CN110628740A - 一类模拟dot1l多肽的拟肽类小分子化合物的制备方法和用途 - Google Patents
一类模拟dot1l多肽的拟肽类小分子化合物的制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一类模拟DOT1L多肽的拟肽类化合物的制备方法以及它们的医疗用途，特别是作为阻断MLL融合蛋白与甲基转移酶DOT1L之间相互作用的MLL融合蛋白抑制剂在治疗癌症方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一类模拟DOT1L多肽的拟肽类小分子化合物及它们的制备方法。本发明进一步涉及这类拟肽类化合物作为阻断MLL融合蛋白与甲基转移酶DOT1L间相互作用的小分子化合物在治疗癌症方面的医疗用途。
背景技术
在人类急性白血病中，大约5-10％的成年白血病患者和70％的婴儿白血病患者带有因染色体带11q23易位而产生的融合基因，其中大部分是由混合系白血病基因MLL与其它基因融合产生(Nat.Rev.Cancer.，2007，7，823-833.)。另外，由于采用拓扑异构酶II抑制剂治疗而诱发的白血病患者也经常带有MLL融合基因(Leukemia，2001，15，987-989.)。带有MLL融合基因的白血病患者的预后通常非常不理想。正常的MLL基因解码一种在胚胎发育和造血作用中有重要功能的蛋白MLL1。MLL1是一种甲基转移酶，可以特异性的催化组蛋白H3中Lys4(H3K4)的单、双和三甲基化。MLL1本身的催化能力很弱，但当MLL1与WDR5、RbBP5和ASH2L形成蛋白复合物后催化能力会显著增强(Nature，2016，530，447-452)。通过催化H3K4的甲基化及与多种转录调控蛋白的相互作用，MLL1可以保持下游基因，如Hox、Meis-1等基因的正常表达(Differentiation，2003，71，461-476.)。Hox基因的正常表达对胚胎发育和血细胞分化有关键作用，但有些Hox基因，如HoxA9的持续表达则是带有MLL重排基因的白血病的重要特征，而且在白血病的产生及发展中起着重要作用(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2005，102，8603-8608.)。染色体易位可以导致MLL基因与多种伙伴基因形成融合基因，目前已发现了超过70种由MLL融合基因表达的MLL融合蛋白，这些融合蛋白主要是由MLL1氮端的肽链与其它蛋白融合(Mol.Cell.，2010，38，853-863)。因为不含MLL1碳端的SET结构域，这些融合蛋白不具备甲基转移酶的活性，但却具有融合伙伴的部分功能，其中很多可以促进Hox基因的持续表达。MLL融合蛋白中的很多都已被证实与急性淋巴性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)有关，其中一些已被动物实验证明可直接诱发ALL和AML(Blood，2003，102，262-268.)。染色体的易位通常只发生在一条MLL等位基因上，因此MLL白血病细胞中会同时存在野生型的MLL1和MLL融合蛋白(Mol.Cell.，2010，38，853-863)，而且最近的研究表明野生型的MLL1的存在是MLL融合蛋白促进下游基因持续表达的功能所必须的。尽管MLL融合蛋白已发现的有超过70种，但其中最主要的是MLL-AF9、MLL-ENL、MLL-AF4、MLL-AF10和MLL-ELL等五种细胞核转录因子蛋白，大约80％左右的MLL白血病与这五种融合蛋白有关(Nat.Rev.Cancer，2007，7，823-33.)。
近年来的生物学研究表明MLL融合蛋白促进Hox和Meis-1等基因的表达主要通过两种机制进行，一是与一些RNA聚合酶II相关的延伸因子相互作用，构成一种被称之为超级延伸复合物的大分子复合物，并通过RNA聚合酶II促使MLL1所调控的Hox基因异常表达；二是利用MLL的融合伙伴招募另一种甲基转移酶DOT1L并促使受MLL1调控的基因位点处的H3K79异常的高度甲基化，而H3K79的甲基化是转录活跃的标志之一(Cancer Cell，2008，14，355-368)。DOT1L是目前为止被发现的唯一一个催化组蛋白H3中Lys79(H3K79)甲基化的甲基转移酶，其特点是它不含其它甲基转移酶中特有的SET结构域。最近，一类以EPZ-5676为代表的小分子DOT1L抑制剂已被报道(Cancer Cell，2011，20，53-65.)。EPZ-5676是甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的竞争性小分子抑制剂，对DOT1L很高的选择性，并可以有效抑制H3K79的甲基化。EPZ-5676可以有效抑制由MLL融合蛋白诱发的白血病细胞的生长，而对不含MLL融合蛋白的细胞系没有影响，表明其在癌细胞中的作用机制与MLL融合蛋白密切相关。目前EPZ-5676已经进入I期临床研究。生物学研究表明，DOT1L可以直接或间接地与多个主要的MLL融合伙伴相互作用，其中MLL-AF9和MLL-ENL可以直接与DOT1L结合(CancerCell，2008，14，355-368.)。敲低ENL或敲除DOT1L均会降低位于HoxA9基因位点的H3K79的甲基化，并抑制带有MLL融合基因的白血病细胞的生长(Epigenomics，2011，3，667-670.)。阻断MLL融合蛋白与DOT1L的相互作用，可以在不改变细胞中整体的H3K79甲基化水平的情况下抑制血细胞的癌变(Blood，2011，117，4759-4768.)，因此，阻断MLL融合蛋白对DOT1L的招募是一种新的治疗带有MLL重排基因的白血病的潜在方法，并且有可能可以克服因完全抑制DOT1L的活性而导致的副作用。抑制MLL融合蛋白与DOT1L相互作用的小分子化合物不仅可以作为研究MLL融合蛋白作用机制的工具，并且有可能从中发展出新型的治疗MLL白血病的药物。
