CN111870613A - 一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用 - Google Patents

一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用 Download PDF

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Abstract

一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，本发明属于中药提取物用途领域，具体提供了桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，特别是桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。本发明首次揭示了桃叶珊瑚苷或其苷元对铁死亡的抑制作用和分子机制，丰富了桃叶珊瑚苷或其苷元的药理作用基础，并为铁死亡相关疾病的预防或治疗提供了新途径。

Description

一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用
技术领域
本发明属于中药提取物用途领域，具体涉及桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，更具体地涉及桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
背景技术
铁死亡(Ferroptosis)是由哥伦比亚大学知名学者Stockwell教授在2012年发现的一种全新的铁依赖性细胞死亡方式，完全不同于细胞凋亡、坏死、自噬、有丝分裂灾难等细胞死亡方式。在分子机制上，铁死亡的本质是细胞内脂质过氧化物的代谢障碍，即由于谷胱甘肽(GSH)耗竭，膜脂修复酶谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)活性下降，脂质过氧化物不能通过GPX4催化的GSH还原反应代谢，进而在铁离子的催化下异常代谢，造成脂质过氧化物积累，触发细胞死亡。在形态学上，Ferroptosis的典型特征为线粒体变小，双侧膜密度增加，同时表现为细胞质以及脂质活性氧自由基增多。
作为近些年新发现的细胞死亡方式，铁死亡已被证实参与多种疾病的发生发展，包括脑卒中；神经退行性疾病如阿茨海默病，帕金森病和亨廷顿舞蹈病；脏器纤维化如肝纤维化、肾间质纤维、肺纤维化；缺血再灌注损伤；肾衰竭；心肌病和心肌梗死；药物心脏和肝脏毒性。通过抑制铁死亡，可有效延缓病情进展和改善临床症状。目前，已报道的铁死亡抑制剂有铁螯合剂DFO、Ferrostatin-1(Fer-1)、Liproxstatin-1等，尚未有铁死亡抑制剂进入临床研究。
中药是中华传统文化的瑰宝，为疾病治疗提供了丰富的资源。厚朴酚是从我国传统中药厚朴中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗衰老等广泛的药理作用。专利CN 110747250 A公开了一种厚朴酚在制备抑制Erastin和RSL3诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用，该发明研究了不同浓度厚朴酚对Erastin和RSL3诱导铁死亡的作用及分子机制，挖掘了厚朴酚的药理功能，拓宽了对厚朴酚的认知。黄芩素是中药黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一，具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床用于脑血管病后瘫痪的治疗。近期研究表明，黄芩素可作为一种新型铁死亡抑制剂，且效果显著优于典型铁死亡抑制剂Fer-1和DFO(Biochem Biophys ResCommun.2016,473:775-780)。因此，中药及中药提取物为铁死亡抑制剂研发提供了新思路和资源宝库。
桃叶珊瑚苷(Aucubin，AU)，化学名为β-D-吡喃葡萄糖苷，为环烯醚萜苷类化合物，植物的次生代谢产物，为传统中药杜仲、车前草、地黄的主要活性成分，具有保肝护肝、抗炎、抗氧化、镇痛、降压、抗肿瘤、营养神经等众多药理活性。AU经β-葡萄糖苷酶催化水解生成桃叶珊瑚苷苷元(Aucubigenin，AG)，AG内吡喃环可打开，AG的开链结构是AU发挥药理作用的结构基础。研究表明，AU和AG有丰富的抗氧化活性，能清除活性氧自由基，提高过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，抑制过氧化产物丙二醛(MDA)的生成(Eur J Pharmacol,2008；582:162-167.Phytother Res,2012；26:369-374.)。然而，是否可以抑制铁死亡及其分子机制目前尚不清楚。因此，研究桃叶珊瑚苷或其苷元抑制铁死亡的分子机制并将其用于预防或治疗铁死亡相关疾病是本领域研究人员亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，首次揭示了桃叶珊瑚苷或其苷元对铁死亡的分子机制，丰富了桃叶珊瑚苷或其苷元的药理作用基础。本发明的另一目的在于提供一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下实验方案：
一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用。
优选地，所述的桃叶珊瑚苷或其苷元为具有或含有如下结构式的化合物：
Figure BDA0002689789070000021
优选地，包含上述结构式的化合物选自6-O取代桃叶珊瑚苷衍生物，10-O取代桃叶珊瑚苷衍生物，6,10-O双取代桃叶珊瑚苷衍生物和6’-O取代桃叶珊瑚苷衍生物。
优选地，所述药物是含有预防或治疗有效量的桃叶珊瑚苷或其苷元以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。
优选地，所述药物的给药途径包括口服给药，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，鼻腔给药，腹腔注射，舌下给药或经皮给药
优选地，桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述铁死亡相关疾病选自脑卒中，脑外伤，脏器纤维化，缺血再灌注损伤，神经退行性疾病，肝肾衰竭，心脏病，药物心脏和肝脏毒性。
本发明的优点和积极效果：本发明公开提供了一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的新应用，特别是桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的新应用。本发明首次揭示了桃叶珊瑚苷或其苷元对铁死亡的抑制作用和分子机制，丰富了桃叶珊瑚苷或其苷元的药理作用基础，并为铁死亡相关疾病的预防或治疗提供了新途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明桃叶珊瑚苷或其苷元抑制铁死亡作用机制图；
图2为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对HK-2细胞活性的影响；
图3为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞铁死亡的影响；
图4为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞铁死亡的影响；
图5为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中铁含量的影响；
图6为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导的HK-2细胞中铁含量的影响；
图7为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响；
