CN110662434A - 含酒精饮料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包括益生菌的含酒精饮料，具体涉及一种包括乳杆菌的啤酒。还公开了一种形成所述含酒精饮料的方法，包括提供麦芽汁或果汁；向所述麦芽汁或果汁内添加益生菌和酵母；以及将所述麦芽汁或果汁在预设温度下发酵预设时间长度以形成所述含酒精饮料。
Description
技术领域
本发明涉及一种含酒精饮料，具体涉及一种包括益生菌的含酒精饮料。
背景技术
由于益生菌可产生健康方面的益处，因此人们对益生菌消费方面的兴趣越来越高。目前，许多食品和饮料中均含益生菌。然而，由于大多数此类食品和饮料产品均以乳制品为基础，因此可能不太适合于乳糖不耐受人群。目前，已有人正在开展以乳制品之外的食品为新的递送背景物的新型益生菌递送方法方面的研究。
已有证据表明，麦芽类饮料对于乳杆菌属的若干种益生菌株的存活能力具有保护作用。含酒精饮料，尤其特种啤酒在消费者当中的受欢迎程度正变得越来越高。虽然啤酒为一种麦芽类饮料，但是由于啤酒具有多种阻止益生菌生长及妨碍益生菌存活的内在抗菌机制，因此如何在啤酒中维持益生菌的存活能力仍是一项重大技术难题。啤酒中的主要抗菌化合物为异α酸，该酸可作为离子载体，并通过细胞内酸化、能量生成抑制及氧化还原平衡等各种机制，限制革兰氏阳性细菌的生长。未与啤酒分离的益生菌不具有任何通过克服该酸的抑制作用而在啤酒中生长和存活的机制。
发明内容
本发明旨在解决上述问题，和/或提供一种含益生菌的改进饮料。
本发明总体涉及一种包括益生菌的含酒精饮料。与其他含酒精饮料相比，本发明的含酒精饮料因含有益生菌而具有健康方面的益处。具体而言，已有证据表明，益生菌具有促进肠道健康和免疫系统功能等健康方面的益处。
根据第一方面，本发明提供一种包括益生菌的含酒精饮料。
所述含酒精饮料可具有合适的酒精含量。根据一个具体方面，所述含酒精饮料的酒精含量可≥0.5％体积百分比。具体而言，该酒精含量可以为0.5～10％、1.0～9.0％、1.5～8.0％、2.0～7.5％、2.5～7.0％、3.0～6.5％、3.5～6.0％、4.0～5.5％、4.5～5.0％。更具体而言，所述酒精含量可以为2.0～5.0％。
所述含酒精饮料可以为任何合适的含酒精饮料。该含酒精饮料尤其为啤酒。根据一个具体方面，该含酒精饮料可进一步含有啤酒花。就本发明的目的而言，提及的啤酒花指的是啤酒花和/或其衍生物。该啤酒花可以为任何合适的啤酒花。该啤酒花可例如为异构化啤酒花提取物。该啤酒花可具有合适的苦度。该啤酒花可尤其具有≤30IBU的苦度。该苦度可更尤其为0～30IBU、3～27IBU、5～25IBU、7.5～20IBU、9～18IBU、10～16IBU、12～15IBU、13～14IBU。
所述含酒精饮料内所包括的益生菌可以为任何合适的益生菌。该益生菌可例如包括乳杆菌属(Lactobacillus)菌、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌或其组合。所述乳杆菌属菌可尤其包括但不限于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或其组合。
所述含酒精饮料内可包括合适量的益生菌。该益生菌可例如具有≥5.0log CFU/mL的细胞数。所述含酒精饮料内所包括的益生菌可尤其具有5.0～12.0log CFU/mL、5.5～11.5log CFU/mL、6.0～11.0log CFU/mL、6.5～10.5log CFU/mL、7.0～10.0log CFU/mL、7.5～9.5log CFU/mL、8.0～9.0log CFU/mL的细胞数。所述含酒精饮料内所包括的益生菌可尤其具有约7.0log CFU/mL的细胞数。
所述含酒精饮料可具有合适的pH值。该含酒精饮料的pH值可以为2～6。该pH值可尤其为2.5～5.5、3～5、3.5～4.5、3.75～4.0。该pH值可更尤其为约3～5。
所述含酒精饮料可具有合适的白利糖度。该含酒精饮料的白利糖度可例如为4～20°Bx。该白利糖度可尤其为5～18°Bx、6～15°Bx、7～12°Bx、8～10°Bx、9～9.5°Bx。该白利糖度可尤其为约5～15°Bx。
根据本发明的第二方面，提供一种形成上述含酒精饮料的方法，所述方法包括：
-提供麦芽汁或果汁；
-向所述麦芽汁或果汁内添加益生菌；
-向所述麦芽汁或果汁内添加酵母；以及
-将所述麦芽汁或果汁在预设温度下发酵预设时间长度，以形成所述含酒精饮料。
所述麦芽汁或果汁可以为适于本发明目的的任何麦芽汁或果汁。
添加至该麦芽汁或果汁内的益生菌可以为任何合适的益生菌。该益生菌可例如为如上所述的益生菌。
添加至所述麦芽汁或果汁内的酵母可以为适于本发明目的的任何酵母。该酵母可例如为酵母属酵母、非酵母属酵母或其组合。根据一个具体方面，所述酵母可以为，但不限于，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pasteurianus)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、耐热拉茜斯酵母(Lachanceathermotolerans)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)或其组合。
上述方法可进一步包括向所述麦芽汁或果汁内添加啤酒花。添加至该麦芽汁或果汁内的啤酒花可以为如上所述的任何合适的啤酒花。
所述添加益生菌和所述添加酵母可同时或先后进行。
根据一个具体方面，所述添加益生菌和所述添加酵母可同时进行。随后，可在合适的条件下进行所述发酵。该发酵可例如包括：将所述麦芽汁或果汁在第一温度下发酵第一时间长度；随后将该麦芽汁或果汁在第二温度下发酵第二时间长度。所述方法可进一步包括：在所述第二时间长度结束时，添加啤酒花。
根据一个具体方面，所述添加益生菌和所述添加酵母可先后进行。所述添加酵母可尤其在所述添加益生菌之后的第三时间长度后进行。随后，可在合适条件下进行发酵。该发酵可例如包括：在添加所述酵母后，将所述麦芽汁或果汁在第三温度下发酵第四时间长度；随后将该麦芽汁或果汁在第四温度下发酵第五时间长度。该方法可进一步包括：在所述第五时间长度结束时，添加啤酒花。
所述第一时间长度、第二时间长度、第三时间长度、第四时间长度和第五时间长度可以为任何合适的时间长度。所述各时间长度可根据添加至所述麦芽汁或果汁内的益生菌和酵母而进行选择。
所述第一温度、第二温度、第三温度和第四温度可以为适于本发明目的的任何温度。所述第一温度和第三温度可例如为同一温度。所述第二温度和第四温度可例如为同一温度。
具体而言，所述第一温度和第三温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为20～42℃。更具体而言，所述第一温度和第三温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为约30℃。
具体而言，所述第二温度和第四温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为18～30℃。更具体而言，所述第二温度和第四温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为约20℃。
根据一个具体方面，在所述发酵后，可将形成的所述含酒精饮料保存于合适的温度。本发明方法形成的所述含酒精饮料可例如保存于≤20℃的温度。该含酒精饮料可尤其保存于约≤10℃的温度。该含酒精饮料可更尤其保存于约1～5℃的温度。
附图说明