最近，Kuntimaddi等人利用核磁共振技术研究了AF9与DOT1L的结合(CellReports，2015，11，808-820)。他们通过15N-1H HSQC发现AF9中的一个结构域(氨基酸序列499-568)可以跟DOT1L中的三个不同位置的多肽片段结合，其中片段1与AF9的结合较弱，而片段2和3与AF9的结合较强。片段2和3中与AF9结合最重要的7肽片段几乎完全相同，在片段1中同样有一个多肽片段具有与这个7肽类似的氨基酸组成，因此这三个片段很可能是以类似的构像与AF9中的同一个区域结合。他们利用NMR解析了片段3与AF9所形成的复合物的三维结构，并根据结构信息，设计了两种定点突变的MLL-AF9融合蛋白。这些突变的蛋白不能与DOT1L有效结合，但是可以同野生型的融合蛋白竞争与受MLL融合蛋白调控的基因位点的结合，因此可以抑制野生型融合蛋白对DOT1L的招募。在小鼠骨髓c-kit细胞中表达这些定点突变的MLL融合蛋白可以明显抑制受MLL融合蛋白调控的基因位点处H3K79的双甲基化和三甲基化，并抑制Hoxa9和Meis-1等基因的表达。另外，在一项独立的研究中，密西根大学Nikolovska-Coleska的研究组同样发现含DOT1L中的氨基酸残基865-874的十肽(位于片段2中)可以与AF9和ENL结合，并能有效阻断DOT1L与MLL-AF9/ENL的结合(J.Biol.Chem.，2013，288，30585-30596.)。以上研究进一步证明阻断MLL-AF9融合蛋白与DOT1L的相互作用有可能是一种新的治疗白血病的方法。
本发明中我们以从DOT1L的片段2和3中截取的能够与MLL融合蛋白结合并阻断MLL融合蛋白与DOT1L相互作用的7肽为模板，设计并合成了一类将用于治疗MLL白血病的阻断MLL融合蛋白与甲基转移酶DOT1L相互作用的拟肽类小分子化合物。
发明内容
本发明中的化合物优选式I的结构：
其中X和Y分别为1-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R9为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R3和R4可以相互连接成为环状结构；R6和R7可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
本发明中的化合物还优选式II的结构：
其中X和Y分别为1-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R10为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R4和R5可以相互连接成为环状结构；R7和R8可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
本发明中的化合物还优选式III的结构：
其中Ar为带有至少一个取代基的单环或多环芳基或芳杂环；X和Y分别为0-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R10为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R2和R3可以相互连接成为环状结构；R5和R6可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
本发明提供了如式I所示拟肽类化合物的制备方法，如下反应式：
具体包括以下步骤：
(1)化合物1与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物2；
(2)化合物2与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物3；
(3)化合物3与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物4；
(4)化合物4与酸缩合制得化合物I。
本发明的优选式I代表的化合物选自包含下列各化合物的结构类型：
在研究二肽模拟物双环衍生物的合成过程中，本发明按照下述路线制备式(12)的化合物：
具体包括以下步骤：
(1)L-N-Boc焦谷氨酸甲酯通过三步反应得到化合物6；
(2)化合物6中的甲酯转换为苄酯得到化合物7；
(3)化合物7脱Boc保护与丙烯酰氯反应得到化合物8；
(4)化合物8通过RCM反应关环得到化合物9；
(5)化合物9溴代得到化合物10；
(6)化合物10通过偶联得到化合物11；
(7)化合物11通过氢化还原双键和苄酯得到化合物12。
在研究二肽模拟物双环衍生物的合成过程中，本发明按照下述路线制备式(16)的化合物：
具体包括以下步骤：
(1)化合物13通过与D-N-Cbz氨基酸缩合后再臭氧化得到化合物14；
(2)化合物14氢化关环得到化合物15；
(3)化合物15乙酰化得到化合物16。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1二肽模拟物双环衍生物式(12)的合成
1-(叔丁基)-2-甲基-(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸酯的制备：
将L-N-Boc-焦谷氨酸甲酯(10.0g，41.11mmol，1.0eq)溶于无水THF(100mL)中，氮气保护，-78℃下缓慢滴加DIBAH(1.5M in toluene)(54.81mL，82.22mmol，2.0eq)，-78℃反应3-5h。TLC监测反应完全后，加入饱和酒石酸钾钠水溶液淬灭反应。反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色油状物，无需纯化直接用于下一步反应。将上述无色油状物溶于甲醇(100mL)中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，旋除溶剂，加入饱和碳酸氢钠水溶液中和反应，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝10∶1)得无色油状物1-(叔丁基)-2-甲基-(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(9.60g，收率90.0％)。
将上述油状物溶于无水乙醚(100mL)中，氮气保护，-78℃下依次缓慢滴加烯丙基三甲基硅烷(8.46g，74.04mmol，2.0eq)和三氟化硼乙醚(5.78g，40.72mmol，1.1eq)，反应液缓慢升至室温反应3h。TLC监测反应完全后，加入饱和碳酸氢钠水溶液中和反应，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝15∶1)得无色油状物1-(叔丁基)-2-甲基-(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(8.07g，收率80.9％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.86(m，1H)，5.13(m，1H)，5.07(m，1H)，4.22(m，1H)，3.51(s，3H)，2.82-2.67(m，1H)，2.40-2.30(m，2H)，2.18-2.13(m，2H)，1.41(s，9H)；ESI-MS m/z calc’d for C14H23NO4[M+Na]+291.2，found 291.3.
