CN113336748B

CN113336748B - 一种gpx4蛋白降解剂及其制备方法和应用、一种抗肿瘤细胞药物

Info

Publication number: CN113336748B
Application number: CN202110391225.4A
Authority: CN
Inventors: 徐萍; 王超; 郑藏鑫; 孙丹; 许凤荣
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113336748A

Abstract

本发明提供了一种GPX4蛋白降解剂及其制备方法和一种抗肿瘤细胞药物，属于药物应用技术领域。本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)分子结构，其母核结构作为结合靶蛋白的小分子配体，A2取代基作为结合E3泛素连接酶复合物的小分子配体，A1取代基作为将两个配体连接起来连接基，此结构的GPX4蛋白降解剂能够特异性识别GPX4蛋白，并将GPX4蛋白有效泛素化并降解，从而诱导肿瘤细胞铁死亡。

Description

一种GPX4蛋白降解剂及其制备方法和应用、一种抗肿瘤细胞药物

技术领域

本发明涉及药物应用技术领域，特别涉及一种GPX4蛋白降解剂及其制备方法和应用、一种抗肿瘤细胞药物。

背景技术

2012年，哥伦比亚大学的Stockwell等提出了“铁死亡”(Ferroptosis)的概念，铁死亡是一种铁依赖性的、以细胞内活性氧物种堆积为特征的程序性细胞死亡方式。铁死亡常常由胞内脂质氢过氧化物清除系统缺陷而引起，从而出现大量的脂质氢过氧化物累积，最终造成细胞的损伤和死亡。

在生物进化过程中，细胞产生了一种防御机制以对抗氧化性脂质积累而引起的铁死亡，称为System Xc-_GSH_GPX4通路。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是通路中的核心蛋白，它是谷胱甘肽过氧化物酶家族8个亚型之一，是一种重要的过氧化物分解酶，其催化活性中心为硒代半胱氨酸(Selenocysteine，Sec)。GPX4通常以GSH作为辅因子，能够将细胞内的脂质氢过氧化物转化成为无毒性的类脂醇，同时也能催化过氧化氢等其他有机过氧化物的还原，因而具有保护细胞免受氧化应激、抑制铁死亡发生的作用。因此，抑制GPX4的活性，会影响GPX4清除脂质过氧化物的能力，最终导致细胞铁死亡的发生。

由于GPX4蛋白缺少传统的成药口袋，因此靶向GPX4的化合物设计具有一定的难度，然而小分子共价抑制剂仍可通过与GPX4活性中心的硒代半胱氨酸残基产生不可逆的结合，破坏其酶活性。因此目前GPX4抑制剂主要以共价抑制剂为主。现有已报道的GPX4抑制剂主要如下式所示：

目前还没有进入临床研究阶段的GPX4抑制剂报道，上述抑制剂也存在脱靶效应及生物利用度等方面的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种GPX4蛋白降解剂及其制备方法和应用、一种抗肿瘤细胞药物，本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有PROTAC分子结构，能够有效降解GPX4蛋白，从而诱导肿瘤细胞铁死亡。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种GPX4蛋白降解剂，具有式1所示结构：

式1中，A₁为式A₁₁～A₁₃所示取代基中的任意一种：

A₁₁和A₁₂中m为1～8，A₁₃中n为5～20，o为0～3，Z为CO或CH₂；

A₂为式A₂₁～A₂₂所示取代基中的任意一种：

A₂₁中X为CH₂或CO；A₂₂中Y为CH₃或H。

优选的，所述GPX4蛋白降解剂具有式2、式3、式4、式5、式6或式7所示结构：

式2中，m为1～8；

式3中，m为1～8；

式4中，m为1～8；

式5中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式6中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式7中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式8中，n为5～20，o为0～3，Z为CH₂；

本发明提供了上述GPX4蛋白降解剂的制备方法，包括以下步骤：

①当A₁为A₁₁或A₁₂时，所述GPX4蛋白降解剂的制备方法包括以下步骤：

叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物与第一GPX4配体发生Click反应，得到GPX4蛋白降解剂；

所述叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物具有式A-1、A-2或A-3所示结构：

所述第一GPX4配体具有式B所示结构：

②当A₁为A₁₃时，所述GPX4蛋白降解剂的制备方法包括以下步骤：

合哌嗪环碳链取代的E3配体化合物与第二GPX4配体发生缩合反应，得到GPX4蛋白降解剂；

或者合哌嗪环碳链取代的E3配体化合物与第三GPX4配体发生亲核取代反应，得到GPX4蛋白降解剂；

所述合哌嗪环碳链取代的E3配体化合物具有式C-1、式C-2、式C-3或式C-4所示结构：

所述第二GPX4配体具有式D所示结构：

所述第三GPX4配体具有式E所示结构：

优选的，所述具有式A-1所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式a所示结构的聚乙二醇化合物与具有式b所示结构的来那度胺进行取代反应，得到具有式A-1所示结构的叠氮基聚乙二醇链杂环化合物；

具有式A-2所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式c所示结构的聚乙二醇化合物与具有式d所示结构的化合物进行取代反应，得到具有式A-2所示结构的叠氮基聚醇链杂环化合物；

具有A-3所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式e所示结构的聚乙二醇化合物与具有式f所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式A-3所示结构的叠氮基聚醇链杂环化合物；

优选的，所述具有式B所示结构的第一GPX4配体的制备方法，包括以下步骤：

具有式i所示结构的化合物与氯乙酰氯进行取代反应，得到具有式B所示结构的第一GPX4配体；

优选的，所述具有式C-1所示结构的合哌嗪环碳链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

溴代烷醇与1-Boc-哌嗪进行取代反应，得到具有式j所示结构的化合物；

具有式j所示结构的化合物与对甲基苯磺酰氯进行取代反应，得到具有式k所示结构的化合物；

具有式k所示结构的化合物与来那度胺进行取代反应，得到具有式L所示结构的化合物；

具有式L所示结构的化合物进行脱保护反应得到具有式C-1所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物；

所述具有C-2所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式k所示结构的化合物与式f所示结构的化合物进行取代反应，得到具有式m所示结构的化合物；

具有式m所示结构的化合物进行脱保护反应，得到具有式C-2所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物；

所述具有C-3所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式k所示结构的化合物与叠氮基三甲基硅烷进行取代反应，得到具有式n所示结构的化合物：

具有式n所示结构的化合物与H₂进行氢化反应，得到具有式o所示结构的化合物；

具有式o所示结构的化合物与具有式d所示结构的化合物进行取代反应，得到具有式p所示结构的化合物；

具有式p所示结构的化合物进行脱保护反应，得到具有C-3所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物；

所述具有C-4所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物的制备方法，包括以下步骤：

具有式C-2所示结构的化合物与1-Boc-4-溴-哌啶进行取代反应，得到具有式w所示结构的化合物；

具有式w所示结构的化合物进行脱保护反应，得到具有式C-4所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物。

优选的，所述具有式D所示结构的第二GPX4配体的制备方法，包括以下步骤：

具有式t所示结构的化合物与氯乙酰氯进行取代反应，得到具有式D所示结构的第二GPX4配体；

优选的，所述具有式E所示结构的第三GPX4配体的制备方法，包括以下步骤：

具有式u所示结构的化合物与氯乙酰氯进行取代反应，得到具有式E所示结构的第三GPX4配体；

本发明提供了上述GPX4蛋白降解剂在制备抗肿瘤药物及抗耐药肿瘤药物中的应用。

本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括药物活性组分和药物辅料；所述药物活性组分为上述GPX4蛋白降解剂。

本发明提供了一种GPX4蛋白降解剂，具有式1所示结构。本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)分子结构，其母核结构作为结合靶蛋白的小分子配体，A₂取代基作为结合E3泛素连接酶复合物的小分子配体，A₁取代基作为将两个配体连接起来连接基，此结构的GPX4蛋白降解剂能够特异性识别GPX4蛋白，并将GPX4蛋白有效泛素化，从而诱导肿瘤细胞铁死亡。细胞水平和动物体内的活性评价表明，本发明提供的GPX4蛋白降解剂能够有效降解细胞内及小鼠肿瘤组织中的GPX4蛋白，并能诱导肿瘤细胞铁死亡及抑制小鼠肿瘤增长；同时，本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有良好的生物活性，在纳摩尔水平下，此降解剂能够快速高效地诱导人纤维肉瘤细胞(HT1080)中GPX4蛋白的泛素化降解，且对人肺癌细胞(Calu-1)、乳腺癌细胞(MCF7)、野生型和耐药型人非小细胞肺癌细胞(H1650)也具有很好的GPX4降解效果及抗增殖效果。

附图说明

图1为PEG Linker类降解剂的GPX4降解结果；

图2为碳链类降解剂的GPX4蛋白降解结果；

图3为降解剂降解GPX4蛋白的作用具有浓度依赖性和时间依赖性；

图4为降解剂R27通过泛素-蛋白酶体通路降解GPX4蛋白；

图5为肿瘤细胞增殖抑制实验；

图6为铁死亡机制研究试验；

图7为降解剂诱导耐药肿瘤细胞中GPX4蛋白降解及对肿瘤细胞增殖抑制作用；

图8为R27对肿瘤组织GPX4蛋白的降解作用；

图9为R27对小鼠肿瘤体积和体重的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种GPX4蛋白降解剂，具有式1所示结构：

式1中，A1为式A₁₁～A₁₃所示取代基中的任意一种：

A₂为式A₂₁～A₂₂所示取代基中的任意一种：

A₂₁中X为CH₂或CO；A₂₂中Y为CH₃或H；

所述A₁左端的连接键与A₂右端的连接键连接。

作为本发明的优选方案，所述GPX4蛋白降解剂具有式2、式3、式4、式5、式6或式7所示结构：

式2中，m为1～8；

式3中，m为1～8；

式4中，m为1～8；

式5中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式6中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式7中，n为5～20，o为0～3，Z为CO；

式8中，n为5～20，o为0～3，Z为CH₂。

传统小分子通过直接与靶蛋白的活性位点结合从而阻断蛋白的功能，而蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术利用细胞自身的蛋白质降解机制来从细胞中除去特定蛋白，是一种靶向治疗的替代方法。PROTAC分子包括三个部分：一个结合靶蛋白的小分子配体、一个结合E3泛素连接酶复合物的小分子配体和一个可将两个配体连接起来的结构稳定的连接基。这样的双功能分子可将E3泛素连接酶与靶蛋白拉近，进而将靶蛋白有效泛素化，被泛素化的靶蛋白进而被蛋白酶体降解，而PROTAC分子可继续降解新的靶蛋白。

本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)分子结构，其母核结构

作为结合靶蛋白的小分子配体，A2取代基作为结合E3泛素连接酶复合物的小分子配体，A1取代基作为将两个配体连接起来连接基，此结构的GPX4蛋白降解剂能够特异性识别GPX4蛋白，并将GPX4蛋白有效泛素化，从而诱导肿瘤细胞铁死亡。细胞水平和动物体内的活性评价表明，本发明提供的GPX4蛋白降解剂能够有效降解细胞内及小鼠肿瘤组织中的GPX4蛋白，并能诱导肿瘤细胞铁死亡及抑制小鼠肿瘤增长；同时，本发明提供的GPX4蛋白降解剂具有良好的生物活性，在纳摩尔水平下，此降解剂能够快速高效地诱导人纤维肉瘤细胞(HT1080)中GPX4蛋白的泛素化降解，且对人肺癌细胞(Calu-1)、乳腺癌细胞(MCF7)、野生型和耐药型人非小细胞肺癌细胞(H1650)也具有很好的GPX4降解效果。

①当A₁为

时，

所述GPX4蛋白降解剂的制备方法包括以下步骤：

所述叠氮基聚醇链杂环化合物具有式A-1、A-2或A-3所示结构：

所述第一GPX4配体具有式B所示结构：

在本发明中，所述叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物与第一GPX4配体的摩尔比优选为0.11∶0.12；在本发明中，所述成环反应时的催化剂优选为抗坏血酸钠和硫酸铜，所述抗坏血酸钠、硫酸铜与叠氮基聚醇链杂环化合物的摩尔比优选为0.26∶0.13∶0.11。在本发明中，所述click反应所用溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺。

在本发明中，所述成环反应的温度优选为25～100℃，更优选为时间优选为1～50h，更优选为5～20h。

所述成环反应后，本发明优选对所得成环反应液进行后处理；所述后处理优选包括以下步骤：

用水淬灭所述成环反应液，依次进行萃取、洗涤、干燥和柱分离分离，得到GPX4蛋白降解剂纯品。

在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯；所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液；所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄；所述柱层析分离的固定相优选为200～300目硅胶，流动相优选为二氯甲烷和甲醇，流动相的体积比优选为500～1000∶1。

在本发明中，所述具有式A-1所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

具有式a所示结构的聚醇化合物与具有式b所示结构的来那度胺进行取代反应，得到具有式A-1所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物；

在本发明中，所述聚醇化合物与来那度胺的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述取代反应所使用催化剂优选为K₂CO₃和KI；所述K₂CO₃、KI与来那度胺的摩尔比优选为3.24∶0.49∶1.62。在本发明中，所述取代反应所用溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为1～50h，更优选为5～20h。

所述取代反应后，本发明优选对所得取代反应液进行后处理；在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：

将所述取代反应液依次进行过滤、有机相进行萃取、洗涤和干燥，得到纯净的具有式A-1所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物。

本发明对所述过滤的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的过滤方式即可。在本发明中，所述萃取用萃取剂为乙酸乙酯和水；所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液；所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄。

在本发明中，具有式A-2所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

具有式c所示结构的聚醇化合物与具有式d所示结构的化合物进行取代反应，得到具有式A-2所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物；

在本发明中，所述聚醇化合物与具有式d所示结构的化合物的摩尔比优选为1.91∶1.59。在本发明中，所述取代反应所用溶剂优选为N，N-二异丙基乙胺。在本发明中，所述取代反应的温度优选为90℃，时间优选为8～12h。

对所述取代反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和柱层析分离，得到纯净的具有式A-2所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物。

在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯，所述萃取的次数优选为3次。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液；所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄。所述柱层析分离的固定相优选为200～300目硅胶，流动相优选为二氯甲烷和甲醇，流动相的体积比优选为500～1000∶1。