为了使本发明可被完全理解并易于付诸实践，以下将以非限制性举例的方式仅对例示实施方式进行描述。该描述参考说明性附图。在附图中：
图1所示为三种益生菌株在带啤酒花麦芽汁内的10天发酵过程中的存活状况：(●)副干酪乳杆菌L26；(×)副干酪乳杆菌Lpc-37；(◆)鼠李糖乳杆菌HN001。#误差线表示标准偏差(n＝3)。*发酵温度一直保持于37℃。
图2所述为副干酪乳杆菌L26在共同发酵及5℃和25℃保存过程中的生长和存活状况：(○)5℃下的副干酪乳杆菌L26；(●)25℃下的副干酪乳杆菌L26；(□)5℃下共同接种的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04；(■)25℃下共同接种的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。*在第10天时，添加27IBU的异构化啤酒花提取物。
图3所示为副干酪乳杆菌L26在先后发酵及5℃和25℃下保存过程中的生长和存活状况：(○)5℃下的副干酪乳杆菌L26；(●)25℃下的副干酪乳杆菌L26；(□)5℃下先后接种的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04；(■)25℃下先后接种的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。^第2天时，添加酿酒酵母S-04。#在第10天时，添加27IBU的异构化啤酒花提取物。
图4所示为共同接种的副干酪乳杆菌L26在啤酒5℃保存过程中的生长和存活状况：(□)5℃下0IBU；(×)5℃下7.5IBU；(○)5℃下15IBU；(Δ)5℃下22.5IBU。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。#在第10天时，添加27IBU的异构化啤酒花提取物。
图5所示为共同接种的副干酪乳杆菌L26在啤酒25℃保存过程中的生长和存活状况：(□)25℃下0IBU；(+)25℃下7.5IBU；(●)25℃下15IBU；(▲)25℃下22.5IBU。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。#在第10天时，添加27IBU的异构化啤酒花提取物。
图6A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的pH值变化：(□)5℃下0IBU；(×)5℃下7.5IBU；(○)5℃下15IBU；(Δ)5℃下22.5IBU。图6B为发酵和啤酒25℃保存过程中的pH值变化图：(■)25℃下0IBU；(+)25℃下7.5IBU；(●)25℃下15IBU；(▲)25℃下22.5IBU。
图7A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的白利糖度变化：(□)5℃下0IBU；(×)5℃下7.5IBU；(○)5℃下15IBU；(Δ)5℃下22.5IBU。图7B为发酵和啤酒25℃保存过程中的白利糖度变化图：(■)25℃下0IBU；(+)25℃下7.5IBU；(●)25℃下15IBU；(▲)25℃下22.5IBU。
图8所示为先后接种的副干酪乳杆菌L26(酵母发酵后)在啤酒5℃和25℃保存过程中的存活状况：(○)5℃；(Δ)25℃。#在副干酪乳杆菌L26添加前，将带啤酒花麦芽汁(等于27IBU)与酿酒酵母S-04发酵10天。
图9所示为先后接种的益生菌啤酒在发酵及5℃和25℃保存过程中的pH值变化：(○)5℃；(Δ)25℃。
图10所示为先后接种的益生菌啤酒在发酵及5℃和25℃保存过程中的白利糖度变化：(○)5℃；(Δ)25℃。
图11所示为共同接种的益生菌在发酵和啤酒5℃保存过程中的生长和存活状况：(◆)副干酪乳杆菌L26；(■)鼠李糖乳杆菌HN001；(▲)嗜酸乳杆菌NCFM。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。#在第10天时，添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。
图12所示为共同接种的益生菌在发酵和啤酒25℃保存过程中的生长和存活状况：(◇)副干酪乳杆菌L26；(□)鼠李糖乳杆菌HN001；(Δ)嗜酸乳杆菌NCFM。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第10天为20℃。#在第10天时，添加27IBU的异构化啤酒花提取物。
图13A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的pH值变化：(◆)副干酪乳杆菌L26；(■)鼠李糖乳杆菌HN001；(▲)嗜酸乳杆菌NCFM。图13B所示为发酵和啤酒25℃保存过程中的pH值变化：(◇)副干酪乳杆菌L26；(□)鼠李糖乳杆菌HN001；(Δ)嗜酸乳杆菌NCFM。
图14A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的白利糖度变化：(◆)副干酪乳杆菌L26；(■)鼠李糖乳杆菌HN001；(▲)嗜酸乳杆菌NCFM。图14B所示为发酵和啤酒25℃保存过程中的白利糖度变化：(◇)副干酪乳杆菌L26；(□)鼠李糖乳杆菌HN001；(Δ)嗜酸乳杆菌NCFM。
图15所示为副干酪乳杆菌L26与非酵母属酵母共同发酵及随后的5℃保存过程中的生长状况：(■)副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude；(●)副干酪乳杆菌L26与美极梅奇酵母Flavia。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第12天为20℃。#在第12天时，添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。
图16所示为副干酪乳杆菌L26与非酵母属酵母共同发酵及随后的25℃保存过程中的生长状况：(□)副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude；(○)副干酪乳杆菌L26与美极梅奇酵母Flavia。*发酵温度在第0天至第2天为30℃，第2天至第12天为20℃。#在第12天时，添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。
图17A所示为无啤酒花麦芽汁在发酵和5℃保存过程中的pH值变化，图17B所示为无啤酒花麦芽汁在发酵和25℃保存过程中的pH值变化：(■)副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude；(●)副干酪乳杆菌L26与美极梅奇酵母Flavia；(□)仅戴尔有孢圆酵母Prelude；(○)仅美极梅奇酵母Flavia。
图18A所示为无啤酒花麦芽汁在发酵和5℃保存过程中的白利糖度变化，图18B所示为无啤酒花麦芽汁在发酵和25℃保存过程中的白利糖度变化：(■)副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude；(●)副干酪乳杆菌L26与美极梅奇酵母Flavia；(□)仅戴尔有孢圆酵母Prelude；(○)仅美极梅奇酵母Flavia。