2-苄基1-(叔丁基)(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸酯的制备；
将(2S，5R)-5-烯丙基-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-羧酸、无水碳酸钾(8.28g，59.92mmol，2.0eq)溶于无水DMF中，缓慢滴加溴化苄(5.64g，32.96mmol，1.1eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝10∶1)得2-苄基1-(叔丁基)(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(9.31g，收率90.0％)。ESI-MS m/zcalc’d forC20H27NO4[M+Na]+368.2，found 368.4.
(2S，5R)-1-丙烯酰基-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯的制备：
将2-苄基1-(叔丁基)(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸酯溶于盐酸乙酸乙酯中，室温反应1h。TLC监测反应完全后减压浓缩，得到以氨基盐酸盐形式存在的产物，可不经纯化直接用于下一步反应，产率近100％。将脱除Boc保护的胺(5.00g，14.47mmol，1.0eq)溶于DCM中，加入丙烯酰氯(1.44g，15.92mmol，1.1eq)，0℃下缓慢滴加DIPEA(3.74g，28.95mmol，2.0eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝4∶1)得无色油状物(4.00g，收率92.4％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.42-7.30(m，5H)，6.55-6.18(m，2H)，5.89-5.68(m，2H)，5.22(s，2H)，5.18-4.99(m，2H)，4.59(m，1H)，4.10(m，1H)，2.61-2.10(m，3H)，2.11-1.88(m，3H)；ESI-MS m/z calc’d for C18H21NO2[M+Na]+322.2，found 322.4.
(3S，8aS)-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯的制备：
将(2S，5R)-1-丙烯酰基-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯(4.00g，13.36mmol，1.0eq)溶于无水甲苯中(400mL)，氮气保护条件下加入催化量的Grubbs二代催化剂，回流反应24h。TLC监测反应完全后，浓缩反应液，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得无色油状物(3.09g，收率85.1％)。ESI-MS m/z calc’d for C16H17NO3[M+Na]+294.1，found 294.3.
(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯的制备：
将(3S，8aS)-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(3.09g，11.39mmol，1.0eq)溶于DCM中(100mL)，0℃下缓慢滴加液溴(2.18g，14.67mmol，1.2eq)的DCM溶液(0.5M)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，将反应液移至冰浴中，缓慢滴加DIPEA(2.94g，22.78mmol，2.0eq)，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，浓缩反应液，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得白色固体(3.53g，收率88.5％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.35-7.22(m，5H)，6.95(m，1H)，5.34(s，2H)，4.57(m，1H)，3.90(m，1H)，2.58-2.34(m，2H)，2.27-2.03(m，3H)，1.85(m，1H)；ESI-MS m/z calc’d for C16H16BrNO3[M+Na]+373.2，found 373.2.
5-氧代-6-苯基八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于1，4-二氧六环(4mL)和水(1mL)的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯(17mg，14.28μmol，0.05eq)，苯硼酸(38mg，0.31mmol，1.0eq)，碳酸铯(0.19g，0.57mmol，2.0eq)，氮气保护条件下，100℃反应12h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得白色固体约85mg，收率85.9％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.54-7.38(m，7H)，7.39-7.25(m，3H)，6.73(m，1H)，5.34(s，2H)，4.60(m，1H)，3.92(m，1H)，2.72-2.08(m，5H)，2.04-1.85(m，1H)；ESI-MS m/z calc’d for C22H21NO3[M+Na]+370.2，found370.4.将上述白色固体溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得5-氧代-6-苯基八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
5-氧代-6-(邻甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于1，4-二氧六环(4mL)和水(1mL)的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯(17mg，14.28μmol，0.05eq)，邻甲基苯硼酸(43mg，0.31mmol，1.0eq)，碳酸铯(0.19g，0.57mmol，2.0eq)。氮气保护条件下，100℃反应12h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得白色固体约55mg，收率53.4％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.45-7.32(m，5H)，7.30-7.05(m，4H)，6.50(m，1H)，5.35(s，2H)，4.60(m，1H)，3.99(m，1H)，2.71-2.26(m，3H)，2.23(s，3H)，2.14(m，1H)，2.03-1.70(m，2H)；ESI-MS m/z calc’d forC23H23NO3[M+Na]+384.2，found 384.4.将上述白色固体溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得5-氧代-6-(邻甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
5-氧代-6-(间甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于1，4-二氧六环(4mL)和水(1mL)的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯(17mg，14.28μmol，0.05eq)，间甲基苯硼酸(43mg，0.31mmol，1.0eq)，碳酸铯(0.19g，0.57mmol，2.0eq)。氮气保护条件下，100℃反应12h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得白色固体约80mg，收率77.7％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.54-7.38(m，5H)，7.35-7.22(m，3H)，7.12(m，1H)，6.72(m，1H)，5.30(s，2H)，4.63(m，1H)，3.93(m，1H)，2.73-2.41(m，2H)，2.36(s，3H)，2.33-2.07(m，3H)，1.94(m，1H)；ESI-MS m/zcalc’d for C23H23NO3[M+Na]+384.2，found 384.4.将上述白色固体溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得5-氧代-6-(间甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
