)预处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量为20％，控制螺杆转速为100r/min，在温度140℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎过60目筛后采用稀碱溶液进行碱处理。将经过挤压膨化、粉碎过筛后的蛋壳膜粉与0.1M NaOH在温度为30℃的条件下，按固液比1:15(w/w)混合均匀，恒温搅拌3h得到混合料。
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至55℃，pH至10后加入碱性蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的用量为8000U/g蛋壳膜，恒温55℃搅拌酶解6h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机6000r/min离心20min，除去不溶性沉淀后收集上清液。
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液。
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩。
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
计算粘多糖得率，总氮回收率以及抗氧化性，结果见表1和表2。
实施例2：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50℃条件下烘干6h后粉碎至粒度为100目的蛋壳膜粉末。
(2)预处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量为20％，控制螺杆转速为100r/min，在温度140℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎过60目筛后采用稀碱溶液进行碱处理。将经过挤压膨化、粉碎过筛后的蛋壳膜粉与0.25M NaOH在温度为30℃的条件下，按固液比1:15(w/w)混合均匀，恒温搅拌6h得到混合料。
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至55℃，pH至10后加入碱性蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的用量为8000U/g蛋壳膜，恒温55℃搅拌酶解8h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机6000r/min离心20min，除去不溶性沉淀后收集上清液。
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液。
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩。
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
计算粘多糖得率，总氮回收率以及抗氧化性，结果见表1和表2。
实施例3:
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在55℃条件下烘干8h后粉碎，过100目筛网得到蛋壳膜粉末。
(2)前处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量为20％，控制螺杆转速为100r/min，在温度140℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎过60目筛后采用稀碱溶液进行碱处理。将经过挤压膨化、粉碎过筛后的蛋壳膜粉与0.1M NaOH在温度为30℃的条件下，按固液比1:15(w/w)混合均匀，恒温搅拌3h得到混合料。
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至55℃，pH至10后加入碱性蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的用量为3000U/g蛋壳膜，在55℃下搅拌酶解6h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机10000r/min离心20min，除去不溶性沉淀后收集上清液。
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液。
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩。
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
计算粘多糖得率，总氮回收率以及抗氧化性，结果见表1和表2。
实施例4：挤压膨化条件的选择
1、挤压膨化温度的选择
将实施例1中的挤压膨化温度调整为120℃，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的挤压膨化温度调整为160℃，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的挤压膨化温度调整为180℃，其他条件或者参数与实施例1一致。
计算粘多糖得率、总氮回收率，结果见图1。
2、挤压膨化转速的选择
将实施例1中的挤压膨化转速调整为60r/min，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的挤压膨化转速调整为80r/min，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的挤压膨化转速调整为120r/min，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的挤压膨化转速调整为140r/min，其他条件或者参数与实施例1一致。
计算粘多糖得率、总氮回收率，结果见图2。
3、含水量的选择
将实施例1中的蛋壳膜含水量调整为10％，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的蛋壳膜含水量调整为15％，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的蛋壳膜含水量调整为25％，其他条件或者参数与实施例1一致。
将实施例1中的蛋壳膜含水量调整为30％，其他条件或者参数与实施例1一致。
计算粘多糖得率、总氮回收率，结果见图3。
图1-3表明挤压膨化条件对蛋壳膜中粘多糖含量及总氮回收率具有显著的影响作用，最佳条件是：蛋壳膜粉的含水量为20％，螺杆转速为100r/min，操作温度为140℃。此时，蛋壳膜中粘多糖的溶出率和蛋白质的溶解性达到最高值。
实施例5：蛋白酶种类的选择
选用复配酶制剂、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、角蛋白酶和胰蛋白酶作为试验用酶，其他条件或者参数与实施例1一致，计算产物的抗氧化性，结果见表3。