图19所示为副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种和先后接种后发酵并在啤酒5℃保存过程中的生长和存活状况：(●)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后5℃保存；(■)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后5℃保存。*发酵温度在第0天至第1天为30℃，第1天至第22天为20℃。#在第22天时，添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。^先后接种时，酿酒酵母W-34/70在发酵第1天时添加。
图20所示为副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种和先后接种后发酵并在啤酒25℃保存过程中的生长和存活状况：(○)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后25℃下保存；(□)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后25℃下保存。*发酵温度在第0天至第1天为30℃，第1天至第22天为20℃。#在第22天时，添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。^先后接种时，酿酒酵母W-34/70在发酵第1天时添加。
图21A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的pH值变化：(●)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后5℃下保存；(■)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后5℃下保存；(▲)酿酒酵母W-34/70单独培养后5℃下保存。图21B所示为发酵和啤酒25℃保存过程中的pH值变化：(○)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后25℃下保存；(□)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后25℃下保存；(Δ)酿酒酵母W-34/70单独培养后25℃下保存。
图22A所示为发酵和啤酒5℃保存过程中的白利糖度变化：(●)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后5℃下保存；(■)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后5℃下保存；(▲)酿酒酵母W-34/70单独培养后5℃下保存。图22B所示为发酵和啤酒25℃保存过程中的白利糖度变化：(○)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70共同接种后25℃下保存；(□)副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W-34/70先后接种后25℃下保存；(Δ)酿酒酵母W-34/70单独培养后25℃下保存。
具体实施方式
如上所述，目前需要一种作为益生菌递送手段的非乳制品饮料。
本发明涉及一种包括益生菌的含酒精饮料。由于存在阻止益生菌生长且阻碍益生菌存活的抗菌化合物，因此一般认为啤酒等含酒精饮料中难以掺入益生菌。相应地，本发明提供一种令人惊异且难以预料的含酒精饮料，在该含酒精饮料中，即使存在抗菌化合物，益生菌仍然能够生长和存活。
益生菌已知具有健康方面的益处。例如，已有证据表明，某些益生菌株能够改善肠道健康和消化状况。因此，本发明的含酒精饮料可产生改善肠道健康及增强免疫力等健康方面的益处。
根据第一方面，本发明提供一种包括益生菌的含酒精饮料。
就本发明的目的而言，含酒精饮料定义为含有乙醇或酒精等醇类的饮料。该含酒精饮料可尤其具有≥0.5％体积百分比的酒精含量。
所述含酒精饮料可具有合适的酒精含量。根据一个具体方面，该含酒精饮料的酒精含量可≥0.5％体积百分比。该酒精含量可例如为0.5～10％、1.0～9.0％、1.5～8.0％、2.0～7.5％、2.5～7.0％、3.0～6.5％、3.5～6.0％、4.0～5.5％、4.5～5.0％。该酒精含量可尤其为2.0～5.0％。该酒精含量可更尤其为约3～4％。
所述含酒精饮料可以为任何合适的含酒精饮料。含酒精饮料可例如包括但不限于啤酒、葡萄酒、苹果酒、烈性酒等。根据一个具体方面，所述含酒精饮料可以为啤酒。
所述含酒精饮料内所含的益生菌可以为任何合适的益生菌。该益生菌可以为当以足够的量提供时能够对宿主产生健康方面益处的任何合适的活体微生物。所述益生菌可例如包括乳杆菌属菌、双歧杆菌属菌或其组合。所述乳杆菌属可尤其包括但不限于副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌或其组合。该乳杆菌属可更尤其包括副干酪乳杆菌LAFTI L26、副干酪乳杆菌Lpc-37、鼠李糖乳杆菌HN001、嗜酸乳杆菌NCFM或其组合。
所述含酒精饮料内可含有合适量的益生菌。该益生菌可例如具有≥5.0log CFU/mL的细胞数。所述含酒精饮料内所含的益生菌可尤其具有5.0～12.0log CFU/mL、5.5～11.5log CFU/mL、6.0～11.0log CFU/mL、6.5～10.5log CFU/mL、7.0～10.0log CFU/mL、7.5～9.5log CFU/mL、8.0～9.0log CFU/mL的细胞数。所述含酒精饮料内所含的益生菌可更尤其具有约7.0log CFU/mL的细胞数。
根据一个具体方面，所述含酒精饮料可进一步含有啤酒花。就本发明的目的而言，所述啤酒花包括啤酒花和/或其衍生物。该啤酒花可以为任何合适的含异构化α酸的啤酒花。所述啤酒花可具有任何合适的形式，包括但不限于啤酒花球果、啤酒花颗粒、啤酒花树脂、啤酒花粉末、异构化的啤酒花提取物等。
所述啤酒花可以为任何合适的啤酒花。该啤酒花例如可以为异构化的啤酒花提取物。该啤酒花可具有合适的苦度。该啤酒花可尤其具有≤30IBU的苦度。该苦度可更尤其为0～30IBU、3～27IBU、5～25IBU、7.5～20IBU、9～18IBU、10～16IBU、12～15IBU、13～14IBU。IBU为国际苦度单位，用于表示含酒精饮料内的啤酒花化合物的浓度。IBU尤其为含酒精饮料内异葎草酮的百万分率(ppm)。
所述含酒精饮料可具有合适的pH值。该含酒精饮料的pH值例如可以为2～6。该pH值可尤其为2.5～5.5、3～5、3.5～4.5、3.7～4.0。该pH值可更尤其为约3～5。
所述含酒精饮料可具有合适的白利糖度或其比重当量。白利糖度为含酒精饮料的含糖量量度。例如，1°Bx表示100g含酒精饮料含1g蔗糖。相应地，在含酒精饮料中，白利糖度越高，则酒精含量也可越高。所述含酒精饮料的白利糖度可以为4～20°Bx。就本发明的目的而言，提及所述含酒精饮料的白利糖度之处是指含酒精饮料内所含麦芽汁或果汁的白利糖度。所述含酒精饮料的白利糖度可尤其为5～18°Bx、6～15°Bx、7～12°Bx、8～10°Bx、9～9.5°Bx。该白利糖度可更尤其为约5～15°Bx。
所述含酒精饮料可通过保存于合适的温度而将所述益生菌保持于合适的水平。该含酒精饮料可例如保存于约≤20℃的温度。优选地，该含酒精饮料可保存于≤10℃的温度。该含酒精饮料可尤其保存于约1～10℃、5～8℃、6～7℃的温度。该含酒精饮料可更尤其保存于约1～5℃的温度。
根据本发明的第二方面，提供一种形成第一方面所述的含酒精饮料的方法，该方法包括：
-提供麦芽汁或果汁；
-向该麦芽汁或果汁内添加益生菌；
-向该麦芽汁或果汁内添加酵母；以及
-将该麦芽汁或果汁在预设温度下发酵预设时间长度，以形成所述含酒精饮料。