5-氧代-6-(对甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于1，4-二氧六环(4mL)和水(1mL)的混合溶液中，再加入四(三苯基膦)钯(17mg，14.28μmol，0.05eq)，对甲基苯硼酸(43mg，0.31mmol，1.0eq)，碳酸铯(0.19g，0.57mmol，2.0eq)。氮气保护条件下，100℃反应12h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得白色固体约100mg，收率97.1％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.55-7.40(m，5H)，7.44-7.32(m，2H)，7.21-7.10(m，2H)，6.70(m，1H)，5.33(s，2H)，4.61(m，1H)，3.91(m，1H)，2.71-2.40(m，2H)，2.35(s，3H)，2.28-2.09(m，2H)，2.03-1.64(m，2H)；ESI-MS m/z calc’d for C23H23NO3[M+Na]+384.2，found 384.4.将上述白色固体溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得5-氧代-6-(对甲苯基)八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于无水THF(4mL)中，再加入三(二亚苄基丙酮)二钯(13mg，14.28μmol，0.05eq)，异丙烯基三氟硼酸钾(59mg，0.40mmol，1.4eq)，氟化钾(0.55g，0.94mmol，3.3eq)和三叔丁基膦(57μl，0.1M in hexane，0.02eq)。氮气保护条件下，50℃反应24h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝3∶1)得白色固体约65mg，收率73.1％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.56-7.42(m，5H)，6.31(m，1H)，5.39(s，2H)，5.49(m，1H)，5.09(m，1H)，4.54(m，1H)，3.81(m，1H)，2.60-2.29(m，2H)，2.13(s，3H)，1.91-1.60(m，4H)；ESI-MS m/zcalc’d for C19H21NO3[M+Na]+334.1，found 334.3.将上述白色固体溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羧酸的制备：
将(3S，8aS)-6-溴-5-氧代-1，2，3，5，8，8a-六氢吲嗪-3-甲酸苄酯(0.10g，0.29mmol，1.0eq)溶于无水THF(4mL)中，再加入二氯二三苯基膦钯(10mg，14.28μmol，0.05eq)，4-甲基戊炔(22mg，0.40mmol，1.4eq)，碘化亚铜(6mg，28.55μmol，0.1eq)，三乙胺(56mg，0.57mmol，2.0eq)，氮气保护条件下，110℃反应24h。TLC监测反应完全后冷却至室温，反应液用水稀释，EA萃取三次。合并有机相，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝3∶1)得无色油状物约60mg，收率62.5％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.52-7.38(m，5H)，6.79(m，1H)，5.30(s，2H)，4.57(m，1H)，3.81(m，1H)，2.64-2.40(m，2H)，2.23-2.02(m，4H)，1.91-1.79(m，3H)，1.01-0.97(m，6H)；ESI-MS m/zcalc’d for C22H25NO3[M+Na]+374.2，found 374.4.将上述无色油状物溶于甲醇中，加入10％钯碳(10mg)，通入氢气室温反应2h。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羧酸(收率约100％)。
实施例2二肽模拟物双环衍生物式(16)的合成
(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-羧酸苄酯的制备：
将(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯(0.5g，2.04mmol，1.0eq)和D-N-Cbz-苯甘氨酸(0.64g，2.24mmol，1.1eq)，EDC(0.43g，2.24mmol，1.1eq)和HOBT(0.41g，3.06mmol，1.5eq)溶于DCM(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.53g，4.08mmol，2.0eq)，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，反应液用DCM稀释，有机相依次用1 N HCl水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝4∶1)得无色油状物(2S，5R)-5-烯丙基-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙酰基)吡咯烷-2-甲酸苄酯。将上述无色油状物溶于DCM中，-78℃下通入臭氧反应1h，TLC监测反应完全后，加入1mL三乙胺淬灭反应，反应液浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得无色油状物(0.71g，两步总收率67.5％)。ESI-MS m/z calc’d for C30H30N206[M+Na]+537.2，found537.6.
(2S，5R)-1-(((苄氧基)羰基)-D-缬氨酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯的制备：
将(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯(0.5g，2.04mmol，1.0eq)和D-N-Cbz-缬氨酸(0.56g，2.24mmol，1.1eq)，EDC(0.43g，2.24mmol，1.1eq)和HOBT(0.41g，3.06mmol，1.5eq)溶于DCM(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.53g，4.08mmol，2.0eq)，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，反应液用DCM稀释，有机相依次用1 N HCl水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝4∶1)得无色油状物(2S，5R)-5-烯丙基-1-(((苄氧基)羰基)-D-缬氨酰基)吡咯烷-2-羧酸苄酯。将上述无色油状物溶于DCM中，-78℃下通入臭氧反应1h，TLC监测反应完全后，加入1mL三乙胺淬灭反应，反应液浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得无色油状物40b(0.44g，两步收率44.9％)。ESI-MS m/z calc’d for C27H32N2O5[M+Na]+503.2，found 503.5.
(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环戊基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯的制备：
将(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯(0.5g，2.04mmol，1.0eq)和D-N-Cbz-环戊基甘氨酸(0.62g，2.24mmol，1.1eq)，EDC(0.43g，2.24mmol，1.1eq)和HOBT(0.41g，3.06mmol，1.5eq)溶于DCM(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.53g，4.08mmol，2.0eq)，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，反应液用DCM稀释，有机相依次用1N HCl水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝4∶1)得无色油状物(2S，5R)-5-烯丙基-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环戊基乙酰基)吡咯烷-2-羧酸苄酯。将上述无色油状物溶于DCM中，-78℃下通入臭氧反应1h，TLC监测反应完全后，加入1mL三乙胺淬灭反应，反应液浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得无色油状物(0.52g，两步收率50.6％)。ESI-MS m/z calc’d for C29H34N2O6[M+Na]+529.2，found 529.6.
(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环己基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯的制备：
将(2S，5R)-5-烯丙基吡咯烷-2-羧酸苄酯(0.5g，2.04mmol，1.0eq)、D-N-Cbz-环己基甘氨酸(0.65g，2.24mmol，1.1eq)，EDC(0.43g，2.24mmol，1.1eq)和HOBT(0.41g，3.06mmol，1.5eq)溶于DCM(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.53g，4.08mmol，2.0eq)，室温反应过夜。TLC监测反应完全后，反应液用DCM稀释，有机相依次用1N HCl水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝4∶1)得无色油状物(2S，5R)-5-烯丙基-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环己基乙酰基)吡咯烷-2-羧酸苄酯。将上述无色油状物溶于DCM中，-78℃下通入臭氧反应1h，TLC监测反应完全后，加入1mL三乙胺淬灭反应，反应液浓缩，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1)得无色油状物(0.62g，两步收率58.5％)。ESI-MS m/z calc’d for C30H36N2O6[M+Na]+543.3，found 543.3.