在本发明中，所述具有A-3所示结构的叠氮基聚醇链杂环化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

具有式e所示结构的聚醇化合物与具有式f所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式A-3所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物；

在本发明中，所述聚醇化合物与具有式f所示结构的化合物的摩尔比优选为0.3∶0.16。在本发明中，所述缩合反应所用缩合试剂优选为HATU，溶剂优选为N，N-二异丙基乙胺。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为室温，时间优选为1～20h，更优选为5～10h。

所述缩合反应后，本发明优选对所得缩合反应液进行后处理；在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：

对所述缩合反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和柱层析分离，得到纯净的具有A-3所示结构的叠氮基聚乙二醇链取代的E3配体化合物。

在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯，所述萃取的次数优选为3次。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选依次为5wt％柠檬酸溶液、饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液；在本发明中，所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄。所述柱层析分离的固定相优选为200～300目硅胶，流动相优选为二氯甲烷和甲醇，流动相的体积比优选为500～1000∶1。

在本发明中，所述具有式B所示结构的第一GPX4配体的制备方法，包括以下步骤：

在本发明中，所述具有式i所示结构的化合物与氯乙酰氯的摩尔比优选为0.8∶0.96，所述取代反应的温度条件优选为冰浴，时间优选为1～20h，更优选为7h。

在本发明中，所述具有式i所示结构的化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

对甲酰基苯甲酸与丙炔酸进行缩合反应，得到具有式g所示结构的化合物：

在本发明中，所述对甲酰基苯甲酸与丙炔酸的摩尔比优选为53.29∶79.93；所述缩合反应的溶剂优选为THF。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为室温，时间优选为14h。

具有式g所示结构的化合物与具有式h所示结构的化合物进行成环反应，得到具有式i所述结构的化合物；

在本发明中，所述具有式g所示结构的化合物与具有式h所示结构的化合物的摩尔比优选为10.68∶11.75；在本发明中，所述成环反应的温度优选为回流温度，时间优选为8～12h。

②当A₁为

时，所述GPX4蛋白降解剂的制备方法包括以下步骤：

含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物与第二配体发生缩合反应或与第三配体发生亲核取代反应，得到GPX4蛋白降解剂；

所述含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物具有式C-1、式C-2或式C-3所示结构：

所述第二GPX4配体具有式D所示结构：

在本发明中，所述含哌嗪环碳链杂环化合物与第二配体的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述缩合反应所用缩合试剂优选为HATU，溶剂优选为N，N-二异丙基乙胺。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为室温，时间优选为5h。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为室温，时间优选为2h。

所述缩合反应完成后，本发明优选对所得缩合反应液进行后处理；在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：

对所述缩合反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和柱层析分离，得到GPX4蛋白降解剂纯品。

在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为水和乙酸乙酯；所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液；在本发明中，所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄。所述柱层析分离的固定相优选为200～300目硅胶，流动相优选为二氯甲烷和甲醇，流动相的体积比优选为500～1000∶1。

所述第三GPX4配体具有式E所示结构：

在本发明中，所述合哌嗪环碳链杂环化合物与第三配体的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述亲核取代反应所用试剂优选为K₂CO₃和KI，溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述反应的温度优选为50～150℃，时间优选为2-10h。在本发明中，所述亲核取代反应的温度优选为50～150℃，时间优选为2～10h。

所述取代反应完成后，本发明优选对所得缩合反应液进行后处理；在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：

在本发明中，所述具有式C-1所示结构的含哌嗪环碳链杂环化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

在本发明中，所述溴代烷醇与1-Boc-哌嗪的摩尔比优选为2.95∶2.68；在本发明中，所述取代反应所用催化剂优选为K₂CO₃和KI；所述取代反应所用溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为2h。

对所述取代反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和色谱柱分离，得到纯净的式j所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式j所示结构的化合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比优选为3.66∶5.49；在本发明中，所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为8～12h。

在本发明中，所述具有式k所示结构的化合物与来那度胺的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述取代反应所用催化剂优选为K₂CO₃和KI；所述取代反应所用溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为2h。

具有式L所示结构的化合物进行脱保护反应得到具有式C-1所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物。

在本发明中，所述脱保护反应所用脱保护试剂优选为TFA；所述脱保护反应所用溶剂优选为DCM。在本发明中，所述脱保护反应的温度优选为室温，时间优选为30min。

在本发明中，所述具有式C-2所示结构的含哌嗪环碳链杂环化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

在本发明中，所述具有式k所示结构的化合物与式f所示结构的化合物的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述取代反应所用催化剂优选为K₂CO₃和KI；所述取代反应所用溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为8～12h。

在本发明中，所述取代反应后，本发明优选对所得取代反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

对所述取代反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和色谱柱分离，得到纯净的具有式m所示结构的化合物。

在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯和水，所述萃取的次数优选为三次。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液洗涤，所述干燥用干燥剂优选为无水Na₂SO₄；在本发明中，所述柱层析分离的固定相优选为200～300目硅胶，流动相优选为二氯甲烷和甲醇，流动相的体积比优选为500～1000∶1。

在本发明中，所述脱保护反应所用脱保护试剂优选为TFA，所述脱保护反应所用溶剂优选为DCM。在本发明中，所述脱保护反应的温度优选为室温，时间优选为0.1～5h，更优选为0.5h。

在本发明中，所述具有C-3所示结构的含哌嗪环碳链杂环化合物的制备方法，包括以下步骤：

在本发明中，所述具有式k所示结构的化合物与叠氮基三甲基硅烷的摩尔比优选为3∶1；在本发明中，所述取代反应的催化剂优选为KF，所述KF与叠氮基三甲基硅烷的摩尔比优选为1∶1。在本发明中，所述取代反应的温度优选为60℃，时间优选为2h。

所述取代反应后，本发明优选对所得取代反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

对所述取代反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和浓缩，得到纯净的具有式n所示结构的化合物。

在本发明中，所述氢化反应的催化剂优选为5wt％Pd/C；在本发明中，所述氢化反应的时间优选为2h。

在本发明中，具有式o所示结构的化合物与具有式d所示结构的化合物的摩尔比优选为1∶2；所述取代反应的溶剂优选为DMF和DIPEA；在本发明中，所述取代反应的温度优选为90℃，时间优选为8～12h。

具有式p所示结构的化合物进行脱保护反应，得到具有C-3所示结构的含哌嗪环碳链杂环化合物。

在本发明中，所述具有式D所示结构的第二GPX4配体的制备方法，优选包括以下步骤：

具有式t所示结构的化合物与氯乙酰氯进行取代反应，得到具有式D所示结构的第二GPX4配体。

在本发明中，所述具有式t所示结构的化合物与氯乙酰氯的摩尔比优选为0.23∶0.27；所述取代反应的催化剂优选为NaHCO₃；所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为8～12h。

在本发明中，所述具有式t所示结构的化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

对甲酰苯甲酸与间溴苄溴进行取代反应，得到具有式q所示结构的化合物；

在本发明中，所述对甲酰苯甲酸与间溴苄溴的摩尔比优选为19.98∶23.98；在本发明中，所述取代反应所用催化剂优选为K₂CO₃；所述取代反应所用溶剂优选为DMF。在本发明中，所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为8h。

在三乙醇胺条件下，具有式q所示结构的化合物与具有式g所示结构的化合物进行成环反应，得到具有式r所示结构的化合物；

在本发明中，所述三乙醇胺、具有式q所示结构的化合物与具有式g所示结构的化合物的摩尔比优选为11.61∶9.40∶8.93；在本发明中，所述成环反应的溶剂优选为DCM。在本发明中，所述成环反应的温度优选为回流温度，时间优选为8～12h。

具有式r所示结构的化合物与H₂进行氢化反应，得到具有式t所示结构的化合物；

在本发明中，所述氢化反应的催化剂优选为5wt％Pd/C；在本发明中，所述氢化反应的时间优选为30min。

在本发明中，所述具有式t所示结构的化合物与氯乙酰氯的摩尔比优选为0.1∶10～0.1∶20；所述取代反应的催化剂优选为NaHCO₃；所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为8～12h。

在本发明中，所述具有式E所示结构的第三GPX4配体的制备方法，优选包括以下步骤：

具有式u所示结构的化合物与氯乙酰氯进行取代反应，得到具有式E所示结构的第三GPX4配体。

在本发明中，所述具有式u所示结构的化合物与氯乙酰氯的摩尔比优选为0.23∶0.27；所述取代反应的催化剂优选为NaHCO₃；所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为8～12h。

在本发明中，所述具有式u所示结构的化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

对甲基苯甲醛与具有式g所示结构的化合物进行成环反应，得到具有式v所示结构的化合物；

在本发明中，所述对甲基苯甲醛与具有式g所示结构的化合物的摩尔比优选为11.61∶9.40∶8.93；在本发明中，所述成环反应的溶剂优选为DCM。在本发明中，所述成环反应的温度优选为回流温度，时间优选为8～12h。

具有式v所示结构的化合物与NBS进行自由基取代反应，得到具有式u所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式v所示结构的化合物与NBS的摩尔比优选为1∶1.2；在本发明中，所述自由基取代反应的溶剂优选为CCl₄。在本发明中，所述自由基取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为5～9h。

在本发明中，所述具有C-4所示结构的合哌嗪环碳链杂环化合物的制备方法，包括以下步骤：

在本发明中，所述具有式C-2所示结构的化合物与1-Boc-4-溴-哌啶的摩尔比优选为1∶1；在本发明中，所述取代反应所用催化剂优选为K₂CO₃和KI；所述取代反应所用溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述取代反应的温度优选为回流温度，时间优选为8～12h。

对所述取代反应液依次进行萃取、有机相洗涤、干燥和色谱柱分离，得到纯净的具有式w所示结构的化合物。

具有式w所示结构的化合物进行脱保护反应，得到具有式C-4所示结构的含哌嗪环碳链取代的E3配体化合物；

本发明提供了上述GPX4蛋白降解剂在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤细胞优选为人纤维肉瘤细胞、人乳腺癌细胞和人肺癌细胞中的一种或几种。

本发明提供了一种抗肿瘤细胞药物，包括药物活性组分和药物辅料；所述药物活性组分为上述GPX4蛋白降解剂；本发明对所述药物辅料没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的药物辅料即可。在本发明中，所述药物活性成分在药物中的有效含量为1～50wt％，优选为5～30wt％。

下面结合实施例对本发明提供的一种GPX4蛋白降解剂及其制备方法和应用、一种抗肿瘤细胞药物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下实施例中，所提及的GPX4降解剂中间体结构如表1所示：

表1GPX4降解剂中间体结构

所提及的GPX4降解剂结构如表2所示：

表2GPX4降解剂结构

实施例1GPX4蛋白降解剂R1的合成

(1)第一GPX4配体的合成

a.式g所示化合物的合成

将对甲酰基苯甲酸(8.00g，53.29mmol)、丙炔酸(4.40g，79.93mmol)溶于THF(120mL)中，然后加入EDCI(15.32g，79.93mmol)、HOBT(10.80g，79.93mmol)，室温反应14h。反应结束后，减压旋去部分溶剂，用水和乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝5/1、2/1)得白色固体，得到式g所示化合物，记为RSL3-Q1。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.09(s，1H，CHO)，9.17(t，J＝2.68Hz，1H，CONH)，7.80-8.06(m，4H，Ar-H)，4.09(dd，J＝5.52，2.48Hz，2H，CH₂)，3.16(t，J＝2.48Hz，1H，CH)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ193.34，165.61，139.20，138.39，129.91，128.48，81.45，73.54，29.12.

b.式i所示化合物的合成

将D-色氨酸甲酯盐酸盐(2.57g，11.75mmol)溶于15mL DCM中，加入TEA(1.32g，13.08mmol)，室温搅拌1小时。过滤，滤液旋干干燥，用30mL DCM溶解，依次加入RSL3-Q1(2.00g，10.68mmol)、TFA(61mg，0.53mmol)和

分子筛，回流反应1小时后再次加入TFA(1.83g，16.02mmol)然后回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，用30％NaOH溶液淬灭，有机相分离，依次用饱和NaCl溶液洗涤三次和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝80/1)得白色固体，得到式i所示化合物，记为RSL3-Q2(0.50g，13％).¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.65(s，1H，NH)，8.90(t，J＝5.52Hz，1H，CONH)，7.82(d，J＝8.36Hz，2H，Ar-H)，7.46(d，J＝7.68Hz，1H，Ar-H)，7.36(d，J＝8.28Hz，2H，Ar-H)，7.25(d，J＝7.92Hz，1H，Ar-H)，7.02-7.06(m，1H，Ar-H)，6.96-6.70(m，1H，Ar-H)，5.38(s，1H，CH)，4.05(dd，J＝5.52，2.48Hz，2H，CH₂)，3.76-3.81(m，1H，CH)，3.63(s，3H，CH₃)，3.29(s，1H，NH)，3.12(t，J＝2.48Hz，CH)，2.89-3.11(m，2H，CH₂)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ174.25，166.18，146.91，136.61，134.35，133.29，128.67，127.65，126.95，121.40，118.88，118.16，111.55，107.14，81.83，73.26，54.17，52.34，52.13，28.92，25.19.

c.第一GPX4配体的合成

将RSL3-Q2(0.31g，0.80mmol)用8mL dry DCM溶解，加入NaHCO₃(74mg，0.88mmol)，然后在冰浴下分批加入氯乙酰氯(0.11g，0.96mmol)，室温反应7h。反应结束后，用水淬灭反应液，乙酸乙酯提取三次，有机相用饱和NaCl溶液洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥。减压除去部分溶剂析出大量白色固体，过滤，滤饼用少量乙醚洗涤，干燥得白色固体RSL3-Q3(0.24g，65％)，即为第一GPX4配体，记为RSL3-Q3。