所述麦芽汁或果汁可以为适于本发明目的的任何麦芽汁或果汁。就本发明的目的而言，麦芽汁可包括但不限于已经过加热、煮沸和冷却处理的发芽大麦和/或其辅料如小麦、玉米、黑麦、大米和水等。该麦芽汁还可含有添加的糖分。就本发明的目的而言，果汁可包括但不限于已经过加热、煮沸和冷却处理的葡萄汁等果汁。该果汁还可含有添加的糖分。
添加至所述麦芽汁或果汁内的益生菌可以为任何合适的益生菌。该益生菌可例如为如上所述的益生菌。该益生菌的添加可包括：向所述麦芽汁或果汁添加合适量的益生菌。所述益生菌的添加量可例如为1～9log CFU/mL。该益生菌的添加量可尤其为约2～8logCFU/mL、3～7log CFU/mL、4～6log CFU/mL、4.5～5log CFU/mL。该益生菌的添加量可更尤其为5～7log CFU/mL。
添加至所述麦芽汁或果汁内的酵母可以为适于本发明目的的任何酵母。该酵母可以为酵母属酵母、非酵母属酵母或其组合。根据一个具体方面，所述酵母可以为酵母属酵母。酵母属酵母例如包括但不限于酿酒酵母、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)以及布拉迪酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae var.boulardii)。根据另一具体方面，所述酵母可以为非酵母属酵母。非酵母属酵母例如包括但不限于戴尔有孢圆酵母、耐热拉茜斯酵母、克鲁维毕赤酵母以及美极梅奇酵母。向所述麦芽汁或果汁内添加酵母尤其包括：添加酿酒酵母。
所述酵母的添加可包括向所述麦芽汁或果汁内添加合适量的酵母。所述酵母的添加量可例如为1～9log CFU/mL。该添加量可更尤其为约5～7log CFU/mL。
该方法可进一步包括向所述麦芽汁或果汁内添加啤酒花。添加至该麦芽汁或果汁内的啤酒花可以为上述任何合适的啤酒花。该啤酒花的添加可包括：向所述麦芽汁或果汁内添加合适量的啤酒花。所述啤酒花的添加量可例如为≤30IBU。该啤酒花的添加量可尤其为0～30IBU、3～27IBU、5～25IBU、7.5～20IBU、9～18IBU、10～16IBU、12～15IBU、13～14IBU。该啤酒花的添加量可更尤其为约7.5IBU。
所述益生菌的添加和酵母的添加可同时或先后进行。
根据一个具体方面，所述益生菌的添加和所述酵母的添加可同时进行。随后，可在合适条件下进行所述发酵。该发酵可例如包括：将所述麦芽汁或果汁在合适的温度下发酵合适的时间长度。该温度可在所述发酵过程当中的任何时间点变更。所述发酵可尤其包括：将所述麦芽汁或果汁在第一温度下发酵第一时间长度；随后将该麦芽汁或果汁在第二温度下发酵第二时间长度。该方法可进一步包括：在所述第二时间长度结束时，添加啤酒花。
根据一个具体方面，所述益生菌的添加和所述酵母的添加可先后进行。所述酵母的添加可尤其在所述益生菌添加之后的第三时间长度后进行。随后，可在合适条件下进行发酵。该发酵可例如包括：将所述麦芽汁或果汁在合适的温度下发酵合适的时间长度。该温度可在所述发酵过程当中的任何时间点变更。该发酵可尤其包括：将所述麦芽汁或果汁在第三温度下发酵第四时间长度；随后将该麦芽汁或果汁在第四温度下发酵第五时间长度。该方法可进一步包括：在所述第五时间长度结束时，添加啤酒花。
所述第一时间长度、第二时间长度、第三时间长度、第四时间长度和第五时间长度可以为任何合适的时间长度。所述各时间长度可根据添加至所述麦芽汁或果汁内的益生菌和酵母而进行选择。所述第一时间长度、第三时间长度和第四时间长度可例如为1～5天，优选1～2天。所述第二时间长度和第五时间长度可以为8～30天。
所述第一温度、第二温度、第三温度和第四温度可以为适于本发明目的的任何温度。所述第一温度和第三温度可例如为同一温度。所述第二温度和第四温度可例如为同一温度。
具体而言，所述第一温度和第三温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为任何适于为益生菌的生长提供有利条件且可使得益生菌达到最大细胞数量的温度。所述第一温度和第三温度可例如为25～35℃。更具体而言，所述第一温度和第三温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为约30℃。
具体而言，所述第二温度和第四温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为任何适于实现酵母生长的温度。所述第二温度和第四温度可例如为13～25℃。更具体而言，所述第二温度和第四温度可以为同一温度或不同温度，而且可以为约20℃。
在一种实施方式中，所述方法包括向麦芽汁内同时添加益生菌和酵母。该麦芽汁可不添加啤酒花。在第一温度下，所述益生菌和酵母在麦芽汁内共同接种第一时间长度。所述第一温度可例如为约25～35℃。该第一温度可尤其为约30℃。该第一时间长度可以为约1～5天。该第一时间长度可尤其为2天。随后，在第二温度下，进行第二时间长度的发酵。所述第二温度可以为约13～25℃。该第二温度可尤其为约20℃。该第二时间长度可以为约8～30天。该第二时间长度可尤其为8天、12天或21天。在该第二时间长度结束时，向发酵后的麦芽汁内添加合适浓度的异构化啤酒花提取物。该啤酒花提取物可例如为7.5IBU的啤酒花提取物。随后，所形成的含酒精饮料保存于合适的温度下，如约1～5℃。
在另一实施方式中，该方法包括：先向麦芽汁内添加益生菌；在第三时间长度之后，再添加酵母。所述麦芽汁可不添加啤酒花。所述第三时间长度可以为1～5天。所述酵母可尤其在向所述麦芽汁内添加益生菌后的1天或2天后添加。在第三温度下，所述益生菌可在所述麦芽汁内接种第四时间长度。该第三温度可以为约25～35℃。该第三温度可尤其为约30℃。所述第四时间长度可以为约1～5天。该第四时间长度可尤其为2天。随后，在第四温度下进行第五时间长度的发酵。该第四温度可以为约13～25℃。该第四温度可尤其为约20℃。所述第五时间长度可以为约8～30天。该第五时间长度可尤其为8天或21天。在该第五时间长度结束时，向发酵后的麦芽汁内添加合适浓度的异构化啤酒花提取物。该啤酒花提取物可例如为7.5IBU的啤酒花提取物。随后，所形成的含酒精饮料保存于合适的温度下，如约1～5℃。
根据一个具体方面，在所述发酵后，可将形成的含酒精饮料保存于合适的温度。举例而言，本发明的方法形成的所述含酒精饮料可保存于≤20℃的温度。该含酒精饮料可尤其保存于约≤10℃的温度。该含酒精饮料可更尤其保存于约1～5℃的温度。
根据另一方面，提供上述含酒精饮料在医药方面的用途。本发明含酒精饮料的该用途可尤其为改善含酒精饮料消费者的肠道健康和/或消化状况的用途。
虽然以上对例示实施方式进行了描述，但是本领域技术人员可以理解的是，在不脱离本发明的前提下，还可做出各种变化。
在上述本发明概述的基础上，通过参考以下实施例，可更加易于理解本发明。以下实施例用于说明，并不旨在构成限制。
实施例
本实施例中使用的所有材料如下：
通过以去离子水对干的淡麦芽提取物(Thomas Coopers Breweries，澳大利亚南澳大利亚州)进行12.2％(质量体积百分比)复水而制得甜麦芽汁，然后通过20分钟的煮沸而实现热析出。随后，在该麦芽汁内混入2.0％(质量体积百分比)的右旋糖(ThomasCoopers Breweries，澳大利亚南澳大利亚州)和0.2％(质量体积百分比)的Cascade啤酒花颗粒(Yakima Chief-Hopunion，美国亚基马)，并继续煮沸60分钟。在此之后，加入Cold IceMountain蒸馏水(Fraser and Neave,Limited，马来西亚)，直至总重量达到原始批次重量，然后将麦芽汁以冰浴冷却约60分钟的时间，以实现冷析出。其后，将冷却后的麦芽汁经双层纱布滤入250mL或500mL的带盖玻璃瓶中，并进行15分钟的95℃巴氏灭菌，以确保麦芽汁达到无菌。其中，通过马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(英国汉普郡)检验麦芽汁是否达到无菌。在制备用作预培养物以及用于同时和先后发酵阶段的麦芽汁时，其内未添加啤酒花。