图8为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导的HK-2细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响；
图9为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX-4)的影响；
图10为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导的HK-2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX-4)的影响；
图11为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中活性氧类(ROS)含量的影响；
图12为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导的HK-2细胞中活性氧类(ROS)含量的影响；
图13为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞中脂质过氧化物(LPO)含量的影响；
图14为本发明不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中脂质过氧化物(LPO)含量的影响；
图15为本发明桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾衰竭模型的血清肌酐(Scr)含量的影响；
图16为本发明桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾衰竭模型的尿素氮(BUN)含量的影响；
图17为本发明桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾衰竭模型的H&E病理特征的影响；
图18为本发明桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾衰竭模型肾小管损伤评分的影响；
图19桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾衰竭模型的GPX-4含量的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
以下实施方式旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。在背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
由图1至图19给出，本发明所使用的主要材料包括：
桃叶珊瑚苷(AU)，桃叶珊瑚苷元(AG)，Erastin，Ferrostatin-1，RSL-3，阿霉素，GPX-4抗体，Actin抗体，细胞铁含量试剂盒，还原型谷胱甘肽检测试剂盒(DTNB速率比色法)，活性氧检测试剂盒，脂质过氧化物(LPO)试剂盒，大鼠SCR ELISA检测试剂盒，大鼠BUNELISA检测试剂盒，DCFH-DA探针和C11-BODIPY(581/591)探针。
HK-2细胞购自ATCC，用DMEM-F12完全培养基(10％胎牛血清、1％双抗、4μg·mL-1地塞米松、5μg·mL-1人胰岛素、10ng·mL-1EGF)，37℃，100％湿度，5％CO2培养箱孵育，取对数生长期的细胞进行实验。
实施例1：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对HK-2细胞活性的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。细胞贴壁后，弃掉旧培基，加入新配不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元(0、0.1、1、10、100μM)的DMEM-F12培养基，200μL每孔，培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加不含桃叶珊瑚苷的DMEM-F12培养基(100μL/孔)和CCK-8试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；450nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性。
如图1所示，在实验范围内，随着桃叶珊瑚苷或其苷元浓度的增加，HK-2细胞活性无明显毒害作用。
实施例2：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞铁死亡的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和CCK-8试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；450nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性。
如图2所示，随着桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞活性明显升高，且在浓度为100uM时，桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞铁死亡抑制作用与铁死亡抑制剂Fer-1相当。这说明，桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞铁死亡具有明显抑制作用。
实施例3：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞铁死亡的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和CCK-8试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；450nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性。
如图3所示，随着桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞活性明显升高，且在浓度为100uM时，桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞铁死亡抑制作用与铁死亡抑制剂Fer-1相当。这说明，桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞铁死亡具有显著抑制作用。
实施例4：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导HK-2细胞中铁含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和铁含量测定试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；593nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞中铁含量。
如图4所示，各组中细胞铁含量无明显变化。
实施例5：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中铁含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和铁含量测定试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；593nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞中铁含量。
如图5所示，各组中细胞铁含量无明显变化。