(2)式A-1所示化合物的合成

a.中间体PEG1-4的合成

将对甲苯磺酰氯(3.50g，18.40mmol)溶解在100mL DCM中制成溶液1；将二缩三乙二醇(11.00g，73.00mmol)溶解在100mL DCM中并依次加入TEA(1.95g，19.00mmol)和DMAP(46mg，0.30mmol)制成溶液2，在冰浴下搅拌平衡10min。然后在冰浴下将溶液1用滴液漏斗缓慢加入到溶液2中，两小时内滴加完毕，室温反应过夜。反应结束后，用100mL水淬灭，并用DCM萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝3/1)得淡黄色液体PEG1-4(2.59g，46％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.79(d，J＝8.32Hz，2H，Ar-H_a)，7.33(d，J＝7.96Hz，2H，Ar-H_b)，4.15-4.18(m，2H，CH₂)，3.68-3.72(m，4H，CH₂)，3.60(s，4H，CH₂)，3.56-3.58(m，2H，CH₂)，2.44(s，3H，CH₃)，2.07(s，1H，OH)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ144.87，132.95，129.83，127.96，72.47，70.78，70.29，69.15，68.71，61.75，21.64.

b.中间体PEG1-5的合成

将三甲基叠氮基硅烷(2.84g，24.64mmol)溶于8mL dry DMF中，加入KF(1.43g，24.64mmol)，混匀，室温搅拌0.5h。然后向反应体系中加入化合物PEG1-4(2.50g，8.21mmol)的dry DMF(7mL)溶液，加热至60℃反应1.5h。反应结束后冷却至室温，用冰水淬灭，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用1N NaOH溶液和饱和NaCl溶液洗涤三次，并用无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝3/1)得淡黄色液体PEG1-5(0.73g，51％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.71-3.74(m，2H，CH₂)，3.65-3.68(m，6H，CH₂)，3.59-3.61(m，2H，CH₂)，3.39(t，J＝5.16Hz，2H，CH₂)，2.29(s，1H，OH)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ72.50，70.65，70.37，70.03，61.74，50.65.

c.中间体PEG1-7的合成

将PEG1-5(0.73g，4.16mmol)溶解在13mL氯仿中，逐滴加入PBr3(3.37g，12.47mmol)，5分钟内滴加完毕，然后50℃回流反应过夜。反应结束后，用饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，氯仿提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥，旋去溶剂的液体混合物PEG1-6(0.39g)。将来那度胺(0.42g，1.62mmol)用30mL CH₃CN溶解，依次加入液体混合物PEG1-6(0.39g，1.62mmol)、K₂CO₃(0.45g，3.24mmol)和KI(80mg，0.49mmol)，加热回流5h。反应结束后，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取，有机相依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝50/1)得浅红色液体PEG1-7(0.39g，23％)，即式A-1所示化合物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.28-7.35(m，2H，Ar-H)，6.87(dd，J＝7.28，1.36Hz，1H，Ar-H)，5.23(dd，J＝13.40，5.12Hz，1H，CH)，4.24(q，J＝44.72，15.52Hz，2H，CH₂)，3.98-4.11(m，2H，CH₂)，3.61-3.70(m，8H，CH₂)，3.38-3.41(m，2H，CH₂)，2.82-3.01(m，2H，CH₂)，2.13-2.37(m，2H，CH₂)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.10，170.07，169.78，141.16，132.38，129.48，126.35，118.10，114.40，70.68，69.95，69.92，67.73，52.46，50.71，44.96，39.19，32.09，22.74.

(3)R1的合成

将RSL3-Q3(50mg，0.11mmol)、PEG1-7(50mg，0.12mmol)、抗坏血酸钠(53mg，0.26mmol)和五水硫酸铜(33mg，0.13mmol)溶于5mL DMF中，室温反应5h。反应结束后，用水淬灭反应液，用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝50/1)得白色固体R1(86mg，89％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.00(s，1H，NH)，8.96(t，J＝6.20Hz，1H，CONH)，7.77-7.93(m，3H，Ar-H)，7.50-7.64(m，3H，Ar-H)，7.21-7.34(m，2H，Ar-H)，6.96-7.10(m，3H，Ar-H)，6.86(d，J＝7.88Hz，1H，Ar-H)，6.06(s，1H，CH)，5.43(brs，1H，CH)，5.20(dd，J＝13.32，4.92Hz，1H，CH)，4.76(d，J＝14.00Hz，1H，CH_2a)，4.44-4.51(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.16(q，J＝58.88，17.00Hz，2H，CH₂)，3.74-3.90(m，4H，CH₂×2)，3.41-3.62(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.77-3.01(m，2H，CH_2a)，2.03-2.36(m，2H，CH_2b)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，171.07，169.35，168.19，166.31，160.59，147.48，145.56，143.83，136.87，134.28，133.03，132.70，129.33，127.77，126.26，126.16，123.62，121.93，121.79，119.34，118.48，117.12，111.78，111.14，104.03，69.88，69.81，69.18，67.29，57.03，56.51，53.24，52.54，49.69，46.02，43.76，39.01，35.29，31.87，23.92，22.46；M.P.223-224℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₄₄H₄₇ClN₉O₉(M+H)₊：880.3185；found 880.3185.

实施例2～4GPX4蛋白降解剂R2～4的合成

实施例2-4与实施例1的区别在于，在制备具有式PEG1-7所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R2的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.93(s，1H，NH)，8.91(t，J＝7.76Hz，1H，CONH)，7.74-7.89(m，3H，Ar-H)，7.46-7.61(m，3H，Ar-H)，7.18-7.30(m，2H，Ar-H)，6.92-7.08(m，3H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.88Hz，1H，Ar-H)，6.02(s，1H，CH)，5.39(brs，1H，CH)，5.18(dd，J＝13.24，4.92Hz，1H，CH)，4.72(d，J＝14.00Hz，1H，CH_2a)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.11(q，J＝57.08，16.76Hz，2H，CH₂)，3.73-3.88(m，4H，CH₂×2)，3.39-3.59(m，15H，CH₂×6&CH₃)，2.74-3.04(m，2H，CH₂)，2.02-2.33(m，2H，CH₂)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，171.07，169.37，168.20，166.26，159.34，145.53，144.04，136.88，134.27，133.07，132.68，129.31，127.75，126.17，126.12，123.61，123.59，121.81，121.78，119.34，118.48，116.98，111.79，110.99，104.00，70.07，70.06，69.95，69.92，69.15，67.23，57.04，56.53，53.22，52.54，49.68，45.99，43.73，39.38，39.03，35.31，25.58，22.48.M.P.199-200℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₄₆H₅₁ClN₉O₁₀(M+H)₊：924.3447；found 924.3448.

R3的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.94(s，1H，NH)，8.92(t，J＝5.72Hz，1H，CONH)，7.74-7.89(m，3H，Ar-H)，7.46-7.62(m，3H，Ar-H)，7.18-7.30(m，2H，Ar-H)，6.94-7.06(m，2H，Ar-H)，6.93(d，J＝7.36Hz，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.88Hz，1H，Ar-H)，6.02(s，1H，CH)，5.42(s，1H，NH)，5.40(brs，1H，CH)，5.18(dd，J＝13.40，5.08Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝13.72Hz，1H，CH_2a)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.16(q，J＝57.76，16.96Hz，2H，CH₂)，3.74-3.89(m，4H，CH₂×2)，3.39-3.59(m，19H，CH₂×8&CH₃)，2.74-3.05(m，2H，CH₂)，2.01-2.33(m，2H，CH₂)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.14，171.08，169.36，168.19，166.30，161.36，147.45，145.55，144.09，136.88，134.31，133.04，132.67，129.31，127.76，126.16，126.08，123.60，121.90，121.78，119.34，118.48，116.94，111.77，110.94，104.03，70.18，70.14，70.08，70.05，69.94，69.93，69.14，67.23，57.01，56.52，53.24，52.53，49.68，45.98，43.74，39.02，35.30，31.88，23.92，22.48；M.P.145-146℃；HRMS(ESI+)：m/zcalculated for C₄₈H₅₅ClN₉O₁₁(M+H)₊：968.3710；found 968.3717.

R4的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.96(s，1H，NH)，8.92(t，J＝5.88Hz，1H，CONH)，7.74-7.90(m，3H，Ar-H)，7.46-7.61(m，3H，Ar-H)，7.18-7.30(m，2H，Ar-H)，6.92-7.04(m，3H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.56Hz，1H，Ar-H)，6.03(s，1H，CH)，5.42(s，1H，NH)，5.40(brs，1H，CH)，5.18(dd，J＝13.44，5.12Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝14.20Hz，1H，CH_2a)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.16(q，J＝58.12，16.92Hz，2H，CH₂)，3.75-3.90(m，4H，CH₂×2)，3.41-3.55(m，23H，CH₂×10&CH₃)，2.74-3.06(m，2H，CH₂)，2.02-2.34(m，2H，CH₂)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.14，171.08，169.37，168.19，166.31，162.21，149.37，145.57，144.10，136.87，134.27，133.05，132.67，129.30，127.75，126.16，126.09，123.62，121.99，121.78，119.34，118.48，116.94，111.77，110.93，104.64，70.20，70.16，70.15，70.14，70.10，70.08，70.04，69.95，69.15，67.23，57.05，56.52，53.25，52.53，49.69，45.99，43.76，39.02，35.30，31.88，25.40，22.48；M.P.133-134℃；HRMS(ESI+)：m/z calculatedfor C₅₀H₅₉ClN₉O₁₂(M+H)₊：1012.3972；found 1012.3968.

实施例5GPX4蛋白降解剂R5的合成

(1)具有式A-2所示结构的化合物的合成

a.中间体PEG1-1的合成

将二缩三乙二醇(3.00g，19.98mmol)、TEA(6.07mL，59.94mmol)溶于15mL DCM中，冰盐浴下滴加pTsCl(7.62g，39.95mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液，继续反应4h。反应结束后，加水淬灭反应，用DCM萃取三次，合并有机相，依次用1N HCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝5/1、2/1)得白色固体PEG1-1(4.72g，52％)，不经分离进行下一步反应。

b.中间体PEG1-2的合成

将叠氮基三甲基硅烷(1.60g，13.89mmol)溶于5mL dry DMF中，加入KF(0.81g，13.89mmol)，混匀，室温搅拌0.5h。然后向体系中加入化合物三甘醇二对甲苯磺酸酯(1.06g，2.32mmol)，加热至60℃反应2h。反应结束后冷却至室温，用冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，依次用1N NaOH溶液和饱和NaCl溶液洗涤三次，然后用无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝10/1、6/1)得浅绿色液体PEG1-2(437.7mg，94％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.68-3.70(m，4H，CH₂)，3.39(t，J＝5.08Hz，CH₂)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ70.74，70.13，50.71.

c.中间体PEG1-3的合成

将化合物PEG1-2(1.62g，8.08mmol)溶于25mL乙酸乙酯中，加入10mL 1N HCl溶液室温下加入PPh3(2.12g，8.08mmol)，继续反应14h。反应结束后，用水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取两次，水相用1N NaOH溶液调节pH至12-13，然后用二氯甲烷提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥，减压旋去溶剂得浅红色液体PEG1-3(0.79g，56％)，未经分离进行下一步反应。

d.中间体F-SA-pre的合成

将Boc-L-谷氨酰胺(3.00g，12.18mmol)溶于50mL THF中，依次加入CDI(2.37g，14.62mmol)和DMAP(7mg，0.05mmol)，回流反应10h。反应结束后旋去溶剂，用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝50/1)得白色固体F-SA-pre(2.07g，75％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.73(s，1H，NH)，7.12(d，J＝8.68Hz，1H，NH)，4.19-4.26(m，1H，CH)，2.50-2.76(m，2H，CH₂)，1.86-1.96(m，2H，CH₂)，1.40(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.42，172.96，155.85，78.61，50.86，31.44，28.64，24.89.

e.中间体F-SA的合成

3-氟酞酐(1.64g，5.98mmol)、F-SA-pre(1.50g，6.57mmol)、乙酸钠(0.65g，7.88mmol)溶于15mL乙酸中，回流反应12h。反应结束后，冷却至室温，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaHCO₃溶液饱、NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。减压除去溶剂，残余物加入乙酸乙酯(5mL)和石油醚(10mL)，搅拌，过滤得类白色固体F-SA(1.58g，87％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.15(s，1H，NH)，7.92-7.97(m，1H，Ar-H)，7.71-7.80(m，2H，Ar-H)，5.14-5.18(m，1H，CH)，2.85-2.94(m，1H，CH_2-a)，2.46-2.63(m，2H，CH_2-b×2)，2.04-2.10(m，1H，CH_2-a)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.16，170.12，166.55，164.40，158.56，155.95，138.53，138.45，133.89，123.54，123.35，120.50，120.47，117.55，117.42，49.55，31.36，22.30.

f.中间体PEG1-8的合成

将F-SA(0.44g，1.59mmol)用8mL dry DMF溶解，依次加入PEG1-3(0.33g，1.91mmol)和DIPEA(0.41g，3.18mmol)，90℃反应过夜。冷却至室温，加水，用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝3/1)得黄色油状物PEG1-8(0.23g，33％)，即具有式A-2所示结构的化合物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.46(s，1H，NH)，7.50(t，J＝8.40Hz，1H，Ar-H)，7.11(d，J＝7.12Hz，1H，Ar-H)，6.93(d，J＝8.56Hz，1H，Ar-H)，6.51(t，J＝5.88Hz，1H，NH)，4.91-4.96(m，1H)，3.75(t，J＝5.40Hz，2H，CH₂)，3.68-3.70(m，6H，CH₂×3)，3.48(dd，J＝10.28，5.12Hz，2H，CH₂)，3.38-3.40(m，2H，CH₂)，2.10-2.90(m，4H，CH₂×2)；¹³CNMR(400MHz，CDCl₃)δ171.28，169.29，168.49，167.62，146.83，136.03，132.49，116.79，111.65，110.28，70.72，70.70，70.09，69.58，50.69，48.86，42.38，31.40，22.76.