(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-苯-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸的制备：
将(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-羧酸苄酯(0.71g，1.38mmol，1.0eq)溶于甲醇中，加入10％钯碳(70mg)，通入氢气室温反应过夜。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得(4R，7S，9aS)-4-苯基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(收率约100％)。将其溶于DCM中，加入乙酰氯(0.13g，1.66mmol，1.2eq)，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.53g，4.14mmol，3.0eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用1 N HCl水溶液调pH为酸性，DCM萃取三次。合并有机相，有机相用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝10∶1)得无色油状物(0.30g，收率67.1％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ12.22(s，1H)，7.42-7.27(m，5H)，4.64(m，1H)，4.53(m，1H)，4.14(m，1H)，3.33(m，1H)，3.04(m，1H)，2.34(s，3H)，2.32-2.14(m，2H)，2.12-1.95(m，2H)，1.91-1.70(m，2H)；ESI-MS m/z calc’d for C17H20N2O4[M+Na]+339.1，found 339.4.
(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-异丙基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸的制备：
将(2S，5R)-1-(((苄氧基)羰基)-D-缬氨酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯(0.44g，0.92mmol，1.0eq)溶于甲醇中，加入10％钯碳(40mg)，通入氢气室温反应过夜。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-异丙基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(收率约100％)。将其溶于DCM中，加入乙酰氯(86mg，1.10mmol，1.2eq)，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.35g，2.75mmol，3.0eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用1 N HCl水溶液调pH为酸性，DCM萃取三次。合并有机相，有机相用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝10∶1)得无色油状物(0.14g，收率54.3％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ12.22(s，1H)，4.60(m，1H)，3.93(m，1H)，3.40(m，1H)，2.91-2.78(m，2H)，2.30(s，3H)，2.28-1.98(m，4H)，1.87-1.65(m，3H)，0.98(d，J＝4.5Hz，3H)，0.96(d，J＝4.5Hz，3H)；ESI-MS m/z calc’d for C14H22N2O4[M+Na]+305.2，found 305.3.
(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-环戊基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸的制备：
将(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环戊基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯(0.52g，1.03mmol，1.0eq)溶于甲醇中，加入10％钯碳(50mg)，通入氢气室温反应过夜。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-环戊基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(收率约100％)。将其溶于DCM中，加入乙酰氯(97mg，1.23mmol，1.2eq)，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.40g，3.08mmol，3.0eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用1 N HCl水溶液调pH为酸性，DCM萃取三次。合并有机相，有机相用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝10∶1)得无色油状物(0.18g，收率57.6％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ12.23(s，1H)，4.69(m，1H)，4.02(m，1H)，3.50(m，lH)，2.88(m，1H)，2.82(m，1H)，2.29-2.18(m，4H)，2.17-1.98(m，3H)，1.87-1.69(m，3H)，1.67-1.50(m，6H)，1.49-1.28(m，2H)；ESI-MS m/z calc’dfor C16H24N2O4[M+Na]+331.2，found 331.4.
(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-环己基-5-氧代-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸的制备：
将(2S，5R)-1-((R)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-环己基乙酰基)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸苄酯(0.62g，1.19mmol，1.0eq)溶于甲醇中，加入10％钯碳(60mg)，通入氢气室温反应过夜。TLC监测反应完全后，硅藻土过滤，滤液浓缩得(4R，7S，9aS)-3-乙酰基-4-环己基-5-氧代-lH-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(收率约100％)。将其溶于DCM中，加入乙酰氯(112mg，1.43mmol，1.2eq)，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.46g，3.57mmol，3.0eq)，室温反应2h。TLC监测反应完全后，反应液用1 N HCl水溶液调pH为酸性，DCM萃取三次。合并有机相，有机相用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝10∶1)得无色油状物(0.20g，收率52.1％)。ESI-MS m/z calc’d for C17H26N2O4[M+Na]+345.2，found 345.4.
实施例3关键中间体的合成
((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯叔丁酯的制备：
将(((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙-1-醇吡啶-2-基)氨基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.67g，1.06mmol，1.Oeq)溶于盐酸甲醇中，室温反应1h。TLC监测反应完全后减压浓缩，得到以氨基盐酸盐形式存在的产物，可不经纯化直接用于下一步反应，产率近100％。将脱除Boc保护的胺和L-N-Boc-缬氨酸(0.23g，1.06mmol，1.0eq)，HATU(0.48g，1.27mmol，1.2eq)溶于DMF(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.27g，2.11mmol，2.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.60g，两步收率77.9％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.47(brd，J＝4.3Hz，1H)，7.61-7.54(m，3H)，7.45-7.31(m，7H)，7.26-7.15(m 2H)，5.44(m，1H)，5.25(m，1H)，5.10(m，1H)，4.93(m，1H)，4.49(m，1H)，4.39(m，1H)，3.90(m，1H)，3.69(m，1H)，3.54(m，1H)，3.00(s，3H)，2.06-1.77(m，6H)，1.74(d，J＝7.1Hz，3H)，1.71-1.58(m，3H)，1.53(s，9H)，1.26-1.05(m，3H)，0.93-0.70(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C39H55N7O7[M+Na]+756.4，found 756.6.