对比例1：传统浓碱预处理
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50℃条件下烘干8h后粉碎，过100目筛网得到蛋壳膜粉末。
(2)前处理：将步骤(1)得到的蛋壳膜粉与1.25M NaOH在温度为40℃的条件下，按固液比1:15(w/w)混合均匀，恒温搅拌3h得到混合料。
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至55℃，pH至10后加入碱性蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的用量为8000U/g蛋壳膜，恒温55℃搅拌酶解8h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机6000r/min离心20min，除去不溶性沉淀后收集上清液。
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液。
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩。
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
计算粘多糖得率，总氮回收率以及抗氧化性，结果见表1和表2。
对比例2：省略挤压膨化
省略实施例1中的挤压膨化步骤，其他条件同实施例1，所述方法包括以下步骤：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50℃条件下烘干8h后粉碎，过100目筛网得到蛋壳膜粉末。
(2)前处理：将步骤(1)得到的蛋壳膜粉与0.1M NaOH在温度为30℃的条件下，按固液比1:15(w/w)混合均匀，恒温搅拌3h得到混合料。
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至55℃，pH至10后加入碱性蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的用量为8000U/g蛋壳膜，恒温55℃搅拌酶解8h，最后在90℃条件下灭酶10min得到蛋壳膜酶解液。
(4)离心：将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机6000r/min离心20min，除去不溶性沉淀后收集上清液。
(5)微滤：将步骤(4)得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液。
(6)纳滤：将步骤(5)所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩。
(7)干燥：将步骤(6)得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
计算粘多糖得率，总氮回收率以及抗氧化性，结果见表1和表2。
表1不同预处理方式对粘多糖含量、总氮回收率的影响
表1表明，挤压膨化与和稀碱预处理是非常关键的步骤，可显著提高粘多糖得率和总氮回收率，主要原因可能是挤压膨化作用于蛋壳膜中的角蛋白，促使蛋白质分子间或分子内二硫键发生断裂，提高蛋白质的水溶性，并释放出更多的粘多糖。与传统浓碱工艺相比，本专利技术的优势是降低碱的用量，从而减少终产品中的灰分，同时降低废水的处理成本，更加经济环保。
表2制备条件对壳膜多肽抗氧化活性的影响
表3酶种类对壳膜多肽抗氧化活性的影响
*复配酶制剂：FF104，以碱性蛋白酶为主，含有中性蛋白酶、胰蛋白酶酶、木瓜蛋白酶，酶活20万U/g，安琪酵母股份有限公司。
表2表明挤压膨化与和稀碱是非常关键的前处理步骤，可显著提高酶解效率，制备的壳膜多肽具有较强的抗氧化活性。表3表明酶的种类对壳膜多肽的抗氧化活性具有显著的影响作用，其中碱性蛋白酶的效果最好，制备的壳膜多肽的抗氧化活性最强。
表4壳膜多肽的分子量分布情况
表4表明，不同制备条件可获得分子量分布不同的壳膜多肽，其中<1000Da的肽段为主要成分。采用挤压膨化、稀碱及酶解联合技术制备的蛋壳膜多肽，<1000Da的肽段占89.54％，远高于对照组。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种蛋壳膜的预处理方法，其特征在于，所述方法是将壳膜分离、粉碎得到蛋壳膜粉，先采用挤压膨化处理蛋壳膜粉，再采用稀碱溶液进行预处理；所述稀碱溶液是浓度为0.1～0.25mol/L的碱溶液。
2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述挤压膨化条件是：转速为100～140r/min，温度为120℃～160℃。
3.权利要求1或2所述的预处理方法在提取蛋壳膜多肽、粘多糖、角蛋白和胶原蛋白方面的应用。
4.一种蛋壳膜多肽的制备方法，其特征在于，该方法是先采用权利要求1或2述的预处理方法处理蛋壳膜，再利用蛋白酶酶解制备蛋壳膜多肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)原料制备：将收集得到的蛋壳清洗灭菌，通过壳膜分离机实现壳膜分离，将得到的蛋壳膜在50～80℃条件下烘干6～12h后粉碎，过60～100目筛网得到蛋壳膜粉末；
(2)预处理：调节步骤(1)得到的蛋壳膜粉的含水量为10％～30％，控制螺杆转速为100～140r/min，在温度120℃～160℃的条件下进行挤压膨化处理，将得到的蛋壳膜膨化物粉碎后采用稀碱溶液进行碱处理；稀碱溶液的浓度为0.1～0.25mol/L，将经过挤压膨化、粉碎过筛后的蛋壳膜粉与稀碱溶液混合得到混合料；
(3)酶解：调节步骤(2)得到的混合料温度至45～65℃，pH至8.0～10.5后加入蛋白酶酶解。
(4)离心、过滤、干燥获得蛋壳膜多肽。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，蛋壳膜粉与稀碱溶液是在温度为30～40℃的条件下，按固液比1:10～1:20(w/w)混合均匀，并恒温搅拌2～6h得到混合料。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的用量为3000～8000U/g蛋壳膜，恒温45～65℃下搅拌酶解6～8h。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)包括离心、微滤、纳滤和干燥；所述离心是将步骤(3)得到的蛋壳膜酶解液经离心机4500～10000r/min离心10～30min，除去不溶性沉淀后收集上清液；所述微滤是将离心得到的上清液采用陶瓷膜微滤除菌，得到蛋壳膜酶解清液；所述纳滤是将经微滤所得的蛋壳膜酶解清液采用200Da的纳滤膜脱盐浓缩；所述干燥是将得到的浓缩液采用喷雾干燥获得蛋壳膜多肽。
9.应用权利要求4-8任一所述的制备方法制备得到的蛋壳膜多肽。
10.权利要求9所述的蛋壳膜多肽在作为保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、日化用品中抗氧化剂方面的应用。
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