(2)R5的合成

以PEG1-8和RSL3-Q3为原料，操作及处理同R1，得黄色固体R5(47mg，59.1％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ9.27-9.76(m，2H，NH×2)，7.32-7.78(m，6H，Ar-H)，6.98-7.21(m，6H，Ar-H&NH)，6.82(d，J＝8.00Hz，1H，Ar-H)，6.48(brs，1H，NH)，6.03(brs，1H，CH)，5.09(s，1H，CH)，4.82-4.93(m，1H，CH)，4.43-4.58(m，3H，CH_2a&CH₂)，4.01-4.10(m，1H，CH_2b)，3.14-3.79(m，17H，CH₂×7&CH₃)，2.51-2.76(m，3H，CH_2c×2&CH_2d)，1.98-2.13(m，1H，CH_2d)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.11，171.89，169.49，169.34，168.65，167.74，160.85，146.72，146.69，136.92，136.13，132.42，128.11，127.46，126.25，126.05，122.25，119.64，118.26，118.21，116.92，116.88，111.67，111.51，111.46，110.12，110.09，70.47，70.35，70.27，69.41，69.35，69.14，69.06，50.36，48.98，42.18，35.26，31.32，29.70，22.73，14.13；M.P.152-153℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₄₄H₄₅ClN₉O₁₀(M+H)₊：894.2978；found894.2978.

实施例6～8GPX4蛋白降解剂R6～8的合成

实施例6～8与实施例5的区别在于，在制备具有式PEG1-8所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R6的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ9.15-9.43(m，2H，NH×2)，7.77(br，1H，Ar)，7.40-7.63(m，5H，Ar-H)，7.00-7.24(m，6H，Ar-H&NH)，6.86(d，J＝8.60Hz，1H，Ar-H)，6.48(brs，1H，NH)，6.07(brs，1H，CH)，5.17(s，1H，CH)，4.83-4.92(m，1H，CH)，4.61(br，1H，CH_2a)，4.43(br，2H，CH₂)，4.12-4.16(m，1H，CH_2b)，3.79(brs，2H，CH₂)，3.22-3.68(m，19H，CH₂×8&CH₃)，2.60-2.79(m，3H，CH_2c×2&CH_2d)，1.98-2.10(m，1H，CH_2d)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ171.78，171.69，169.34，169.12，168.69，167.72，161.06，146.78，146.75，136.92，136.07，132.41，127.54，126.39，126.08，123.77，123.69，122.27，119.69，119.67，118.31，116.92，116.86，111.61，111.40，110.11，110.08；M.P.112-113℃；HRMS(ESI+)：m/zcalculated for C₄₆H₄₉ClN₉O₁₁(M+H)₊：938.3240；found 924.3253.

R7的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ9.10-9.43(m，2H，NH×2)，7.40-7.76(m，6H，Ar-H)，7.01-7.25(m，6H，Ar-H&NH)，6.85(d，J＝8.56Hz，1H，Ar-H)，6.50(brs，1H，NH)，6.07(brs，1H，CH)，5.18(s，1H，CH)，4.82-4.92(m，1H，CH)，4.59-4.64(m，1H，CH_2a)，4.43(brs，2H，CH₂)，4.10-4.13(m，1H，CH_2b)，3.78(br，2H，CH₂)，3.39-3.71(m，23H，CH₂×10&CH₃)，2.59-2.80(m，3H，CH_2c×2&CH_2d)，1.95-2.07(m，1H，CH_2d)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ171.68，171.58，169.36，169.05，167.73，167.70，160.99，146.77，146.74，136.92，136.89，136.10，132.42，132.41，128.29，126.45，126.39，126.05，123.75，122.26，122.22，119.64，118.27，116.87，111.67，111.40，110.17，70.65，70.60，70.46，70.42，70.40，70.36，70.30，70.27，69.28，69.20，69.18，50.20，48.92，42.27，35.18，31.37，31.31，29.67，22.74；M.P.119-120℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₄₈H₅₃ClN₉O₁₂(M+H)₊：982.3502；found 982.3503.

R8的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ9.29-9.66(m，2H，NH×2)，7.32-7.88(m，7H，Ar-H)，7.08-7.25(m，5H，Ar-H&NH)，6.89(d，J＝7.96Hz，1H，Ar-H)，6.56(brs，1H，NH)，6.12(brs，1H，CH)，5.20(s，1H，CH)，4.88-5.00(m，1H，CH)，4.50(brs，3H，CH_2a&CH₂)，4.09-4.15(m，1H，CH_2b)，3.84(br，2H，CH₂)，3.38-3.74(m，27H，CH₂×12&CH₃)，2.61-2.84(m，3H，CH_2c×2&CH_2d)，2.01-2.07(m，1H，CH_2d)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ171.64，169.41，169.07，168.57，167.79，167.71，160.16，146.80，146.76，136.98，136.93，136.16，132.47，132.45，126.54，126.48，126.05，122.26，119.58，118.32，118.26，116.95，111.68，111.50，111.41，110.23，110.18，70.64，70.61，70.56，70.49，70.43，70.35，70.32，70.30，70.18，70.17，69.26，69.25，69.18，49.01，42.30，31.43，29.70，29.32，27.22，22.68，14.12；M.P.105-106℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₀H₅₇ClN₉O₁₃(M+H)₊：1026.3764；found 1026.3783.

实施例9GPX4蛋白降解剂R9的合成

(1)具有式A-3所示结构的化合物的合成

a.中间体V1的合成

将(S)-1-(4-溴苯)乙胺(2.00g，10.00mmol)用EA/H2O(20mL/20mL)溶解，依次加入NaHCO₃(0.59g，7.00mmol)和(Boc)2O(2.62g，12.00mmol)，室温搅拌1h。反应结束后用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝40/1)得白色固体V1(1.80g，60％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.47(d，J＝8.48Hz，2H，Ar-H_a)，7.20(d，J＝8.36Hz，2H，Ar-H_b)，4.76(br，2H，CH₂)，4.70-4.84(m，2H，CH&NH)，1.37-1.48(m，12H，CH₃&CH₃×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ154.97，143.30，131.60，127.59，120.81，79.60，49.80，28.36，22.60.

b.中间体V2的合成

将V1(1.67g，5.56mmol)用20mL dry DMF溶解，依次加入4-甲基噻唑(1.10g，11.13mmol)、Pd(OAc)₂(13mg，0.056mmol)和乙酸钾(1.09g，11.13mmol)，氩气保护下90℃反应2h。反应结束后，冷却至室温，加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝15/1)得白色固体V2(0.60g，47％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.70(s，1H，Ar-H_a)，7.37-7.43(m，4H，Ar-H×4)，4.84-4.89(m，2H，CH&NH)，2.55(s，3H，CH₃)，1.45-1.50(m，12H，CH₃&CH₃×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ155.07，150.22，150.22，148.30，131.76，130.59，129.46，126.22，79.59，49.86，28.39，22.70，16.02.

c.中间体V4的合成

将V2(0.54g，1.70mmol)用20mL DCM溶解，加入10mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，将溶剂旋干得V3油状混合物1.46g，不经分离将V3混合物(1.46g，3.93mmol)用15mLDMF溶解，依次加入Boc-L-羟脯氨酸(0.76g，3.27mmol)、HATU(1.49g，3.93mmol)和DIPEA(4.23g，32.70mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，用水淬灭，乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用5％柠檬酸溶液、饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝60/1)得白色固体V4(0.42g，58％two steps)，不经分离进行下一步反应。

d.中间体V6的合成

将V4(0.41g，0.95mmol)用20mL DCM溶解，加入10mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，将溶剂旋干得V5油状混合物1.28g，不经分离将V5混合物(1.46g，3.93mmol)用15mLDMF溶解，依次加入N-Boc-L-叔亮氨酸(0.60g，2.57mmol)、HATU(1.17g，3.08mmol)和DIPEA(3.32g，25.70mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，用水淬灭，乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用5％柠檬酸溶液、饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝60/1)得白色固体V6(0.47g，90％two steps)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.74(s，1H，Ar-H_a)，7.63(d，J＝7.64Hz，1H，NH)，7.38-7.44(m，4H，Ar-H×4)，5.25(d，J＝9.00Hz，OH)，5.06-5.13(m，1H，CH)，4.79(t，J＝7.80，CH)，4.53(brs，1H，CH)，4.23(d，J＝9.12Hz，1H，CH)，3.58-4.13(m，2H，CH₂)，2.05-2.61(m，2H，CH₂)，2.56(s，3H，CH₃)，1.49(d，J＝6.92Hz，3H，CH₃)，1.43(s，9H，CH₃×3)，1.06(s，9H，CH₃×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ172.93，169.52，156.48，150.38，148.14，143.33，131.83，130.64，129.57，126.47，80.50，70.06，58.99，58.19，56.42，48.88，35.19，34.80，28.31，26.46，22.28，15.93.

e.中间体V7的合成

将V6(0.45g，0.83mmol)用20mL DCM溶解，加入10mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，在冰浴下用饱和NaHCO₃溶液中和反应液至弱碱性，然后用DCM和H2O萃取，接着依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝30/1)得黄白色固体V7(0.35g，96％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.69(s，1H，Ar-H_a)，7.76(d，J＝7.48Hz，1H，NH)，7.37-7.42(m，4H，Ar-H×4)，5.05-5.12(m，1H，CH)，4.79(t，J＝7.60，CH)，4.51(brs，1H，CH)，3.60-3.76(m，2H，CH₂)，3.38(s，1H，CH)，2.54(s，3H，CH₃)，2.05-2.49(m，2H，CH₂)，1.50(d，J＝6.92Hz，3H，CH₃)，1.02(s，9H，CH₃×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ174.36，170.01，150.24，148.46，143.37，131.60，130.80，129.53，126.39，70.02，60.46，58.58，56.39，48.89，36.06，35.66，26.19，22.32，16.09.

f.中间体PEG1-10的合成

将PEG1-5(1.19g，6.79mmol)用20mL叔丁醇溶解，加入叔丁醇钾(0.84g，7.47mmol)，室温搅拌2h。然后加入溴乙酸叔丁酯(2.36g，12.23mmol)，室温反应过夜。反应结束后，用DCM稀释，并加入水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(P/E＝4/1)得无色液体PEG1-10(0.46g，24％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ4.05(s，2H，CH₂)，3.69-3.75(m，10H，CH₂×5)，3.41(t，J＝5.20Hz，2H，CH₂)，1.50(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，CDCl₃)δ169.65，81.54，70.73，70.68，70.67，70.66，70.03，69.06，50.70，28.11.

g.中间体PEG1-12的合成

将PEG1-10(0.16g，0.56mmol)用10mL DCM溶解，加入1mL TFA，室温搅拌2h。反应结束后，加水，用DCM萃取三次，合并有机相，依次用依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥，旋去溶剂得淡黄色液体混合物PEG1-11(74mg，57％)，不经分离进行下一步反应。将V7(70mg，0.16mmol)用5mL DMF溶解，依次加入PEG1-11(74mg，0.30mmol)、HATU(92mg，0.24mmol)和DIPEA(0.12g，0.96mmol)，室温反应5h。反应结束后，加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用5％柠檬酸溶液、饱和NaHCO₃溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝40/1)得无色液体PEG1-12(85mg，81％)，即具有式A-3所示结构的化合物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.76(s，1H，Ar-H_a)，7.52(d，J＝7.68Hz，1H，NH)，7.38-7.43(m，4H，Ar-H×4)，7.36(d，J＝8.56Hz，1H，NH)，5.06-5.13(m，1H，CH)，4.76(t，J＝7.80，CH)，4.56(d，J＝8.60Hz，1H，CH)，4.53(brs，1H，CH)，4.11(d，J＝11.40Hz，1H，CH_2-a)，4.04(q，J＝15.76，5.16Hz，2H，CH₂)，3.67-3.71(m，10H，CH₂×5)，3.63(dd，J＝11.28，3.72Hz，1H，CH_2-a)，3.39(t，J＝5.16Hz)，2.56(s，3H，CH₃)，2.05-2.54(m，2H，CH_2b)，1.49(d，J＝6.96Hz，3H，CH₃)，1.08(s，9H，CH₃×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.56，170.55，169.67，150.47，147.92，143.44，131.96，130.49，129.54，126.48，71.16，70.71，70.69，70.53，70.34，70.07，70.04，58.36，57.20，56.60，50.68，48.86，35.40，35.00，26.49，22.26，15.85.

(2)R9的合成

以PEG1-12和RSL3-Q3为原料，操作及处理同R1，得灰白色固体R9(28mg，25.3％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.94(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.93(t，J＝6.28Hz，1H，NH)，8.44(d，J＝7.68Hz，1H，NH)，7.75-7.88(m，3H，Ar-H)，7.36-7.60(m，8H，Ar-H×7&NH)，7.22-7.29(m，1H，Ar)，6.95-7.06(m，2H，Ar-H)，6.03(s，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.14(d，J＝3.52Hz，1H，CH)，4.87-4.94(m，1H，CH)，4.73(d，J＝13.92Hz，1H，CH_2a)，4.55(d，J＝9.56Hz，1H，CH)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.29(br，1H，CH)，3.93(s，2H，CH₂)，3.79(t，J＝5.00Hz，2H，CH₂)，3.48-3.63(m，15H，CH₂×6&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.04-2.09(m，1H，CH)，1.75-1.81(m，1H，CH)，1.36(d，J＝6.96Hz，3H，CH₃)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，170.90，169.47，168.98，168.19，166.31，151.92，148.21，147.47，145.57，145.17，143.02，136.88，134.26，133.04，131.57，130.15，129.28，127.76，126.78，126.17，123.61，121.81，119.34，118.49，111.77，104.02，70.86，70.19，70.04，70.01，69.97，69.23，69.20，59.02，56.99，56.52，56.15，53.25，49.72，48.22，43.76，38.20，36.65，36.22，35.31，26.76，26.68，22.90，16.45；M.P.141-142℃；HRMS(ESI+)：m/zcalculated for C₅₆H₆₈ClN₁₀O₁₁S(M+H)₊：1123.4478；found 1123.4496.