((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯叔丁酯的制备：
将((S)-3-(((S)-3-环戊基-1-氧代-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙烷-1，2-二基)二氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.50g，0.80mmol，1.0eq)溶于盐酸甲醇中，室温反应1h。TLC监测反应完全后减压浓缩，得到以氨基盐酸盐形式存在的产物，可不经纯化直接用于下一步反应，产率近100％。将脱除Boc保护的胺和L-N-Boc-缬氨酸(0.18g，0.80mmol，1.0eq)，HATU(0.37g，0.97mmol，1.2eq)溶于DMF(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.21g，1.61mmol，2.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.62g，两步收率76.4％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.31(brs，1H)，7.90(brd，J＝7.1Hz，1H)，7.81(brd，J＝6.9Hz，1H)，7.79-7.70(m，2H)，7.65-7.53(m，3H)，7.48-7.48(m，3H)，7.38-7.29(m，6H)，5.8l(m，1H)，5.48(m，1H)，5.26-4.93(m，3H)，4.39(m，1H)，4.22(m，1H)，3.72(m，lH)，3.50(m，2H)，2.07-1.71(m，4H)，1.66(d，J＝7.1Hz，3H)，1.62-1.50(m，2H)，1.47(s，9H)，1.42-1.23(m，3H)，1.14-1.05(m，3H)，0.95-0.89(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C44H57N7O7[M+Na]+819.0，found 818.9.
((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯叔丁酯的制备：
将((S)-3-(((S)-3-环戊基-1-氧代-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙烷-1，2-二基)二氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.50g，0.72mmol，1.0eq)溶于盐酸甲醇中，室温反应1h。TLC监测反应完全后减压浓缩，得到以氨基盐酸盐形式存在的产物，可不经纯化直接用于下一步反应，产率近100％。将脱除Boc保护的胺和L-N-Boc-缬氨酸(0.16g，0.72mmol，1.0eq)，HATU(0.33g，0.86mmol，1.2eq)溶于DMF(20mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(0.18g，1.44mmol，2.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯叔丁酯(0.59g，两步收率82.9％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.49(brs，1H)，7.91(brd，J＝7.3Hz，1H)，7.79(brd，J＝7.1Hz，1H)，7.68-7.62(m，2H)，7.36-7.30(m，8H)，6.05(m，1H)，5.60-5.48(m，2H)，5.34(m，1H)，4.47-4.35(m，2H)，3.76-3.61(m，4H)，2.04(m，1H)，1.94-1.84(m，2H)，1.79(d，J＝7.1Hz，3H)，1.77-1.69(m，3H)，1.65-1.54(m，3H)，1.50(s，9H)，1.47-1.41(m，3H)，0.97-0.90(m，6H)；ESI-MS m/z calc’dfor C38H53N7O7[M+Na]+742.4，found 742.9.
实施例4终产物的合成
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-甲酸(29mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(61.3mg，收率76.3％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.77(m，1H)，7.71-7.51(m，7H)，7.38-7.34(m，2H)，7.31-7.20(m，3H)，5.31(m，1H)，4.76(m，1H)，4.55(d，J＝9.0Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.95(d，J＝7.0Hz，1H)，3.78-3.64(m，2H)，3.37(m，1H)，3.21(m，1H)，2.35-2.02(m，5H)，1.98-1.89(m，2H)，1.84-1.73(m，8H)，1.70-1.59(m，3H)，1.95-1.48(m，2H)，1.31(m，1H)，1.26-1.10(m，2H)，1.05-0.96(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C46H58N8O5[M+Na]+825.4，found 825.9.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(58.5mg，收率71.6％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.77(m，1H)，7.71-7.50(m，7H)，7.38(m，1H)，7.21-7.04(m，3H)，5.31(m，1H)，4.78(m，1H)，4.56(d，J＝9.0Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.98-3.91(m，2H)，3.69(m，1H)，3.39(m，1H)，3.22(m，1H)，2.35(s，3H)，2.27-2.03(m，5H)，2.01-1.86(m，2H)，1.82-1.74(m，8H)，1.69-1.62(m，3H)，1.57-1.49(m，2H)，1.38-1.08(m，3H)，1.05-0.96(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C47H60N8O5[M+Na]+839.4，found 839.9.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-IH-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(62.7mg，收率76.7％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.76(m，1H)，7.71-7.66(m，2H)，7.64-7.51(m，5H)，7.17-7.13(m，3H)，7.03(m，1H)，5.30(m，1H)，4.77(m，1H)，4.55(d，J＝9.0Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.98(m，1H)，3.75-3.65(m，2H)，3.37(m，1H)，3.20(m，1H)，2.33(s，3H)，2.30-2.00(m，5H)，1.95-1.72(m，11H)，1.69-1.45(m，5H)，1.24-1.08(m，2H)，1.05-0.97(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C47H60N8O5[M+Na]+839.4，found 839.9.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(65.0mg，收率79.6％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.76(m，1H)，7.71-7.66(m，2H)，7.64-7.50(m，5H)，7.25-7.2l(m，2H)，7.12-7.07(m，2H)，5.31(m，1H)，4.76(m，1H)，4.54(d，J＝9.0Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.95(d，J＝7.0Hz，lH)，3.75-3.64(m，2H)，3.36(m，1H)，3.21(m，1H)，2.30(s，3H)，2.29-2.02(m，5H)，1.99-1.71(m，11H)，1.69-1.46(m，5H)，1.23-1.11(m，2H)，1.05-0.97(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C47H60N8O5[M+Na]+839.4，found 839.8.
((3S，6S，8aS)-6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸(25mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(57.2mg，收率74.4％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-6-异丙基-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.76-7.67(m，3H)，7.65-7.50(m，5H)，5.30(m，1H)，4.78(m，1H)，4.50(m，1H)，4.42(m，1H)，3.94(d，J＝7.1Hz，1H)，3.62(m，1H)，3.36(m，1H)，3.18(m，1H)，2.39(m，1H)，2.24(m，1H)，2.12-2.04(m，5H)，1.89-1.74(m，10H)，1.69-1.61(m，3H)，1.56-1.44(m，3H)，1.24-1.11(m，2H)，1.08-0.82(m，12H)；ESI-MS m/zcalc’d for C43H60N8O5[M+Na]+791.4，found 791.7.