实施例1–异α酸对益生菌的抗菌作用
为了了解啤酒花酸对益生菌的抗菌作用以及在有啤酒花啤酒内掺入益生菌的难度，将副干酪乳杆菌L26、副干酪乳杆菌Lpc-37以及鼠李糖乳杆菌HN001这三种不同益生菌株与带啤酒花麦芽汁发酵，并记录其生长状况和稳定性。在筛选阶段，将副干酪乳杆菌L26、副干酪乳杆菌Lpc-37以及鼠李糖乳杆菌HN001在盛有200mL带啤酒花麦芽汁的500mL带盖玻璃瓶内进行三组平行发酵。每一玻璃瓶内均先接种1％(体积百分比)的相应益生菌预培养物，然后在37℃下静置温育10天。
图1所示为10天发酵阶段内副干酪乳杆菌L26、副干酪乳杆菌Lpc-37以及鼠李糖乳杆菌HN001在带啤酒花麦芽汁内存活状况变化。所有三种益生菌株的细胞数均逐渐下降，并在第7天时降至无法检测的水平。细胞的死亡可归因于啤酒花异α酸的存在，这是因为在接种于无啤酒花麦芽汁的预培养物中生长时，所述益生菌在无啤酒花麦芽汁内能够至少达到约为8.50log CFU/mL的高存活细胞数(数据未示出)。因此，细胞数的下降表明，所有的三种益生菌株均无法在带啤酒花麦芽汁内存活，因此对啤酒花不具有耐受性。益生菌细胞在带啤酒花麦芽汁内的死亡并不令人意外，这是因为此类细菌并不具备能够使得自身通过良好地适应啤酒内的环境而实现生长和存活的复杂机制。
副干酪乳杆菌L26的存活能力最高，其次分别为副干酪乳杆菌Lpc-37和鼠李糖乳杆菌HN001。副干酪乳杆菌L26在第4天仍保有5.13log CFU/mL的可测细胞数，而副干酪乳杆菌Lpc-37和鼠李糖乳杆菌HN001在第2天的细胞数分别为6.12log CFU/mL和4.13log CFU/mL。由此可见，在完全死尽之前，副干酪乳杆菌L26具有最高的啤酒花异α酸耐受度。由于副干酪乳杆菌L26在带啤酒花麦芽汁内展现出最高的存活能力，因此如以下各例所示，该菌株用于进一步与酵母发酵。
实施例2–采用不同接种方案的益生菌啤酒发酵
2.1酿酒酵母S-04与副干酪乳杆菌L26的共同接种
在共同发酵过程中，在盛有400mL的无啤酒花麦芽汁的500mL带盖玻璃瓶内进行三组平行发酵。其中，副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04酵母分别以大约6.72log CFU/mL和5.00log CFU/mL的量共同培养，以有利于副干酪乳杆菌L26的生长。对照物分别包括以相同接种量接种至无啤酒花麦芽汁内的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04预培养物。首先，在第0天至第2天内进行30℃的静态发酵，以为益生菌的生长以及益生菌能够达到最大细胞数提供有利条件。随后，在第2天至第10天内，以20℃的温度继续发酵，以促进酵母的生长。
十天发酵后，对上述样品进行保存期测试(保存阶段)。在第10天时，以与实施例1相同的啤酒花浓度，向所述无啤酒花啤酒内添加27国际苦度单位(IBU)的异构化啤酒花提取物(Brouwland，比利时贝弗洛)。为了评价冷藏保存温度和环境保存温度对益生菌存活能力的影响，各样品分别保存于5℃和25℃下。对于各组发酵物，均以副干酪乳杆菌L26的板上菌落数降至7.0log CFU/mL以下的时间点作为保存期的结束时间点。
所得结果示于图2。从图2可知，在未添加啤酒花提取物的发酵阶段，单独培养的副干酪乳杆菌L26(无酵母)能够在第10天，在无啤酒花存在的条件下实现高达9.06log CFU/mL的稳定期细胞数。这一结果进一步证实了异α酸对副干酪乳杆菌L26的抗菌作用。在存在酵母的状况下，副干酪乳杆菌L26仍然能够实现并在整个10天的发酵阶段维持高的稳定期细胞数，其中，第10天所记录的细胞数为8.77log CFU/mL。这一结果表明，副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母S-04能够在生长期和稳定期过程中成功地共存发酵。
从图2可知，在第10天添加啤酒花提取物后，在25℃的保存温度下，单独培养的副干酪乳杆菌L26细胞数在一天的时间内变至无法测定的水平，而共同培养的副干酪乳杆菌L26的细胞数在第13天时降至7.0log CFU/mL以下。由此可见，在25℃的保存温度下，酿酒酵母S-04的存活力增强效果并不特别明显。然而，在5℃的保存温度下，该存活力增强效果变得较为显著。5℃下，单独培养的副干酪乳杆菌L26的细胞数在第16天时降至7.0log CFU/mL以下，而共同培养的副干酪乳杆菌L26能够在整个保存期间维持高存活细胞数，并在第32天时才降至作为标杆值的7.0log CFU/mL(实现健康方面益处所需的值)之下。由此可见，存活力增强效果源于冷藏温度和酵母的存在此两因素。
表1所示为带啤酒花啤酒在不同保存温度下的非挥发特性。如表1所示，副干酪乳杆菌L26所产生的乳酸使得接种有副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04的啤酒具有低pH值(3.52～3.64)。在乳酸(5.08～5.15g/L)的作用下，所得啤酒将具有酸味。
表1：带啤酒花啤酒在副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04共同接种后在25℃和5℃保存时的非挥发特性的变化
#所有的值均为通过单因素分析和三次平行发酵实验采用Tukey显著性检验获得的平均值±标准偏差。
a,b,c,d 95％置信水平的方差统计分析(ANOVA)，其中相同的字母表示无显著差异。
&表示低于LOQ(定量限度)但是高于LOD(检测限度)
*0.00±0.00＝未检测到
2.2酵母与益生菌的先后接种
先后发酵阶段中，研究在发酵第二天添加酿酒酵母S-04对副干酪乳杆菌L26存活能力的影响，其目的在于确定酵母的延迟添加是否会改善益生菌的存活能力。
先后接种发酵的步骤与共同接种(实施例2.1)类似。其中，在盛有400mL的无啤酒花麦芽汁的500mL带盖玻璃瓶内进行三组平行发酵，然后在每一玻璃瓶内添加副干酪乳杆菌L26(接种量为1％(体积百分比))，并在发酵的第二天添加1％(体积百分比)的酿酒酵母S-04。此外，还以相同的接种量对副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04进行单独培养，以作为对照物。首先，在第0天至第2天内进行30℃的静态发酵，以为益生菌的生长以及益生菌能够达到最大细胞数提供有利条件。随后，在第2天至第10天内，以20℃的温度继续发酵，以促进酵母的生长。
十天发酵后，对上述样品进行保存期测试。该过程与实施例2.1所述的共同接种实验的过程类似，而且使用相同的异构化啤酒花提取物添加量、保存温度以及保存期结束时间点判定条件。
图3所示为副干酪乳杆菌L26在10天的先后发酵阶段内在无啤酒花麦芽汁内的生长动力学以及随后在添加异构化啤酒花提取物后的先后发酵保存期间内的存活动力学。
如图3所示，先后发酵的生长动力学与共同发酵的生长动力学类似。当不存在酵母时，单独培养的副干酪乳杆菌L26能够在无啤酒花存在的条件下，在10天时实现高达8.95log CFU/mL的稳定期细胞数，从而证实未添加啤酒花的无啤酒花麦芽汁可作为副干酪乳杆菌L26的合适生长介质。当存在酵母时，类似地，副干酪乳杆菌L26仍然能够在10天时实现高达8.99log CFU/mL的存活细胞数，从而表明酵母并不会阻碍副干酪乳杆菌L26的生长。