实施例10～12GPX4蛋白降解剂R10～12的合成

实施例10～12与实施例9的区别在于，在制备具有式PEG1-12所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R10的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.95(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.93(t，J＝5.96Hz，1H，NH)，8.45(d，J＝7.60Hz，1H，NH)，7.75-7.91(m，3H，Ar-H)，7.37-7.61(m，8H，Ar-H×7&NH)，7.22-7.33(m，1H，Ar)，6.95-7.09(m，2H，Ar-H)，6.03(s，1H，CH)，5.40(br，1H，CH)，5.14(d，J＝3.32Hz，1H，CH)，4.87-4.94(m，1H，CH)，4.73(d，J＝13.92Hz，1H，CH_2a)，4.55(d，J＝9.48Hz，1H，CH)，4.40-4.49(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.29(brs，1H，CH)，3.95(s，2H，CH₂)，3.78(t，J＝4.68Hz，2H，CH₂)，3.46-3.63(m，19H，CH₂×8&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.00-2.09(m，1H，CH)，1.75-1.81(m，1H，CH)，1.37(d，J＝7.00Hz，3H，CH₃)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.14，170.91，169.47，168.97，168.19，166.30，151.91，148.21，147.46，145.55，145.17，141.66，136.88，134.28，133.06，131.57，130.15，129.28，127.75，126.79，126.17，123.60，121.79，119.34，118.48，111.77，104.03，70.86，70.26，70.20，70.16，70.10，70.01，69.97，69.23，69.18，59.02，56.98，56.50，56.17，53.23，49.71，48.22，43.76，38.20，36.64，36.19，35.31，26.77，26.69，22.91，16.45.M.P.110-111℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₈H₇₂ClN₁₀O₁₂S(M+H)₊：1167.4740；found 1167.4761.

R11的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.93(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.92(t，J＝4.52Hz，1H，NH)，8.44(d，J＝7.68Hz，1H，NH)，7.74-7.90(m，3H，Ar-H)，7.36-7.60(m，8H，Ar-H×7&NH)，7.21-7.29(m，1H，Ar)，6.94-7.06(m，2H，Ar-H)，6.02(s，1H，CH)，5.40(br，1H，CH)，5.14(br，1H，CH)，4.87-4.94(m，1H，CH)，4.72(d，J＝13.84Hz，1H，CH_2a)，4.55(d，J＝9.56Hz，1H，CH)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.29(brs，1H，CH)，3.96(s，2H，CH₂)，3.77(t，J＝5.04Hz，2H，CH₂)，3.43-3.61(m，23H，CH₂×10&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.03-2.08(m，1H，CH)，1.74-1.81(m，1H，CH)，1.37(d，J＝7.00Hz，3H，CH₃)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，170.91，169.47，168.97，168.19，166.30，151.92，148.21，147.45，145.57，145.17，145.06，136.87，134.27，133.01，131.57，130.14，129.29，127.76，126.78，126.17，123.61，121.76，119.35，118.48，111.78，104.02，70.88，70.74，70.27，70.19，70.17，70.15，70.07，70.04，69.96，69.23，69.17，59.02，56.98，56.51，56.17，53.24，49.69，48.22，43.75，38.20，36.64，36.19，35.30，26.77，26.69，22.91，16.45；M.P.97-98℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₆₀H₇₆ClN₁₀O₁₃S(M+H)₊：1211.5003；found 1211.5011.

R12的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.93(s，1H，NH)，8.98(s，1H，Ar-H)，8.92(t，J＝5.72Hz，1H，NH)，8.44(d，J＝7.72Hz，1H，NH)，7.74-7.90(m，3H，Ar-H)，7.36-7.61(m，8H，Ar-H×7&NH)，7.21-7.31(m，1H，Ar)，6.94-7.08(m，2H，Ar)，6.02(s，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.14(d，J＝3.48Hz，1H，CH)，4.87-4.94(m，1H，CH)，4.73(d，J＝13.84Hz，1H，CH_2a)，4.55(d，J＝9.56Hz，1H，CH)，4.40-4.48(m，5H，CH₂×2&CH_2b)，4.29(br，1H，CH)，3.96(s，2H，CH₂)，3.77(t，J＝4.96Hz，2H，CH₂)，3.43-3.62(m，27H，CH₂×12&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.02-2.08(m，1H，CH)，1.75-1.81(m，1H，CH)，1.38(d，J＝6.96Hz，3H，CH₃)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，170.91，169.47，168.97，168.19，166.28，151.92，148.21，147.47，145.56，145.17，143.12，136.88，134.27，133.09，131.57，130.15，129.29，127.78，126.79，126.17，123.59，121.78，119.35，118.48，111.78，104.03，70.89，70.75，70.30，70.27，70.23，70.21，70.18，70.15，70.07，70.05，69.97，69.24，69.17，59.03，56.98，56.52，56.17，53.23，49.70，48.22，43.76，38.19，36.64，36.19，35.31，26.78，26.70，22.91，16.45.M.P.105-106℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated forC₆₂H₈₀ClN₁₀O₁₄S(M+H)₊：1255.5265；found 1255.5278.

实施例13GPX4蛋白降解剂R13的合成

(1)具有式C-1所示结构的化合物的合成

a.中间体C7-1的合成

将7-溴-1-庚醇(0.58g，2.95mmol)用15mL CH3CN溶解，然后依次加入K₂CO₃(0.74g，5.36mmol)、KI(0.13g，0.80mmol)和1-Boc-哌嗪(0.50g，2.68mmol)，加热回流2h。反应结束后，冷却至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得淡黄色蜡状固体C7-1(505mg，65％)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ3.65(q，J＝11.96，6.20Hz，2H，CH₂)，3.50(t，J＝5.32Hz，4H，CH₂×2)，2.46(br，4H，CH₂×2)，2.40(t，J＝7.52Hz，2H，CH₂)，1.53-1.61(m，4H，CH₂×2)，1.48(s，9H，CH₃×3)，1.32-1.43(m，7H，OH&CH₂×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ154.67，79.74，62.92，58.65，58.64，52.93，32.68，29.23，28.42，27.39，26.36，25.64.

b.中间体C7-2的合成

将C7-1(1.10g，3.66mmol)用20mL DCM溶解，加入TEA(0.56g，5.49mmol)，冰浴搅拌下逐滴加入pTsCl(1.05g，5.49mmol)的DCM溶液(5mL)，室温反应过夜。反应停止后，用水淬灭，DCM萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝80/1)得淡黄色蜡状固体C7-2(770mg，46％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.80(d，J＝8.32Hz，2H，Ar-H×2)，7.36(d，J＝8.00Hz，2H，Ar-H×2)，4.03(t，J＝6.48Hz，2H，CH₂)，3.48(br，4H，CH₂×2)，2.47(s，3H，CH₃)，2.35-2.43(m，6H，CH₂×2，CH₂)，1.54-1.69(m，2H，CH₂)，1.45-1.54(m，11H，CH₃×3，CH₂)，1.27-1.36(m，6H，CH₂×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ154.67，144.63，133.22，129.79，127.86，79.72，70.57，58.55，58.55，52.93，28.78，28.76，28.42，27.19，36.36，25.27，21.64.

c.中间体C7-3的合成

将Lenalidomide(0.18g，0.68mmol)用10mL CH3CN溶解，然后依次加入C7-2(0.31g，0.68mmol)、K₂CO₃(0.11g，0.82mmol)和KI(34mg，0.20mmol)，回流反应2h。反应结束后，冷却至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得白色固体C7-3(259mg，70％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.29-7.36(m，2H，Ar-H×2)，6.87(dd，J＝7.40，1.28Hz，1H，Ar-H)，5.20(dd，J＝13.44，5.16Hz，1H，CH)，4.26(q，J＝52.32，15.40Hz，2H，CH₂)，3.73-3.83(m，4H，CH₂×2)，3.48(t，J＝4.52Hz，4H，CH₂×2)，2.96-3.02(m，1H，CH_2-a)，2.81-2.91(m，1H，CH_2-b)，2.35-2.45(m，6H，CH₂×2，CH₂)，2.25-2.32(m，1H，CH_2-b)，2.15-2.21(m，1H，CH_2-a)，1.51-1.54(m，2H，CH₂)，1.47(s，9H，CH₃×3)，1.29-1.35(m，6H，CH₂×3)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ170.98，169.91，169.81，154.64，141.17，132.40，129.49，126.28，118.09，114.47，79.74，58.73，58.57，52.90，52.49，45.02，40.56，32.23，29.47，28.93，28.41，27.82，27.23，26.74，22.90.

d.中间体C7-4的合成

将C7-3(0.20g，0.37mmol)用10mL DCM溶解，加入1mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，减压除去溶剂得浅黄色液体混合物C7-4，不经分离进行下一步反应。

e.中间体RSL3-S1的合成

将4-甲酰苯甲酸(3.00g，19.98mmol)、无水K₂CO₃(4.14g，29.97mmol)溶于20mL DMF中，加入间溴苄溴(5.99g，23.98mmol)，室温反应8h。反应结束后，加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥，旋去溶剂得白色蜡状固体RSL3-S1(6.08g，95.3％)，不经分离进行下一步反应；

f.中间体RSL3-S2的合成

将色氨酸甲酯盐酸盐(2.28g，8.93mmol)加入到30mL DCM中，加入TEA(1.18g，11.61mmol)，室温搅拌1h，过滤，滤液旋干干燥，用40mL DCM溶解，然后依次加入RSL3-S1(3.00g，9.40mmol)、

分子筛和TFA(0.11g，0.94mmol)，回流反应1h后再次加入TFA(3.22g，28.20mmol)，继续回流反应过夜。反应结束后，冷却至室温，用30％NaOH溶液淬灭反应，有机相萃取分离，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥，柱分离(P/E＝10/1)得淡黄色蜡状固体RSL3-S2(2.5g，54％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.03(d，J＝8.24Hz，2H，Ar-H)，7.70(s，1H，Ar-H)，7.57-7.60(m，2H，Ar-H&NH)，7.49(d，J＝7.92Hz，1H，Ar-H)，7.36-7.40(m，3H，Ar-H)，7.25-7.29(m，2H，Ar-H)，7.14-7.21(m，2H，Ar-H)，5.48(s，1H，CH)，5.33(s，2H，CH₂)，3.97(t，J＝6.12，1H，CH)，3.74(s，3H，CH₃)，3.14-3.33(m，2H，CH₂)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ174.00，165.89，147.39，138.24，136.26，132.36，131.38，131.02，130.19，130.18，129.59，128.50，126.91，126.61，122.65，122.22，119.68，118.35，110.97，108.60，65.74，54.63，52.66，52.17，24.57.

g.中间体RSL3-S3的合成

将RSL3-S2(0.50g，0.96mmol)用15mL MeOH溶解，加入100mg 5％Pd/C，氢化仪反应30min。反应结束后，过滤，滤液柱分离(D/M＝30/1)得白色固体RSL3-S3(0.15g，45％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.65(s，1H，COOH)，7.90(d，J＝8.28Hz，2H，Ar-H)，7.46(d，J＝7.64Hz，1H，Ar-H)，7.40(d，J＝8.24Hz，1H，Ar-H)，7.25(d，J＝7.92Hz，2H，Ar-H)，6.96-7.06(m，2H，Ar-H)，5.40(s，1H，CH)，3.79(dd，J＝7.16，5.32Hz，1H，CH)，3.63(s，3H，CH₃)，2.89-3.11(m，2H，CH₂)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ174.26，167.68，148.40，136.61，134.16，130.23，129.72，128.91，126.91，121.44，118.92，118.17，111.56，107.13，54.21，52.38，52.15，25.13.

h.中间体RSL3-S4的合成

将RSL3-S3(80mg，0.23mmol)用5mL DCM溶解，加入NaHCO₃(23mg，0.27mmol)，冰浴下分批加入氯乙酰氯(31mg，0.27mmol)，然后转至室温反应过夜。反应结束后，有机相萃取分离，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥柱分离(D/M＝30/1)得灰白色固体RSL3-S4(70mg，71％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ12.84(s，1H，COOH)，10.93(s，1H，NH)，7.82(d，J＝8.56Hz，2H，Ar-H)，7.47-7.54(m，3H，Ar-H)，7.23(d，J＝7.72Hz，1H，Ar-H)，6.95-7.05(m，2H，Ar-H)，6.04(s，1H，CH)，5.40(s，1H，CH)，4.73(d，J＝13.80Hz，1H，CH_2-a)，4.42(d，J＝14.08Hz，1H，CH_2-b)，3.52-3.59(m，5H，CH₂&CH₃)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ168.26，167.46，162.73，149.14，136.91，134.05，129.82，129.61，126.47，126.17，121.85，119.37，118.52，111.82，104.15，57.06，56.65，53.25，43.74，23.92.

(2)R13的合成

将RSL3-S4(77mg，0.18mmol)用8mL DMF溶解然后依次加入C7-4(80mg，0.18mmol)、HATU(96mg，0.25mmol)和DIPEA(140mg，1.08mmol)，室温搅拌2h。反应结束后，用水和乙酸乙酯萃取反应液三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝50/1)得白色固体R13(83mg，54％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.97(s，1H，NH)，7.47-7.59(m，3H，Ar-H)，7.18-7.41(m，4H，Ar-H)，6.96-7.09(m，2H，Ar-H)，6.92(d，J＝7.16Hz，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.72Hz，1H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.43(s，1H，NH)，5.40(br，1H，CH)，5.17(dd，J＝13.32，5.00Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝13.64Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝13.93Hz，1H，CH_2b)，4.15(dd，J＝54.80，16.88Hz，2H，CH₂)，3.51-3.68(m，7H，CH₂×2&CH₃)，3.36-3.41(m，2H，CH₂)，3.19-3.32(m，2H，CH₂)，2.96-3.06(m，1H，CH_2c)，2.73-2.79(m，1H，CH_2d)，2.18-2.43(m，7H，CH₂×3&CH_2d)，2.01-2.08(m，1H，CH_2c)，1.18-1.45(m，10H，CH₂×5)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.14，171.03，169.38，168.22，166.92，162.46，144.09，136.82，134.45，132.71，129.31，128.03，127.53，126.28，126.21，126.06，121.78，119.38，118.50，116.91，111.87，110.90，107.32，104.03，67.34，57.97，57.09，56.48，55.38，53.25，52.58，49.07，46.09，43.83，31.93，28.94，27.82，27.06，26.71，26.47，23.94，22.54；M.P.254-255℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₄₆H₅₃ClN₇O₇(M+H)₊：850.3695；found 850.3708.