((3S，6S，8aS)-6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，((3S，6S，8aS)-6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸(29mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(57.2mg，收率74.4％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-6-(4-甲基戊基)-5-氧代八氢吲哚嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.75-7.70(m，2H)，7.65(m，1H)，7.59-7.53(m，2H)，7.52-7.43(m，3H)，5.28(m，1H)，4.81-4.73(m，2H)，4.52-4.36(m，2H)，3.96(d，J＝7.0Hz，1H)，3.56(m，1H)，3.15(m，1H)，2.28(m，1H)，2.14-2.00(m，6H)，1.84-1.73(m，6H)，1.71(d，J＝7.1Hz，3H)，1.67-1.54(m，5H)，1.53-1.36(m，6H)，1.24-1.11(m，4H)，1.06-0.98(m，6H)，0.92-0.89(m，6H)；ESI-MS m/zcalc’d for C44H66N8O5[M+Na]+833.5，found 833.6.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(4-苯基-1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(80mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-甲酸(29mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(53.9mg，收率72.7％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.76-7.72(m，2H)，7.56-7.51(m，2H)，7.36-7.22(m，5H)，5.34(m，1H)，4.82(m，1H)，4.54(m，1H)，4.43(m，1H)，3.94(d，J＝7.0Hz，1H)，3.76-3.71(m，2H)，3.44(m，1H)，3.27(m，1H)，2.73(s，3H)，2.36-1.93(m，7H)，1.88-1.73(m，8H)，1.70-1.57(m，3H)，1.57-1.46(m，2H)，1.32(m，1H)，1.24-1.09(m，2H)，1.05-0.97(m，6H)；ESI-MSm/z calc’d for C41H56N8O4[M+Na]+763.4，found 763.9.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-l-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯(73mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(53.7mg，收率71.1％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-邻甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.80-7.77(m，2H)，7.61-7.56(m，2H)，7.36(m，1H)，7.21-7.05(m，3H)，5.31(m，1H)，4.80(m，1H)，4.55(m，1H)，4.43(m，1H)，3.95(m，1H)，3.74-3.67(m，2H)，3.44(m，1H)，3.25(m，1H)，2.74(s，3H)，2.33(s，3H)，2.05-2.19(m，5H)，2.01-1.90(m，2H)，1.88-1.74(m，8H)，1.69-1.49(m，5H)，1.31(m，1H)，1.23-1.09(m，2H)，1.05-0.96(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C42H58N8O5[M+Na]+777.4，found 777.5.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯(73mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(58.7mg，收率77.7％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-间甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.79-7.76(m，2H)，7.60-7.57(m，2H)，7.17-7.13(m，3H)，7.04(m，1H)，5.35(m，1H)，4.85(m，1H)，4.55(m，1H)，4.43(m，1H)，3.97(d，J＝7.0Hz，1H)，3.74-3.67(m，2H)，3.44(m，1H)，3.27(m，1H)，2.74(s，3H)，2.33(s，3H)，2.05-2.19(m，4H)，2.01-1.90(m，2H)，1.88-1.72(m，10H)，1.68-1.58(m，3H)，1.55-1.46(m，2H)，1.23-1.09(m，2H)，1.04-0.98(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C42H58N8O5[M+Na]+777.4，found777.5.
((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)甲基氨基甲酸苄酯(73mg，100μmol，1.0eq)，(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲苯基八氢吲嗪-3-甲酸(30mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(EA)得Cbz保护的(3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲苯基八氢吲嗪终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(59.6mg，收率78.9％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((3S，6S，8aS)-5-氧代-6-对甲基苯基八氢吲嗪-3-羰基)-L-缬氨酰-3-甲基氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.81-7.78(m，2H)，7.62-7.59(m，2H)，7.29-7.21(m，2H)，7.14-7.09(m，2H)，5.35(m，1H)，4.80(m，1H)，4.53(m，1H)，4.42(m，1H)，4.11(m，1H)，3.72-3.65(m，3H)，3.47(m，1H)，2.94(s，3H)，2.31(s，3H)，2.19-2.03(m，3H)，2.03-1.87(m，4H)，1.87-1.72(m，8H)，1.69-1.49(m，5H)，1.36(m，1H)，1.23-1.22(m，2H)，1.08-0.94(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C42H58N8O5[M+Na]+777.4，found 777.9.
((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-苯基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(72mg，100μmol，1.0eq)，(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-苯基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(35mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得Cbz保护的(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-苯基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(60.0mg，收率76.5％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-苯基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.80-7.75(m，2H)，7.62-7.56(m，2H)，7.39-7.31(m，5H)，5.36(m，1H)，4.73-4.39(m，4H)，4.06-3.76(m，3H)，3.38(m，1H)，3.31-3.13(m，2H)，2.34(s，3H)，2.28-2.03(m，5H)，1.87-1.71(m，10H)，1.67-1.49(m，4H)，1.24-1.08(m，2H)，1.05-0.95(m，6H)；ESI-MS m/z calc’d for C42H57N9O6[M+Na]+806.4，found 806.5.
((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-异丙基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(72mg，100μmol，1.0eq)，(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-异丙基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(31mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得Cbz保护的(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-异丙基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(54.6mg，收率72.8％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-异丙基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.79-7.75(m，2H)，7.60-7.55(m，2H)，5.37(m，1H)，4.70(m，1H)，4.55-4.35(m，2H)，4.22(m，1H)，4.00(m，1H)，3.70-3.35(m，5H)，2.20(s，3H)，2.19-2.02(m，4H)，1.85-1.77(m，10H)，1.69-1.58(m，2H)，1.54-1.47(m，2H)，1.40-1.27(m，2H)，1.23-1.09(m，2H)，1.11-0.84(m，12H)；ESI-MS m/z calc’d forC39H59N9O6[M+Na]+772.4，found 772.9.