从图3可以看出，单独培养和先后培养的副干酪乳杆菌L26的细胞数均在25℃下保存的1天内降至7.0log CFU/mL以下。与共同接种发酵的情形类似，酿酒酵母S-04在5℃下具有更佳的存活力增强效果。在5℃下，单独培养的副干酪乳杆菌L26的细胞数在第16天降至7.0log CFU/mL以下，而共同培养的副干酪乳杆菌L26的细胞数在第19天时才降至上述细胞数以下。由此可见，存活力增强效果源于冷藏温度和酵母的存在此两因素。
副干酪乳杆菌L26在保存过程中的死亡原因可能在于啤酒花提取物的添加，这是因为在第10天时未添加异构化提取物且保存于5℃下的单独培养副干酪乳杆菌L26第22天时仍保有8.88log CFU/mL的存活细胞数(数据未示出)。
表2所示为带啤酒花啤酒在不同保存温度下的非挥发特性。从表2可以看出，副干酪乳杆菌L26所产生的大量乳酸(8.25～8.39g/L)使得接种有副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04的啤酒具有低pH值(3.30～3.31)。乳酸的累积使得最终的益生菌啤酒产品产生酸味。
表2：带啤酒花啤酒在副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04先后接种后在25℃和5℃保存时的非挥发特性的变化
#所有的值均为通过单因素分析和三次平行发酵实验采用Tukey显著性检验获得的平均值±标准偏差。
a , b,c,d 95％置信水平的方差统计分析(ANOVA)，其中相同的字母表示无显著差异。
可以看出，与实施例2.1的共同接种方案相比，冷藏保存和酵母添加对益生菌存活能力的协同作用被削弱。
实施例3–益生菌存活能力的增强与保存期的延长
由于较长的保存期能够减少长的冷链分销网络导致的损失以及未售出的啤酒所征的高额酒精税导致的损失，因此该实施例对啤酒花含量对益生菌的影响进行研究。
从实施例1可知，啤酒花异α酸对益生菌的存活力具有负面影响。由于副干酪乳杆菌L26在与酿酒酵母S-04共同接种时的存活能力高于其与酿酒酵母S-04先后接种(实施例2)时的存活能力，因此本实施例采用益生菌和酵母的共同发酵方案。
本实施例所采用的方法与实施例2.1类似，仅采用的啤酒花提取物含量。其中，先在盛有600mL无啤酒花麦芽汁的1L带盖玻璃瓶内进行酿酒酵母S-04(酵母)与副干酪乳杆菌L26(益生菌)的平行三组发酵，然后在每一玻璃瓶内接种0.5％(体积百分比)的酵母预培养物以及1％(体积百分比)的益生菌预培养物。随后，先在30℃下静置温育2天，然后在20℃下静置温育8天。
在第10天时，在上述无啤酒花啤酒内分别添加7.5国际苦度单位(IBU)、15IBU以及22.5IBU的异构化啤酒花提取物(Brouwland，比利时贝弗洛)。与此同时，还设置平行三组不添加啤酒花的啤酒。各样品在保存阶段分别保存于5℃和25℃。对于各组发酵物，均以副干酪乳杆菌L26的板上菌落数降至7.0log CFU/mL以下的时间点作为保存期的结束时间点。
图4所示为与酿酒酵母S-04共同接种的副干酪乳杆菌L26在具有不同IBU水平的带啤酒花麦芽汁内的5℃下生长和存活动力学。在添加啤酒花提取物后的保存过程中，益生菌的存活状况随啤酒花浓度的下降而改善，其原因预计在于作为细菌生长抑制剂的啤酒花异α酸的减少使得益生菌的周边环境对益生菌存活的阻力降低。在22.5IBU和15IBU下，啤酒的保存期分别为6天和10天。在7.5IBU下，益生菌保持7.0log CFU/mL以上细胞数的时间为1个月，长于图2所示22天的保存期。在无啤酒花啤酒(0IBU)中，益生菌保持8log CFU/mL以上细胞数的时间至少为4个月。
图5所示为与酿酒酵母S-04共同接种的副干酪乳杆菌L26在具有不同IBU水平的带啤酒花麦芽汁内的25℃下生长和存活动力学。与预期状况一致，25℃保存的益生菌样品存活率低于冷藏保存的样品存活率。与冷藏保存时的至少4个月(图4)相比，所有添加啤酒花的样品的益生菌细胞数在保存3天后降至7.0log CFU/mL以下，且未添加啤酒花的样品保持7.0log CFU/mL以上的益生菌细胞数的时间仅为38天左右。这一结果表明，冷链分销和保存对维持该益生菌啤酒内的益生菌生存能力具有重要作用。
图6A和图6B所示分别为发酵和5℃和25℃保存过程中的pH值变化。其中，不同样品呈现出类似的pH值。各样品的低pH值(约3.5)表明，益生菌产生的乳酸使得啤酒具有酸味。
图7A和图7B所示分别为发酵和5℃和25℃保存过程中的白利糖度变化。其中，不同样品具有类似的白利糖度，这表示啤酒花浓度的差异并未显著影响酵母的发酵能力及养分利用率。
由上可知，益生菌的存活能力随啤酒花含量的降低而增大，25℃下的啤酒花抗微生物作用大于5℃下的啤酒花抗微生物作用。
实施例4–通过在酵母发酵后添加益生菌而变更发酵过程
在盛有220mL带啤酒花麦芽汁的250mL带盖玻璃瓶内实施三组平行发酵。其中，啤酒花浓度相当于添加27IBU的异构化啤酒花提取物。在每一玻璃瓶内添加酿酒酵母S-04(接种量为0.5％(体积百分比))后，在20℃下发酵10天，然后在样品中添加1％(体积百分比)的副干酪乳杆菌L26。随后，实施保存期测试，其过程与实施例2.1所述的共同接种实验类似，并采用相同的保存温度和保存期结束时间点判定条件。
图8所示为所添加的副干酪乳杆菌L26在5℃和25℃保存过程中的存活状况。在第10天接种益生菌后，立刻在5℃和25℃下保存。结果显示，副干酪乳杆菌L26在5℃下比在25℃下具有更高的存活能力，而且5℃和25℃下第42天时的细胞数分别为6.67log CFU/mL和5.27log CFU/mL。这进一步证实，为了保持益生菌生存能力，无论所采用的接种方案如何，均需要对益生菌啤酒进行低温保存和冷链分销。
图9和图10所示为发酵和保存期间的pH值和白利糖度测定值。其中，白利糖度测定值与实施例2.1中的共同发酵样品(表1)类似。
从图8可看出，冷藏保存期间，虽然副干酪乳杆菌L26未呈现增长，但是其数量在至少1个月保持不变，其原因可能在于酵母将啤酒花酸封隔，从而为益生菌的存活创造更加有利的环境。此外，如图9所示，与实施例2.1的共同发酵样品(表1)相比(pH值为3.5)，本实施例所得的pH值更高(pH值为4.6～4.7)。pH值的提高可降低啤酒花酸的效力，因此对益生菌的存活总体具有正面作用。
因此，依据图8所得结果，由于5℃保存下的益生菌细胞数相对保持不变，因此可制得一款在初始酵母发酵阶段之后加入更高剂量(例如，CFU/mL高于7log CFU/mL这一最低剂量，如8log(CFU/mL)益生菌的益生菌啤酒。如此，与令益生菌与酵母一道发酵的情形相比，所得啤酒的酸性较低，从而获得更加令人喜爱和接受的风味。
实施例5–采用不同益生菌/酵母组合的益生菌啤酒发酵
实施例2～4专注于副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04这一益生菌/酵母组合。本实施例对其他益生菌/酵母组合进行研究，以确定是否可通过其他益生菌和酵母菌株获得其他款的所述益生菌啤酒。所述益生菌/酵母组合包括酿酒酵母S-04与其他乳杆菌属益生菌的组合(实施例5.1)、副干酪乳杆菌L26与其他非酵母属酵母的组合(实施例5.2)以及副干酪乳杆菌L26与酿酒酵母W34/70拉格啤酒酵母的组合(实施例5.3)。
5.1酿酒酵母S-04与其他乳杆菌属益生菌发酵