实施例14～18GPX4蛋白降解剂R14～18的合成

实施例14-18与实施例13的区别在于，在制备具有式C-1所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R14的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.96(s，1H，NH)，7.46-7.59(m，3H，Ar-H)，7.18-7.41(m，4H，Ar-H)，6.96-7.10(m，2H，Ar-H)，6.92(d，J＝7.20Hz，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.80Hz，1H，Ar-H)，6.03(br，1H，CH)，5.42(s，1H，NH)，5.40(br，1H，CH)，5.17(dd，J＝13.36，5.04Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝13.76Hz，1H，CH2a)，4.42(d，J＝14.12Hz，1H，CH2b)，4.15(dd，J＝54.12，16.92Hz，2H，CH2)，3.51-3.68(m，7H，CH2×2&CH3)，3.35-3.42(m，2H，CH2)，3.18-3.31(m，2H，CH2)，2.97-3.06(m，1H，CH2c)，2.74-2.79(m，1H，CH2d)，2.21-2.42(m，7H，CH2×3&CH2d)，2.01-2.08(m，1H，CH2c)，1.19-1.45(m，14H，CH2×7)；13CNMR(400MHz，DMSO-d6)δ171.77，170.65，169.00，167.85，162.40，143.72，136.45，134.08，132.34，128.94，127.66，127.16，125.91，125.84，125.69，121.41，119.01，118.12，116.54，111.50，110.54，106.95，103.66，65.78，57.53，56.72，56.11，54.25，52.88，52.21，48.69，45.71，43.45，31.56，28.90，28.90，28.71，28.71，27.49，26.81，26.39，23.56，22.18.M.P.242-243℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C48H57ClN7O7(M+H)+：878.4008；found 878.4022.

R15的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.96(s，1H，NH)，7.46-7.58(m，3H，Ar-H)，7.18-7.41(m，4H，Ar-H)，6.95-7.08(m，2H，Ar-H)，6.92(d，J＝7.40Hz，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.92Hz，1H，Ar-H)，6.03(br，1H，CH)，5.43(s，1H，NH)，5.40(br，1H，CH)，5.17(dd，J＝13.36，5.04Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝13.84Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝13.92Hz，1H，CH_2b)，4.15(dd，J＝53.52，16.92Hz，2H，CH₂)，3.51-3.68(m，7H，CH₂×2&CH₃)，3.36-3.40(m，2H，CH₂)，3.17-3.31(m，2H，CH₂)，2.97-3.06(m，1H，CH_2c)，2.73-2.78(m，1H，CH_2d)，2.19-2.40(m，7H，CH₂×3&CH_2d)，2.01-2.08(m，1H，CH_2c)，1.18-1.45(m，18H，CH₂×9)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.11，171.01，169.36，169.06，168.21，161.58，144.09，136.84，134.46，132.71，129.29，127.97，127.47，127.32，126.22，126.07，121.79，119.37，118.49，116.91，111.86，110.91，105.89，104.02，74.29，58.13，57.08，56.50，54.64，53.23，52.58，47.57，46.06，43.80，31.94，29.45，29.42，29.40，29.34，29.13，27.88，27.34，26.79，26.60，23.93，22.56；M.P.149-150℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₀H₆₁ClN₇O₇(M+H)₊：906.4321；found 906.4327.

R16的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.97(s，1H，NH)，7.46-7.61(m，3H，Ar-H)，7.18-7.41(m，4H，Ar-H)，6.96-7.11(m，2H，Ar-H)，6.93(d，J＝7.40Hz，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝7.84Hz，1H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.43(s，1H，NH)，5.41(br，1H，CH)，5.17(dd，J＝13.36，5.04Hz，1H，CH)，4.74(d，J＝13.84Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝14.12Hz，1H，CH_2b)，4.15(dd，J＝53.12，16.92Hz，2H，CH₂)，3.51-3.68(m，7H，CH₂×2&CH₃)，3.35-3.44(m，2H，CH₂)，3.19-3.31(m，2H，CH₂)，2.97-3.06(m，1H，CH_2c)，2.73-2.80(m，1H，CH_2d)，2.21-2.41(m，7H，CH₂×3&CH_2d)，2.00-2.08(m，1H，CH_2c)，1.17-1.45(m，20H，CH₂×10)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，171.03，169.37，168.23，162.46，144.11，136.82，134.46，132.72，129.31，128.03，127.53，126.29，126.22，126.07，121.78，119.38，118.50，116.91，111.87，110.91，107.33，104.04，67.35，57.97，57.09，56.48，54.68，53.25，52.58，49.07，46.08，43.83，31.94，29.45，29.44，29.43，29.42，29.36，29.15，27.88，27.24，26.80，25.98，23.94，22.56.M.P.132-133℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₁H₆₃ClN₇O₇(M+H)₊：920.4478；found 920.4495.

R17的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.95(s，1H，NH)，7.47-7.57(m，3H，Ar-H)，7.17-7.38(m，4H，Ar-H)，6.95-7.06(m，2H，Ar-H)，6.92(d，J＝7.16Hz，1H，Ar-H)，6.80(d，J＝7.88Hz，1H，Ar-H)，6.03(br，1H，CH)，5.41(s，1H，NH)，5.39(brs，1H，CH)，5.16(dd，J＝13.36，5.08Hz，1H，CH)，4.72(d，J＝13.88Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝14.40Hz，1H，CH_2b)，4.16(dd，J＝52.96，16.92Hz，2H，CH₂)，3.51-3.68(m，7H，CH₂×2&CH₃)，3.33-3.40(m，2H，CH₂)，3.17-3.30(m，2H，CH₂)，2.96-3.06(m，1H，CH_2c)，2.73-2.78(m，1H，CH_2d)，2.21-2.39(m，7H，CH₂×3&CH_2d)，2.00-2.08(m，1H，CH_2c)，1.35-1.46(m，4H，CH₂×2)，1.21-1.24(m，18H，CH₂×9)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，171.03，169.36，169.08，168.22，144.11，136.83，134.47，132.72，129.30，127.99，127.48，126.29，126.22，126.07，121.78，119.37，118.50，116.90，111.87，110.90，105.82，104.03，61.18，58.17，57.08，56.49，54.65，53.25，52.57，47.69，46.06，43.82，31.94，29.84，29.46，29.45，29.43，29.42，29.37，29.15，27.89，27.35，26.81，26.63，23.94，22.57.M.P.123-124℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated forC₅₂H₆₅C1N₇O₇(M+H)₊：934.4634；found 934.4650.

R18的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.96(s，1H，NH)，7.47-7.61(m，3H，Ar-H)，7.18-7.40(m，4H，Ar-H)，6.97-7.07(m，2H，Ar-H)，6.92(d，J＝4.88Hz，1H，Ar-H)，6.80(d，J＝5.28Hz，1H，Ar-H)，6.03(br，1H，CH)，5.42(s，1H，NH)，5.40(br，1H，CH)，5.16(dd，J＝8.92，3.36Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝9.36Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2b)，4.15(dd，J＝52.04，11.20Hz，2H，CH₂)，3.51-3.66(m，7H，CH₂×2&CH₃)，3.35-3.39(m，2H，CH₂)，3.21-3.30(m，2H，CH₂)，2.98-3.04(m，1H，CH_2c)，2.74-2.78(m，1H，CH_2d)，2.21-2.39(m，7H，CH₂×3&CH_2d)，2.02-2.07(m，1H，CH_2c)，1.36-1.44(m，4H，CH₂×2)，1.19-1.26(m，20H，CH₂×10)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.13，171.02，169.36，168.22，166.91，163.63，144.10，139.42，136.82，134.95，132.71，129.85，129.30，127.49，126.21，126.06，121.81，119.37，118.49，116.90，111.86，110.90，107.33，104.03，77.52，58.10，57.08，56.48，54.65，53.24，52.57，49.06，46.06，43.82，31.93，29.55，29.49，29.48，29.47，29.47，29.47，29.38，29.36，29.14，27.88，27.31，26.80，26.60，23.94，22.56；M.P.117-118℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₃H₆₇ClN₇O₇(M+H)₊：948.4791；found 948.4811.

实施例19GPX4蛋白降解剂R19的合成

(1)具有式C-3所示结构的化合物的合成；

a.中间体C11-2-1的合成

将叠氮基三甲基硅烷(0.92g，7.98mmol)用15mL dry DMF溶解，加入KF(0.47g，7.98mmol)，室温搅拌30min，然后加入C11-2(1.36g，2.66mmol)，60℃反应2h。反应结束后，用冷NaOH溶液淬灭反应，乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。减压浓缩得淡黄色液体C11-2-1(0.90g，89％)，不经分离进行下一步反应；

b.中间体C11-2-2的合成

将C11-2-1(0.90g，2.36mmol)用15mL甲醇溶解，加入5％Pd/C(180mg)，氢化反应2h。反应结束后，过滤除去钯碳，滤液浓缩得0.73g灰色固体，不经分离进行下一步反应；

c.中间体C11-5的合成

将F-SA(0.20g，0.72mmol)用5mL dry DMF溶解，依次加入C11-2-2(0.51g，1.44mmol)和DIPEA(0.19g，1.44mmol)，90℃反应过夜。反应结束后，用水淬灭反应，乙酸乙酯提取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得黄色固体C11-5(110mg，25％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.70(s，1H，NH)，7.48-7.52(m，1H，Ar-H)，7.10(d，J＝7.04Hz，1H，Ar-H)，6.89(d，J＝8.52Hz，1H，Ar-H)，6.24(t，J＝5.40Hz，NH)，4.91-4.95(m，1H，CH)，3.49(br，4H，CH₂×2)，3.27(q，J＝12.64，6.84Hz，2H，CH₂)，2.70-2.92(m，3H，CH_2-a×2&CH_2-b)，2.35-2.51(m，6H，CH₂×2&CH₂)，2.11-2.17(m，1H，CH_2-b)，1.63-1.71(m，2H，CH₂)，1.50-1.58(m，2H，CH₂)，1.47(s，9H，CH₃×3)，1.30-1.45(m，14H，CH₂×7)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.13，169.50，168.46，167.64，154.69，147.03，136.07，132.49，116.62，111.32，109.83，79.73，58.63，52.85，52.85，48.89，42.61，31.48，29.47，29.44，29.36，29.17，29.14，29.14，28.42，27.46，26.81，26.45，22.84.

d.中间体C11-6的合成

将C11-5(0.10g，0.16mmol)用10mL DCM溶解，加入1mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，减压除去溶剂得浅黄色液体混合物C11-6，不经分离进行下一步反应；

(2)R19的合成

由C11-6和RSL3-S4作原料，操作及处理同R13得黄色固体R19(68％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.11(s，1H，NH)，10.97(s，1H，NH)，7.57-7.59(m，2H，Ar-H)，7.49(d，J＝5.20Hz，2H，Ar-H)，7.24-7.41(m，3H，Ar-H)，7.09(d，J＝5.76Hz，1H，Ar-H)，7.02-7.07(m，2H，Ar-H)，6.96-6.99(m，1H，Ar-H)，6.52(t，J＝3.88Hz，1H，NH)，6.04(brs，1H，CH)，5.40(br，1H，CH)，5.06(dd，J＝8.56，3.64Hz，1H，CH)，4.74(d，J＝9.36Hz，1H，CH_2a)，4.43(d，J＝9.28Hz，1H，CH_2b)，3.52-3.59(m，6H，CH₂×3)，3.27-3.37(m，5H，CH₂&CH₃)，2.86-2.92(m，1H，CH_2c)，2.49-2.61(m，2H，CH_2d×2)，2.25-2.42(m，6H，CH₂×3)，2.01-2.05(m，1H，CH_2c)，1.54-1.59(m，2H，CH₂)，1.39(br，2H，CH₂)，1.24-1.35(m，14H，CH₂×7)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.26，172.15，170.54，169.41，169.10，168.22，167.76，146.89，136.82，136.73，134.46，132.65，128.03，127.50，127.30，126.29，126.22，121.78，119.37，118.50，117.64，111.87，110.84，109.46，104.04，58.12，57.09，56.48，54.64，53.25，49.00，43.83，43.45，42.29，40.53，31.45，29.43，29.41，29.20，29.12，27.33，26.76，26.63，23.94，22.63，21.97；M.P.135-136℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₀H₅₉ClN₇O₈(M+H)₊：920.4114；found920.4113.

实施例20～22GPX4蛋白降解剂R20～22的合成

实施例20～22与实施例19的区别在于，在制备具有式C-3所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R20的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.11(s，1H，NH)，10.98(s，1H，NH)，7.57-7.59(m，2H，Ar-H)，7.49(d，J＝5.16Hz，2H，Ar-H)，7.24-7.42(m，3H，Ar-H)，7.09(d，J＝5.76Hz，1H，Ar-H)，7.02-7.07(m，2H，Ar-H)，6.96-6.99(m，1H，Ar-H)，6.52(t，J＝3.84Hz，1H，NH)，6.04(br，1H，CH)，5.41(brs，1H，CH)，5.06(dd，J＝8.60，3.64Hz，1H，CH)，4.74(d，J＝9.36Hz，1H，CH_2a)，4.43(d，J＝9.28Hz，1H，CH_2b)，3.52-3.59(m，6H，CH₂×3)，3.27-3.38(m，5H，CH₂&CH₃)，2.86-2.92(m，1H，CH_2c)，2.49-2.61(m，2H，CH_2d×2)，2.11-2.44(m，6H，CH₂×3)，2.01-2.05(m，1H，CH_2c)，1.54-1.59(m，2H，CH₂)，1.40(br，2H，CH₂)，1.24-1.35(m，16H，CH₂×8)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.26，172.15，170.54，169.42，169.12，168.22，167.76，146.89，136.82，136.73，134.46，132.65，128.03，127.53，127.30，126.29，126.22，121.78，119.37，118.50，117.63，111.87，110.84，109.47，104.04，58.12，57.09，56.48，54.68，53.25，49.01，43.83，43.15，42.29，40.53，31.46，29.45，29.43，29.37，29.21，29.12，27.26，26.76，26.63，23.94，22.63，21.97；M.P.128-129℃；HRMS(ESI+)：m/z calculatedfor C₅₁H₆₁ClN₇O₈(M+H)₊：934.4270；found 934.4282.