((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环戊基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(72mg，100μmol，1.0eq)，(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环戊基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(34mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得Cbz保护的(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环戊基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(57.4mg，收率74.0％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环戊基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.79-7.76(m，2H)，7.60-7.57(m，2H)，5.38(m，1H)，4.69(m，1H)，4.55-4.29(m，3H)，4.22(m，1H)，4.02(m，1H)，3.73(dm，1H)，3.61-3.39(m，2H)，3.02(m，1H)，2.40(m，1H)，2.30-2.03(m，7H)，1.99-1.71(m，12H)，1.71-1.49(m，9H)，1.32(m，1H)，1.24-1.07(m，3H)，1.07-0.91(m，6H)；ESI-MSm/z calc’d forC41H61N9O6[M+Na]+798.5，found 798.9.
((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环己基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺的制备：
将((S)-3-(((S)-1-(((S)-1-(1H-苯并[d]咪唑基)乙基)氨基)-3-环戊基-1-氧代丙烷基)-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸苄酯(72mg，100μmo1，1.0eq)，(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环己基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-甲酸(35mg，110μmol，1.1eq)和HATU(46mg，120μmol，1.2eq)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌30min，0℃下缓慢滴加DIPEA(39mg，300μmol，3.0eq)，室温反应3h。TLC监测反应完全后，反应液用水稀释，EA萃取三次，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝20∶1)得Cbz保护的(4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环己基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂终产物。钯碳催化氢化脱Cbz保护(59.6mg，收率75.5％)，经由半制备型高效液相分离纯化(洗脱梯度从60％A液和40％的B液到30％A液和70％的B液)，冷冻干燥得((4R，7S)-3-乙酰基-5-氧代-4-环己基八氢-1H-吡咯并[1，2-d][1，4]二氮杂-7-羰基)-L-缬氨酰-3-氨基丙氨酰-环戊基丙氨酰-(S)-2-(1H-苯并[d]咪唑基)乙酰胺(纯度高于95％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ7.81-7.77(m，2H)，7.62-7.58(m，2H)，5.39(m，1H)，4.75(m，1H)，4.57-4.28(m，3H)，4.19(m，1H)，3.98(m，1H)，3.67(m，1H)，3.54-3.37(m，3H)，2.19(s，3H)，2.18-2.00(m，5H)，1.98-1.46(m，21H)，1.34-1.09(m，6H)，1.06-0.94(m，6H)；ESI-MSm/z calc’d for C42H63N9O6[M+Na]+798.5，found 798.9.
Claims (7)
1.本发明中的化合物优选式I的结构：
其中X和Y分别为1-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R9为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R3和R4可以相互连接成为环状结构；R6和R7可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
2.本发明中的化合物还优选式II的结构：
其中X和Y分别为1-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R10为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R4和R5可以相互连接成为环状结构；R7和R8可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
3.本发明中的化合物还优选式III的结构：
其中Ar为带有至少一个取代基的单环或多环芳基或芳杂环；X和Y分别为0-3个取代或非取代的亚甲基，其中一个或多个亚甲基可以被氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R1-R10为1～20碳的非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换；R2和R3可以相互连接成为环状结构；R5和R6可以相互连接为环状结构；A为连接结构，可以选自非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR所替换，NR中N为氮原子，R为氢原子、非取代或取代的烷基、非取代或取代的环烷基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。以上描述中的取代基选自卤素原子、硝基、亚硝基、腈基、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫或NR1R2所替换，NR1R2中N为氮原子，R1和R2为氢原子、非取代或取代的烃基、非取代或取代的环状烃基、取代或非取代的单环或多环芳基、芳香性的杂环或各种取代的芳香性的杂环，其中一个或多个亚甲基可以被羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、氧、硫所替换。
4.本发明提供了如式I所示拟肽类化合物的制备方法，如下反应式：
具体包括以下步骤：
(1)化合物1与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物2；
(2)化合物2与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物3；
(3)化合物3与Boc保护氨基酸缩合，然后酸性条件下脱Boc保护制得化合物4；
(4)化合物4与酸缩合制得化合物I。
5.本发明的优选式I代表的化合物选自包含下列各化合物的结构类型：
6.在研究二肽模拟物双环衍生物的合成过程中，本发明按照下述路线制备式(12)的化合物：
具体包括以下步骤：
(1)L-N-Boc焦谷氨酸甲酯通过三步反应得到化合物6；
(2)化合物6中的甲酯转换为苄酯得到化合物7；
(3)化合物7脱Boc保护与丙烯酰氯反应得到化合物8；
(4)化合物8通过RCM反应关环得到化合物9；
(5)化合物9溴代得到化合物10；
(6)化合物10通过偶联得到化合物11；
(7)化合物11通过氢化还原双键和苄酯得到化合物12。
7.在研究二肽模拟物双环衍生物的合成过程中，本发明按照下述路线制备式(16)的化合物：
具体包括以下步骤：
(1)化合物13通过与D-N-Cbz氨基酸缩合后再臭氧化得到化合物14；
(2)化合物14氢化关环得到化合物15；
(3)化合物15乙酰化得到化合物16。
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| CN201810683152.4A CN110628740A (zh) | 2018-06-22 | 2018-06-22 | 一类模拟dot1l多肽的拟肽类小分子化合物的制备方法和用途 |
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| CN111518166B (zh) * | 2020-05-20 | 2023-01-31 | 中国药科大学 | 一种拟肽类化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法与应用 |
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