通过鼠李糖乳杆菌HN001，研究啤酒花的抗菌作用(实施例1)。其中，虽然单独的鼠李糖乳杆菌HN001易受啤酒花抗菌作用的影响，但不知其是否能够与副干酪乳杆菌L26(实施例2)类似，在存在酵母的情况下具有更高的存活能力。因此，在本实施例中，在以酿酒酵母S-04和鼠李糖乳杆菌HN001将无啤酒花麦芽汁发酵后，在发酵结束时加入7.5IBU的啤酒花提取物，并在5℃和25℃下保存。此外，本实施例还对另一益生菌株——嗜酸乳杆菌NCFM能否在存在酵母的情况下获得更高的存活能力进行了研究。
其中，在盛有550mL无啤酒花麦芽汁的1L带盖玻璃瓶内进行三组平行发酵。该发酵为副干酪乳杆菌L26、鼠李糖乳杆菌HN001及嗜酸乳杆菌NCFM与酿酒酵母S-04的共同发酵。每一玻璃瓶内的益生菌接种量为1％(体积百分比)，酵母接种量为0.5％(体积百分比)。其中，先在30℃下静态发酵2天，然后在20℃下发酵8天。
发酵10天后，在每一样品中添加7.5IBU的异构化啤酒花提取物。保存期测试方法与实施例2.1所述的共同接种实验类似，并采用相同的保存温度和保存期结束时间点判定条件。
图11所示为副干酪乳杆菌L26、鼠李糖乳杆菌HN001及嗜酸乳杆菌NCFM与酿酒酵母S-04在无啤酒花麦芽汁内共同接种后添加7.5IBU啤酒花提取物并在5℃下保存时的生长和存活状况。十天发酵后，鼠李糖乳杆菌HN001和嗜酸乳杆菌NCFM均实现较高的细胞数(分别为8.06log CFU/mL和8.49log CFU/mL)，从而表明这两种菌株在共同发酵过程中均能够与酿酒酵母S-04共存。
从图11可知，鼠李糖乳杆菌HN001在低温保存过程中的存活能力最低，4天冷藏后的细胞数低于7.0log CFU/mL，而副干酪乳杆菌L26的细胞数在1个月保存后降至7.0logCFU/mL，这进一步证实了上文实施例3的结果(图4)。嗜酸乳杆菌NCFM细胞数在低温保存条件下维持7.0log CFU/mL以上的时间为2个月(在保存第57天时降至7log CFU/mL以下)，表现出良好的应用前景。这一保存时间大幅长于副干酪乳杆菌L26的1个月冷藏保存期(嗜酸乳杆菌NCFM和副干酪乳杆菌L26均处于7.5IBU水平时)，因此嗜酸乳杆菌NCFM也可用于制造益生菌啤酒。已有证据表明，嗜酸乳杆菌NCFM能够在健康人群和患病人群的胃肠道中存活，并且具有长时间的人类安全消费历史。此外，人体试验表明，嗜酸乳杆菌NCFM具有多项健康方面的益处，包括但不限于降低小儿腹泻发生率，在抗生素治疗中使肠道菌群稳定化以及改善小肠细菌过度生长症状。因此，在益生菌啤酒中掺入嗜酸乳杆菌NCFM可以为消费者提供一种对健康更加有利的替代选择。
图12所示为副干酪乳杆菌L26、鼠李糖乳杆菌HN001及嗜酸乳杆菌NCFM与酿酒酵母S-04在无啤酒花麦芽汁内共同接种后添加7.5IBU啤酒花提取物并在25℃下保存时的生长和存活状况。可以看出，与5℃下的趋势一致(图11)，鼠李糖乳杆菌HN001的存活能力最低，以下依次为副干酪乳杆菌L26和嗜酸乳杆菌NCFM。类似地，啤酒花在更高温度下具有更加显著的抗菌作用，其中，鼠李糖乳杆菌HN001、副干酪乳杆菌L26以及嗜酸乳杆菌NCFM的细胞数分别在保存第1天、第4天、第9天时降至7.0log CFU/mL这一标杆值之下。
图13A和图13B所示为酿酒酵母S-04与鼠李糖乳杆菌HN001、嗜酸乳杆菌NCFM以及副干酪乳杆菌L26的发酵过程以及分别在5℃和25℃下保存过程中的pH测量值，而图14A和图14B所示分别为5℃和25℃保存温度下的相应白利糖度测量值。虽然各样品之间具有类似的pH测量值，但鼠李糖乳杆菌HN001具有更高的白利糖度测量值。这表明，与嗜酸乳杆菌NCFM和副干酪乳杆菌L26相比，鼠李糖乳杆菌HN001和酵母在发酵阶段的糖分利用量更低。
5.2副干酪乳杆菌L26与其他非酵母属酵母发酵
上述实施例结果表明，酿酒酵母S-04具有改善副干酪乳杆菌L26在带啤酒花啤酒内存活状况的能力。随着人们对新种类啤酒的需求越来越高，本实施例对通过共同培养副干酪乳杆菌L26与非酵母属酵母而获得益生菌啤酒的可能性以及此类酵母的益生菌存活力增强效果进行了研究。
其中，以与实施例2.1的方式进行共同发酵，并以戴尔有孢圆酵母Prelude或美极梅奇酵母Flavia替代酿酒酵母S-04。该发酵在盛有300mL无啤酒花麦芽汁的500mL玻璃瓶内进行。在共同培养中，所述无啤酒花麦芽汁内接种6.69log CFU/mL的副干酪乳杆菌L26以及5.63log CFU/mL的戴尔有孢圆酵母Prelude或5.08log CFU/mL的美极梅奇酵母Flavia。此外，还通过在所述无啤酒花麦芽汁内接种与上述相同量的酵母而制备酵母单独培养物。接种后的麦芽汁先在第0天至第2天内在30℃静态条件下温育，以有利于副干酪乳杆菌L26的生长，然后在第2天至第12天内将发酵温度降至20℃，以促进酵母的生长。
发酵12天后，在啤酒内添加异构化的啤酒花提取物(Brouwland，比利时贝弗洛)，以将苦度调至7.5IBU。带啤酒花啤酒的保存期测试分别在5℃和25℃下进行，测试方法与实施例3同。
图15所示为副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude或美极梅奇酵母Flavia在无啤酒花麦芽汁内共同培养时的12天发酵期内及5℃保存过程中的生长和存活动力学。副干酪乳杆菌L26在上述两种非酵母属酵母存在条件下的生长状况类似于该益生菌与酿酒酵母S-04共同培养时的生长状况(实施例2.1；图2)。发酵后，啤酒内达到的存活益生菌细胞数为8.83～8.97log CFU/mL，这表明戴尔有孢圆酵母Prelude和美极梅奇酵母Flavia在发酵过程中对副干酪乳杆菌L26无抑制作用。
在5℃保存条件下，共同培养所得啤酒内的副干酪乳杆菌L26数在至少8天内保持于7.0log CFU/mL以上，并随后于第27天时降至6.69～6.76log CFU/mL。如实施例1所述，在带啤酒花啤酒内单独培养的副干酪乳杆菌L26这一益生菌的细胞数在保存第5天时降至最低治疗水平(7.0log CFU/mL)以下。由此可见，非酵母属酵母的存在同样可以改善所述益生菌在啤酒内的存活状况。然而，与共同培养时能够使副干酪乳杆菌L26细胞数在1个月内保持于7.0log CFU/mL以上(实施例3，图4；实施例5.1，图11)的酿酒酵母S-04相比，戴尔有孢圆酵母Prelude和美极梅奇酵母Flavia的益生菌存活力增强效果较低。
图16所示为副干酪乳杆菌L26与戴尔有孢圆酵母Prelude或美极梅奇酵母Flavia在带啤酒花啤酒内共同培养并随后在25℃下保存时的存活细胞数的变化。当啤酒在25℃下保存时，存活益生菌数在4天内从8.83～8.97log CFU/mL降至低于3log CFU/mL。这一结果与以上各实施例中得到的结果一致，即酵母在带啤酒花啤酒中对副干酪乳杆菌L26的存活力增强效果在室温下最低(图2、图3、图5、图8、图12)。
图17A和图17B所示为12天发酵期间以及分别在5℃和25℃下保存期间的pH测量值，而图18A和图18B所示分别为5℃和25℃保存温度下的相应白利糖度测量值。虽然各样品之间具有类似的pH测量值，但鼠李糖乳杆菌HN001具有更高的白利糖度测量值。这表明，与嗜酸乳杆菌NCFM和副干酪乳杆菌L26相比，鼠李糖乳杆菌HN001和酵母在发酵阶段的糖分利用量更低。
5.3副干酪乳杆菌L26与其他酿酒酵母W34/70拉格啤酒酵母发酵
以上，采用了酿酒酵母S-04这一艾尔啤酒酵母与副干酪乳杆菌L26在无啤酒花麦芽汁内进行共同发酵和先后发酵(实施例2)。在添加异构化啤酒花提取物后进行冷藏期间，共同培养的副干酪乳杆菌L26保持7.0log CFU/mL以上高存活细胞数的时间为22天，而先后培养的保持时间为9天。
由于主流的市售啤酒为拉格啤酒，因此本实施例对酿酒酵母W-34/70这一拉格啤酒酵母菌株与副干酪乳杆菌L26的共同接种和先后接种进行研究。