R21的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.10(s，1H，NH)，10.96(s，1H，NH)，7.57-7.61(m，2H，Ar-H)，7.47-7.49(m，2H，Ar-H)，7.24-7.40(m，3H，Ar-H)，7.09(d，J＝5.72Hz，1H，Ar-H)，7.02-7.05(m，2H，Ar-H)，6.96-6.99(m，1H，Ar-H)，6.53(t，J＝3.88Hz，1H，NH)，6.03(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.06(dd，J＝8.60，3.68Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝9.36Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2b)，3.51-3.59(m，6H，CH₂×3)，3.33(s，3H，CH₃)，3.28(dd，J＝8.84，4.40Hz，2H，CH₂)，2.86-2.92(m，1H，CH_2c)，2.54-2.61(m，2H，CH_2d×2)，2.25-2.40(m，6H，CH₂×3)，2.01-2.05(m，1H，CH_2c)，1.54-1.59(m，2H，CH₂)，1.35-1.38(m，2H，CH₂)，1.23-1.29(m，18H，CH₂×9)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.26，172.15，170.54，169.41，168.22，167.76，167.43，146.89，136.83，136.72，132.65，132.18，132.03，129.15，127.48，126.29，126.22，121.77，119.37，118.49，117.63，111.86，110.83，109.47，104.03，58.14，57.08，56.49，54.66，53.25，49.00，43.83，43.12，42.29，40.53，31.45，30.27，29.47，29.44，29.20，29.12，28.84，27.68，27.33，26.76，23.71，22.87，22.63；M.P.84-85℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₂H₆₃ClN₇O₈(M+H)₊：948.4427；found 948.4449.

R22的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ11.10(s，1H，NH)，10.98(s，1H，NH)，7.56-7.58(m，2H，Ar-H)，7.48(d，J＝5.20Hz，2H，Ar-H)，7.24-7.40(m，3H，Ar-H)，7.08(d，J＝5.72Hz，1H，Ar-H)，7.01-7.06(m，2H，Ar-H)，6.96-6.98(m，1H，Ar-H)，6.52(t，J＝3.84Hz，1H，NH)，6.04(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.05(dd，J＝8.60，3.68Hz，1H，CH)，4.73(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2a)，4.42(d，J＝9.28Hz，1H，CH_2b)，3.49-3.59(m，6H，CH₂×3)，3.24-3.33(m，5H，CH₂&CH₃)，2.86-2.92(m，1H，CH_2c)，2.52-2.61(m，2H，CH_2d×2)，2.15-2.45(m，6H，CH₂×3)，2.00-2.04(m，1H，CH_2c)，1.53-1.58(m，2H，CH₂)，1.39(br，2H，CH₂)，1.22-1.34(m，20H，CH₂×10)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ173.26，172.15，170.53，169.41，169.10，168.22，167.76，146.88，136.82，136.72，134.46，132.64，128.01，127.50，127.29，126.28，126.21，121.81，119.37，118.48，117.62，111.86，110.83，109.46，104.02，58.07，57.09，56.48，54.66，53.24，49.00，43.82，43.14，42.29，40.51，31.45，29.48，29.47，29.44，29.38，29.27，29.20，29.12，27.28，26.76，26.47，23.93，22.63，21.59；M.P.116-117℃；HRMS(ESI+)：m/zcalculated for C₅₃H₆₅ClN₇O₈(M+H)₊：962.4583；found 962.4600.

实施例23GPX4蛋白降解剂R23的合成

(1)具有式C-2所示结构的化合物的合成；

a.中间体C7-7的合成

将V7(0.21g，0.47mmol)用10mL CH3CN溶解，然后依次加入C7-2(0.22g，0.47mmol)、K₂CO₃(78mg，0.56mmol)和KI(24mg，0.14mmol)，回流反应过夜。反应结束后，冷却至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得白色固体C7-7(140mg，41％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.68(s，1H，Ar-H)，7.88(d，J＝7.76Hz，1H，NH)，7.37-7.43(m，4H，Ar-H×4)，5.03-5.10(m，1H，CH)，4.86-4.89(m，1H，CH)，4.60-4.64(m，1H，CH)，3.61-3.68(m，2H，CH₂)，3.49(t，J＝4.20Hz，4H，CH₂×2)，3.12(s，1H，CH)，2.67-2.73(m，1H，CH_2-a)，2.34-2.56(m，11H，CH₃&CH₂×2&CH₂×2)，1.92-1.99(m，1H，CH_2-a)，1.27-1.55(m，22H，CH₃&CH₃×3&CH₂×5)，1.02(s，9H，CH₃×3)，；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ176.20，169.63，154.63，150.25，148.46，143.28，131.63，130.81，129.55，126.43，79.84，69.90，67.32，58.58，58.15，55.82，52.93，52.89，48.95，48.91，35.26，35.15，30.05，29.02，28.41，27.06，26.87，26.81，26.16，22.32，16.09.

b.中间体C7-8的合成

将C7-7(0.11g，0.15mmol)用10mL DCM溶解，加入1mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，减压除去溶剂得浅黄色液体混合物C7-8，不经分离进行下一步反应；

(2)R23的合成

由C7-8和RSL3-S4作原料，操作及处理同R13，得白色固体R23(50％)。

R23的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.97(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.40(d，J＝7.48Hz，1H，NH)，7.37-7.57(m，8H，Ar-H&NH)，7.24-7.33(m，3H，Ar-H)，6.95-7.07(m，2H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.03(s，1H，CH)，4.88-4.94(m，1H，CH)，4.73(d，J＝14.2Hz，1H，CH_2a)，4.52(t，J＝8.08Hz，1H，CH)，4.42(d，J＝13.60Hz，1H，CH_2b)，4.28(s，1H，CH)，3.21-3.60(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.20-2.42(m，8H，CH₂×4)，2.00-2.06(m，1H，CH)，1.76-1.83(m，1H，CH)，1.33-1.41(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.17-1.29(m，6H，CH₂×3)，0.92(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.19，171.21，169.08，168.21，163.33，151.93，148.21，145.21，144.34，136.83，134.68，134.47，131.57，130.14，129.42，129.29，127.47，126.78，126.21，121.79，119.37，118.49，111.87，104.02，69.21，67.31，66.61，66.07，65.48，58.79，58.15，57.10，56.64，56.47，53.25，48.15，43.80，37.94，35.33，29.29，27.34，27.23，27.05，26.58，23.95，22.97，22.62，16.46.M.P.177-178℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₆H₇₂ClN₈O₇S(M+H)₊：1035.4933；found 1035.4951.

实施例24～28GPX4蛋白降解剂R24～28的合成

实施例24～28与实施例23的区别在于，在制备具有式C-2所示结构的化合物时的起始原料n值的不同。

R24的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.98(s，1H，NH)，8.97(s，1H，Ar-H)，8.40(brs，1H，NH)，7.35-7.56(m，8H，Ar-H&NH)，7.20-7.31(m，3H，Ar-H)，6.94-7.05(m，2H，Ar-H)，6.02(brs，1H，CH)，5.39(brs，1H，CH)，5.04(s，1H，CH)，4.87-4.94(m，1H，CH)，4.72(d，J＝13.84Hz，1H，CH_2a)，4.52(t，J＝8.04Hz，1H，CH)，4.40(d，J＝13.92Hz，1H，CH_2b)，4.27(s，1H，CH)，3.17-3.57(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.44(s，3H，CH₃)，2.20-2.40(m，8H，CH₂×4)，2.01-2.05(m，1H，CH)，1.75-1.82(m，1H，CH)，1.34-1.40(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.20-1.27(m，10H，CH₂×5)，0.92(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ171.76，170.75，168.69，167.82，163.22，151.53，147.81，144.79，143.98，136.43，134.24，134.08，131.65，131.18，129.75，128.90，127.08，126.40，125.82，121.36，118.96，118.09，111.47，103.62，68.82，67.47，66.91，66.16，65.66，58.40，57.75，56.69，56.31，56.08，52.85，47.77，43.44，38.16，34.93，29.87，28.99，28.44，26.95，26.80，26.61，26.22，23.32，22.58，22.25，16.07.M.P.118-119℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₅₈H₇₆ClN₈O₇S(M+H)₊：1063.5246；found 1063.5265.

R25的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.97(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.41(brs，1H，NH)，7.38-7.49(m，8H，Ar-H&NH)，7.24-7.32(m，3H，Ar-H)，6.96-7.05(m，2H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.05(s，1H，CH)，4.90-4.93(m，1H，CH)，4.73(d，J＝9.36Hz，1H，CH_2a)，4.53(t，J＝5.32Hz，1H，CH)，4.42(d，J＝9.24Hz，1H，CH_2b)，4.29(s，1H，CH)，3.24-3.59(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.26-2.40(m，8H，CH₂×4)，2.02-2.07(m，1H，CH)，1.78-1.83(m，1H，CH)，1.38-1.42(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.23-1.25(m，14H，CH₂×7)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.15，171.16，169.09，168.22，162.45，151.94，148.21，145.17，144.35，136.82，134.65，134.47，131.57，130.15，129.43，129.30，127.48，126.79，126.21，121.78，119.37，118.50，111.87，104.03，69.22，67.30，66.57，66.07，61.73，58.80，58.14，57.09，56.70，56.49，53.25，48.16，43.83，37.97，35.32，30.27，29.56，29.45，29.34，29.05，27.36，27.22，27.00，26.61，23.94，22.97，22.64，16.46；M.P.94-95℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated for C₆₀H₈₀ClN₈O₇S(M+H)₊：1091.5559；found 1091.5547.

R26的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.99(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.43(brs，1H，NH)，7.38-7.49(m，8H，Ar-H&NH)，7.24-7.34(m，3H，Ar-H)，6.96-7.07(m，2H，Ar-H)，6.04(brs，1H，CH)，5.41(brs，1H，CH)，5.07(s，1H，CH)，4.90-4.95(m，1H，CH)，4.74(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2a)，4.54(t，J＝4.80Hz，1H，CH)，4.43(d，J＝9.24Hz，1H，CH_2b)，4.30(s，1H，CH)，3.22-3.59(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.47(s，3H，CH₃)，2.21-2.42(m，8H，CH₂×4)，2.03-2.09(m，1H，CH)，1.79-1.83(m，1H，CH)，1.38-1.43(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.22-1.26(m，16H，CH₂×8)，0.95(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.15，171.12，169.09，168.22，162.45，151.94，148.21，145.17，144.37，136.83，134.63，134.47，131.57，130.16，129.43，129.30，127.48，126.79，126.22，121.77，119.37，118.49，111.87，104.02，69.22，67.30，66.50，66.06，61.73，58.89，58.12，57.09，56.75，56.48，53.25，48.17，43.83，37.99，35.32，30.27，29.58，29.51，29.47，29.44，29.34，27.35，27.17，26.99，26.57，23.94，22.97，22.65，16.46；M.P.105-106℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated forC₆₁H₈₂ClN₈O₇S(M+H)₊：1105.5716；found 1105.5710.

R27的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.96(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.40(brs，1H，NH)，7.37-7.51(m，8H，Ar-H&NH)，7.24-7.28(m，3H，Ar-H)，6.97-7.05(m，2H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.03(s，1H，CH)，4.90-4.95(m，1H，CH)，4.73(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2a)，4.54(t，J＝5.32Hz，1H，CH)，4.42(d，J＝9.24Hz，1H，CH_2b)，4.29(s，1H，CH)，3.19-3.59(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.47(s，3H，CH₃)，2.25-2.42(m，8H，CH₂×4)，2.03(br，1H，CH)，1.79-1.83(m，1H，CH)，1.35-1.41(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.22-1.26(m，18H，CH₂×9)，0.93(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.15，171.19，169.08，168.22，164.93，151.94，148.22，145.20，144.35，136.83，134.67，134.47，131.57，130.15，129.30，128.51，127.48，126.79，126.22，121.78，119.37，118.50，111.87，104.03，69.22，67.30，66.60，66.07，61.18，58.80，58.16，57.09，56.66，56.49，53.25，48.16，43.83，37.96，35.33，30.39，29.58，29.51，29.49，29.44，29.35，29.17，27.36，27.24，27.00，26.62，23.94，22.98，22.63，16.46；M.P.101-102℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated forC₆₂H₈₄ClN₈O₇S(M+H)₊：1119.5872；found 1119.5884.

R28的谱图数据：¹H NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ10.99(s，1H，NH)，8.99(s，1H，Ar-H)，8.42(brs，1H，NH)，7.37-7.50(m，8H，Ar-H&NH)，7.23-7.33(m，3H，Ar-H)，6.96-7.06(m，2H，Ar-H)，6.03(brs，1H，CH)，5.40(brs，1H，CH)，5.07(s，1H，CH)，4.91-4.93(m，1H，CH)，4.73(d，J＝9.40Hz，1H，CH_2a)，4.54(t，J＝5.08Hz，1H，CH)，4.42(d，J＝9.32Hz，1H，CH_2b)，4.29(brs，1H，CH)，3.43-3.56(m，11H，CH₂×4&CH₃)，2.46(s，3H，CH₃)，2.24-2.39(m，8H，CH₂×4)，2.05(br，1H，CH)，1.78-1.82(m，1H，CH)，1.38-1.41(m，7H，CH₂×2&CH₃)，1.23-1.25(m，20H，CH₂×10)，0.94(s，9H，CH₃×3)；¹³CNMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ172.15，171.03，169.09，168.21，164.94，151.94，148.21，145.16，144.36，136.81，134.61，134.47，131.56，130.16，129.42，129.30，127.48，126.79，126.21，121.76，119.36，118.49，111.86，104.02，69.21，67.29，66.45，66.05，60.45，58.80，58.09，57.09，56.72，56.47，53.24，48.16，42.28，37.99，35.31，30.26，29.53，29.49，29.42，29.31，29.16，29.12，28.81，27.33，27.14，26.98，26.54，23.94，22.96，22.64，16.46；M.P.94-95℃；HRMS(ESI+)：m/z calculated forC₆₃H₈₆ClN₈O₇S(M+H)₊：1133.6029；found 1133.6030.