所使用方法与实施例2.1类似。其中，在盛有350mL无啤酒花麦芽汁的500mL带盖玻璃瓶内进行三组平行发酵。在共同发酵样品中，无啤酒花麦芽汁的副干酪乳杆菌L26接种量为1％(体积百分比)，酿酒酵母W-34/70的接种量为1％(体积百分比)。在先后发酵样品中，无啤酒花麦芽汁的副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母W-34/70的接种量与上同，但酿酒酵母W-34/70在发酵第1天时加入。除此之外，还制备单独培养的酿酒酵母W-34/70，作为对照物。发酵时，先在第0天至第1天进行30℃静态发酵，以为益生菌的生长提供有利条件，然后在第1天至第22天内将温度降至20℃，以令酵母生长。
发酵22天后，在所述无啤酒花啤酒内加入7.5IBU剂量的异构化啤酒花提取物(Brouwland，比利时贝弗洛)，并随后将该带啤酒花啤酒在5℃和25℃下保存，并评价副干酪乳杆菌L26的存活能力。
图19和图20所示为副干酪乳杆菌L26在与酿酒酵母W-34/70发酵期间以及分别在5℃和25℃下保存过程中的生长和存活状况。可以看出，在22天的发酵期间，副干酪乳杆菌L26能够与酿酒酵母W-34/70这一拉格啤酒酵母共存，而且共同接种和先后接种样品均保持高于8.60log CFU/mL的细胞数。
在添加7.5IBU异构化啤酒花提取物后的保存期间，共同接种和先后接种样品内的副干酪乳杆菌L26在5℃保存条件下依然维持8.60log CFU/mL以上的细胞数4天。与此相比，所有25℃保存样品内的副干酪乳杆菌L26细胞数均在上述时间段内降至7.0log CFU/mL以下，从而进一步证实冷链分销和冷藏保存对益生菌啤酒维持益生菌生存能力的重要性。
从图20的数据还可知，25℃保存第4天时，先后接种样品已无法检测到益生菌细胞数，而共同接种样品的副干酪乳杆菌L26细胞数仍达6.63log CFU/mL。这表明，共同接种法在延长益生菌存活能力方面优于先后接种法。这一结果与实施例2的结果(即与酿酒酵母S-04共同培养的副干酪乳杆菌L26维持7.0log CFU/mL以上高存活细胞数的时间为22天，而先后培养维持的时间为9天)一致。这一效果在5℃保存样品中并不显著，其中，虽然先后接种法的益生菌细胞数微微低于共同接种法的细胞数，但共同接种和先后接种样品在31天存储后的益生菌细胞数没有显著差异(图19)。
在冷藏下，益生菌细胞数在保存第31天时降至7.0log CFU/mL这一标杆值以下。这表明，酿酒酵母W34/70的益生菌存活力增强效果在程度上与酿酒酵母S-04类似，后者的保存期为1个月(实施例3，图4；实施例5.1，图11)。这一结果表明，拉格类型的益生菌啤酒同样可以生产。
图21A和图21B所示为22天发酵期间以及分别在5℃和25℃下保存期间的pH测量值，而图22A和图22B所示分别为5℃和25℃保存温度下的相应白利糖度测量值。含副干酪乳杆菌L26样品的pH测量值为3.55～3.56，类似于通过副干酪乳杆菌L26和酿酒酵母S-04发酵获得的益生菌啤酒的测量值(实施例2，表1和表2)。
从图22A和22B可知，所有样品的白利糖度测量值均缓慢下降，并在所述22天的发酵期间结束时达到平稳状态。所有样品的白利糖度测量值停止进一步下降这一现象说明酵母实现了糖分的完全利用，并标志着22天之后的保存期间的起点。
Claims (25)
1.一种包括益生菌的含酒精饮料。
2.根据权利要求1所述的饮料，其特征在于，所述饮料的酒精含量≥0.5％体积百分比。
3.根据权利要求1或2所述的饮料，其特征在于，所述饮料还包括啤酒花。
4.根据权利要求3所述的饮料，其特征在于，所述啤酒花或其衍生物具有≤30IBU的苦度。
5.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述益生菌包括乳杆菌属菌、双歧杆菌属菌或其组合。
6.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述饮料所含的益生菌为选自副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌或其组合的乳杆菌属菌。
7.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述益生菌的细胞数≥5.0log CFU/mL。
8.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述饮料的pH值为2～6。
9.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述饮料的白利糖度为4～20°Bx。
10.根据前述任何一项权利要求所述的饮料，其特征在于，所述饮料为啤酒。
11.一种形成根据权利要求1至10中任何一项所述的含酒精饮料的方法，其特征在于，所述方法包括：
-提供麦芽汁或果汁；
-向所述麦芽汁或果汁内添加益生菌；
-向所述麦芽汁或果汁内添加酵母；以及
-将所述麦芽汁或果汁在预设温度下发酵预设时间长度，以形成所述含酒精饮料。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括向所述麦芽汁或果汁内添加啤酒花或其衍生物。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述啤酒花具有≤30IBU的苦度。
14.根据权利要求11至13中任何一项所述的方法，其特征在于，所述益生菌包括乳杆菌属菌、双歧杆菌属菌或其组合。
15.根据权利要求11至14中任何一项所述的方法，其特征在于，所述饮料所含的益生菌为选自副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌或其组合的乳杆菌属菌。
16.根据权利要求11至15中任何一项所述的方法，其特征在于，所述酵母为酵母属酵母、非酵母属酵母或其组合。
17.根据权利要求11至16中任何一项所述的方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母、巴斯德酵母、戴尔有孢圆酵母、美极梅奇酵母、克鲁维毕赤酵母、耐热拉茜斯酵母或其组合。
18.根据权利要求11至17中任何一项所述的方法，其特征在于，所述添加益生菌和所述添加酵母同时进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：在第一温度下将所述麦芽汁或果汁发酵第一时间长度；随后将所述麦芽汁或果汁在第二温度下发酵第二时间长度。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述第二时间长度结束时，添加啤酒花或其衍生物。
21.根据权利要求11至17中任何一项所述的方法，其特征在于，所述添加益生菌和所述添加酵母先后进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述添加酵母在所述添加益生菌后的第三时间长度之后进行。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：在添加所述酵母后，在第三温度下将所述麦芽汁或果汁发酵第四时间长度；随后将所述麦芽汁或果汁在第四温度下发酵第五时间长度。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述第五时间长度结束时，添加啤酒花或其衍生物。
25.根据权利要求11至24中任何一项所述的方法，其特征在于，所形成的含酒精饮料保存于≤20℃的温度。
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