实施例29GPX4蛋白降解剂R29的合成

a.中间体C9-9的合成

将C9-8(0.72g，1.09mmol)用10mL CH3CN溶解，然后依次加入1-Boc-4-溴哌啶(0.32g，1.20mmol)、K₂CO₃(0.25g，1.79mmol)和KI(55mg，0.33mmol)，回流反应2h。反应结束后，冷却至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得白色固体C9-9。

b.中间体C9-10的合成

将C9-9(0.27g，0.37mmol)用10mL DCM溶解，加入1mL TFA，室温搅拌30min。反应结束后，减压除去溶剂得浅黄色液体混合物C9-10，不经分离进行下一步反应。

c.GPX4降解剂R29的合成

将RSL3-S4(86mg，0.18mmol)用8mL DMF溶解，然后依次加入C9-10(80mg，0.18mmol)、HATU(96mg，0.25mmol)和DIPEA(140mg，1.08mmol)，室温搅拌2h。反应结束后，用水和乙酸乙酯萃取反应液三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝50/1)得白色固体R29。

实施例30GPX4蛋白降解剂R30的合成

a.中间体RSL3-B1的合成

将D-色氨酸甲酯盐酸盐(2.57g，11.75mmol)溶于15mL DCM中，加入TEA(1.32g，13.08mmol)，室温搅拌1小时。过滤滤液旋干干燥，用30mL DCM溶解，依次加入对甲基苯甲醛(1.28g，10.68mmol)、TFA(61mg，0.53mmol)和

分子筛，回流反应1小时后再次加入TFA(1.83g，16.02mmol)，然后回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，用30％NaOH溶液淬灭，有机相分离，依次用饱和NaCl溶液洗涤三次和无水Na₂SO₄干燥。柱分离(D/M＝80/1)得白色固体，得到所示化合物，记为RSL3-B1。

b.中间体RSL3-B2的合成

将RSL3-B1(1.00g，3.12mmol)用20mL CCl4中，然后加入NBS(0.36g，6.24mmol)，回流反应2小时。反应结束后冷却至室温，加入15mL水淬灭，有机相分离，依次用饱和NaCl溶液洗涤三次和无水Na2SO4干燥。柱分离(D/M＝80/1)得白色固体，得到所示化合物，记为RSL3-B2。

c.中间体RSL3-B3的合成

将RSL3-B2(0.32g，0.80mmol)用8mL dry DCM溶解，加入NaHCO₃(74mg，0.88mmol)，然后在冰浴下分批加入氯乙酰氯(0.11g，0.96mmol)，室温反应7h。反应结束后，用水淬灭反应液，乙酸乙酯提取三次，有机相用饱和NaCl溶液洗涤，并用无水Na₂8O₄干燥。减压除去部分溶剂析出大量白色固体，过滤，滤饼用少量乙醚洗涤，干燥得白色固体RSL3-B3。

d.GPX4降解剂R30的合成

将C13-8(80mg，0.18mmol)用5mL CH3CN溶解，然后依次加入RSL3-B3(86g，0.18mmol)、K₂CO₃(25mg，0.18mmo1)和KI(5.5mg，0.033mmol)，回流反应2h。反应结束后，冷却至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaCl溶液洗涤和无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(D/M＝60/1)得白色固体R30。

性能测试1降解剂诱导肿瘤细胞GPX4蛋白降解

通过Western Blot试验，本发明对设计合成的降解剂分子的肿瘤细胞GPX4蛋白降解能力进行了检测。首先检测了以聚乙二醇类(PEG)结构作为连接基的降解剂R1～R12。结果如图1所示，图1中，a为10μM时R1-R8的GPX4降解结果；b为10μM R9-R12处理HT1080细胞24h后的细胞状态；c为1μM时R1-R8的GPX4降解结果；d为1μM时R9-R12的GPX4降解结果。图1显示，HT1080细胞在6孔板中培养，加入10μM和1μM不同降解剂，作用24小时后的GPX4蛋白水平。其中R5和R10对GPX4蛋白降解作用最为明显。图1中b显示HT1080细胞中加入10μM不同降解剂作用24h后，细胞明显死亡，证明了降解剂具有明显抗肿瘤作用。

本发明对合成的碳链类的GPX4降解剂R13～R28进行Western Blot试验。HT1080细胞中，给药浓度为0.1μM，不同降解剂分别给药24小时后的Western Blot结果显示GPX4蛋白均出现了明显降解，如图2所示，图2中，a～f为不同降解剂在HT1080细胞中的GPX4降解结果；g为降解剂R25～R28在MCF7细胞中的GPX4降解结果。可以看出，降解剂能够有效地在HT1080细胞中降解GPX4蛋白，图2g)和图3d)显示R16和R25-R28能够有效地在MCF-7细胞中降解GPX4蛋白。

本发明检测了将不同浓度(10μM开始稀释)R27加入HT1080和Calu-1细胞中作用后R27对GPX4的降解情况，检测了降解剂在HT1080、Calu-1和MCF7细胞中作用不同给药时间(0.5-24h)对GPX4蛋白的降解情况，如图3所示，图3中a)为降解剂R27对HT1080细胞中GPX4蛋白的浓度梯度降解试验；b)为降解剂R27对Calu-1细胞中GPX4蛋白的浓度梯度降解试验；c)为R16在不同时间点对HT1080细胞中GPX4的降解；d)为R16在不同时间点对MCF7细胞中GPX4的降解；e)为R27在不同时间点对HT1080细胞中GPX4的降解；f)为R27在不同时间点对Calu-1细胞中GPX4的降解。图3a)和3b)结果显示R27对在HT1080细胞和Calu-1细胞中对GPX4蛋白降解具有浓度依赖的特点，DC50为23.26nM和136nM。同时，图2中e)显示，R16在HT1080细胞中作用24小时后也显示出浓度依赖性的GPX4降解效果。图3中c)、d)、e)、f)结果显示降解剂在HT1080、Calu-1和MCF7细胞中的GPX4降解作用具有时间依赖性。以上结果证明降解剂在HT1080、Calu-1和MCF7细胞中具有明显GPX4蛋白降解效果。

性能测试2降解剂R27通过泛素-蛋白酶体通路降解GPX4蛋白

本发明使用GPX4抑制剂ML210、蛋白酶体抑制剂MG132和泛素激活酶E1抑制剂PYR41分别预先孵育细胞2小时然后再用R27处理最后通过WB检测GPX4蛋白条带的变化结果如图4所示，图4中a)为抑制剂ML210对R27降解GPX4的竞争试验；b)为R27诱导GPX4蛋白降解机制验证试验。由图4中a)中可以看出，随着ML210预处理浓度的增加，R27对GPX4蛋白的降解逐渐被竞争抑制。从图4中b)上可以看出，R27对GPX4蛋白的降解作用可以被MG132和PYR41明显阻断，说明R27诱导GPX4蛋白的降解是通过泛素-蛋白酶体通路实现的。

性能测试3肿瘤细胞增殖抑制实验

肿瘤细胞增殖实验结果图图5所示，图5中a)为R27对HEK293T细胞的毒性试验；b)为R27对HT1080细胞的增殖抑制试验，c)为R27对Calu-1细胞的增殖抑制试验；d)为降解剂R13～R17对HT1080细胞的增殖抑制试验；e)为降解剂R21、R23-R26、R28对HT1080细胞的增殖抑制试验。

(1)降解剂对HEK293T细胞的毒性实验

本发明通过MTT方法，选择了人胚肾细胞(HEK293T)检测了降解剂对正常细胞在24小时之内的细胞增殖抑制作用，同时使用了GPX4共价抑制剂RSL3和ML210作为阳性对照。降解剂R27与抑制剂表现出相似的细胞毒性，结果如图5中a)所示。

(2)降解剂对肿瘤细胞增殖抑制作用

本发明检测了降解剂对人纤维肉瘤细胞(HT1080)和人肺癌细胞(Calu-1)24小时内的细胞增殖抑制作用，并使用GPX4抑制剂RSL3和ML210作为对照。以R27为例，由图5中b)、c)看出，R27对两种细胞系的细胞增殖抑制作用明显优于RSL3和ML210，其中在HT1080细胞中的IC50为58nM，在Calu-1细胞中的IC50为25nM。由图5中d)、e)和图1中b可以看出，其他降解剂也表现出明显的抗肿瘤作用。

性能测试4

(1)Liproxstatin-1阻断R27诱导的肿瘤细胞铁死亡

为了验证降解剂是通过铁丝亡途径起到抗肿瘤增殖作用的，本发明使用不同浓度(浓度分别为0、0.006859、0.020576、0.061782、0.185185、0.555556、1.666667、5μM)铁死亡抑制剂Liproxstin-1预先孵育HT1080细胞2小时，然后加入降解剂R27(R27终浓度0.1μM)，最后检测24小时后的细胞活力，结果如图6所示，图6中a为铁死亡抑制剂Liproxstatin-1抑制R27诱导的HT1080细胞铁死亡；b为R27诱导HT1080细胞内ROS生成试验。

由图6中a可以看出，相对于只加降解剂R27的处理组(左起第二组)，加入铁死亡抑制剂Lip-1的处理组能够明显抑制细胞的死亡，并且在一定范围内随着Lip-1浓度的增加细胞存活率增加，这表明R27对HT1080细胞的抑制是通过铁死亡途径发生的。

(2)R27诱导HT1080细胞中的ROS产生

R27通过降解GPX4蛋白从而严重削弱肿瘤细胞清除脂质氢过氧化物的能力，最终导致铁死亡的发生。因此我们使用C11-BODIPY^581/591探针对降解剂R27不同时间点给药后肿瘤细胞ROS的生成水平进行了监测，结果如图6中b所示。

从图6中b可以看出，降解剂R27(0.1AM)给药2小时后检测到荧光强度急剧增加，即表明此时ROS大量生成，也间接表明给药2小时前GPX4蛋白已经开始被R27结合并降解，在3至4小时左右时间细胞ROS生成量达到最高值，4小时之后细胞ROS含量逐渐下降，说明此时细胞已经开始大量死亡；相对于降解剂，抑制剂RSL3(0.1μM)诱导HT1080细胞ROS生成的趋势比较缓和，而且ROS生成量显著低于降解剂处理组；此外，我们同时进行了另一组对照试验，即在R27每个给药的时间点前，预先使用20nM的铁死亡抑制剂Lip-1孵育细胞2小时，从而用来验证Lip-1对R27诱导细胞ROS生成的阻断作用。结果显示，与R27处理组相比，R27+Lip-1处理组ROS生成量明显减少(2-6h尤为显著)，从而进一步证明了R27诱导的肿瘤细胞ROS生成和铁死亡可以被铁死亡抑制剂Lip-1所阻断，即GPX4降解剂R27可以诱导肿瘤细胞铁死亡。

性能测试5降解剂诱导耐药肿瘤细胞中GPX4蛋白降解并抑制耐药肿瘤细胞增殖

本发明构建了对吉非替尼耐药的人非小细胞肺癌细胞(H1650)株，以用来研究GPX4降解剂R17和R27对耐药肿瘤细胞中GPX4蛋白的降解作用。使用不同浓度(浓度分别为0.3、0.1、0.03、0.01μM)的R17和R27分别处理野生型(H1650)和耐药型(H1650R)人非小细胞肺癌细胞24小时，然后通过Western blot试验检测相应实验组细胞的GPX4蛋白水平。

R17和R27在野生型和耐药型H1650细胞中的蛋白降解如图7所示，图7中a为不同浓度R17诱导H1650细胞中GPX4降解；b为不同浓度R17诱导H1650R细胞中GPX4降解；c为不同浓度R27诱导H1650细胞中GPX4降解；d为不同浓度R27诱导H1650R细胞中GPX4降解；e为抑制剂RSL3和降解剂R27分别对野生型和耐药型H1650细胞的增殖抑制。可以看出，给药24小时后，R27能够明显诱导野生型和耐药型H1650细胞中的GPX4降解，且呈浓度依赖的特点。其中在H1650细胞中，R27浓度在0.01μM时就可几乎完全降解GPX4；而对于H1650R细胞，R27浓度为0.03μM时能够显著降解GPX4；R17在0.01μM时能够降解H1650细胞中大部分的GPX4蛋白，同时也能浓度依赖性降解H1650R细胞中的GPX4蛋白；相对于RSL3，降解剂R27能够更好地抑制野生型和耐药型H1650细胞的增殖，同时对耐药型H1650R细胞的抑制作用要优于野生型H1650细胞。实验结果表明，GPX4降解剂可以同时降解野生型和耐药型肿瘤细胞中的GPX4蛋白，同时也说明了通过GPX4降解剂降解GPX4蛋白能够很好地诱导耐药型肿瘤细胞铁死亡。

性能测试6GPX4降解剂对异种移植肿瘤小鼠的药效学研究

本发明构建了异种移植人纤维肉瘤(HT1080)的小鼠模型，用来评价GPX4降解剂的体内药效学作用。

(1)R27对肿瘤组织GPX4蛋白的降解作用

参照GPX4抑制剂RSL3的给药模式，对R27(100mg/kg)进行瘤周皮下给药，在指定的时间点获取肿瘤组织，并提取蛋白进行Western blot试验，所得结果如图8所示。R27给药3小时后肿瘤组织中GPX4蛋白出现降解现象，且12小时内呈现时间依赖的特点，而在之后的24h和48h时间点的条带颜色有加深迹象，这表明在12小时后降解剂可能已经消耗完全，而GPX4蛋白通过生物再合成含量增加。上述结果表明，降解剂R27在体内实验中仍然具有明显的GPX4蛋白降解效果。

(2)R27对小鼠肿瘤体积的影响

我们使用降解剂R27(50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg三个浓度)、抑制剂RSL3(100mg/kg)以及空白溶剂对照分别对小鼠瘤周皮下给药，每四天给药一次，并测量肿瘤尺寸和小鼠体重，从而比较不同种类药物多次给药后对小鼠肿瘤体积和体重的影响。所得结果如图9所示。图9中a为小鼠肿瘤体积的变化趋势，b为小鼠体重的变化趋势。

从图9中可以看出，持续给药四次后，各组小鼠的体重有所下降，同时肿瘤体积都呈现增长的趋势，其中对照组与50mg/kg R27处理组增长趋势最为显著，100mg/kg R27和100mg/kg RSL3处理组增长趋势较为平缓且几乎一致，200mg/kg R27给药组在给药12天后对肿瘤体积的增长抑制进一步增强。由于R27的分子量(M.W.＝1119.91)是RSL3分子量(M.W.＝440.88)的2.5倍左右，因此这些数据间接表明在相同摩尔量给药的情况下，降解剂R27的肿瘤抑制效果是抑制剂RSL3的2.5倍左右。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。