实施例6：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和GSH含量测定试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；412nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性。
如图6所示，随着桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中GSH水平明显升高，且在浓度为100uM时，桃叶珊瑚苷或其苷元可以有效抑制Erastin诱导的HK-2细胞中GSH水平下降，其作用与铁死亡抑制剂Fer-1相当。这说明，在Erastin诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制GSH水平的下降，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例7：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和GSH含量测定试剂(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；412nm波长下用酶标仪检测各孔的OD值，计算细胞活性。
如图7所示，由于RSL-3仅抑制GPX-4活性，不影响GSH水平，与对照组相比，RSL-3诱导组和Fer-1组中GSH水平变化不大；随着桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，实验组中HK-2细胞中GSH水平略有升高。这说明，桃叶珊瑚苷或其苷元可提高细胞中还原型GSH水平，具有抗氧化作用。
实施例8：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX-4)的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，收集细胞，裂解液裂解，加入蛋白提取试剂，western-blot分析各组中GPX-4含量变化。
如图8所示，与对照组相比，Erastin诱导后HK-2细胞中GPX-4含量显著下降；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中GPX-4含量显著升高，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在Erastin诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制GPX-4含量的下降，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例9：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX-4)的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，收集细胞，裂解液裂解，加入蛋白提取试剂，western-blot分析各组中GPX-4含量变化。
如图9所示，由于RSL-3抑制GPX-4活性，与对照组相比，RSL-3诱导后HK-2细胞中GPX-4含量显著下降；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中GPX-4含量显著升高，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在RSL-3诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制GPX-4含量的下降，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例10：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中活性氧类(ROS)含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和DCFH-DA探针(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；共聚焦显微镜成像。
如图10所示，与对照组相比，Erastin诱导后HK-2细胞中ROS含量显著升高；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中ROS含量逐渐降低，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在Erastin诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制ROS产生，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例11：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中活性氧类(ROS)含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和DCFH-DA探针(10μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；流式细胞仪分析各组探针荧光量。
如图11所示，与对照组相比，RSL-3诱导后HK-2细胞中ROS含量显著升高；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中ROS含量逐渐降低，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在RSL-3诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制ROS产生，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例12：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对Erastin诱导的HK-2细胞中脂质过氧化物(LPO)含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
Erastin：5μM Erastin
Fer-1：5μM Erastin+0.5μM Fer-1
AU-L：5μM Erastin+1μM AU(低剂量)
AU-M：5μM Erastin+10μM AU(中剂量)
AU-H：5μM Erastin+100μM AU(高剂量)
AG-L：5μM Erastin+1μM AG(低剂量)
AG-M：5μM Erastin+10μM AG(中剂量)
AG-H：5μM Erastin+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和C11-BODIPY探针(20μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；共聚焦显微镜成像(Ex/Em＝581/591nm)。
如图12所示，与对照组相比，Erastin诱导后HK-2细胞中LPO含量显著升高；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中LPO含量逐渐降低，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在Erastin诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制LPO产生，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例13：不同浓度桃叶珊瑚苷或其苷元对RSL-3诱导HK-2细胞中脂质过氧化物(LPO)含量的影响
按9000个每孔将HK-2细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。四周用PBS缓冲液(200μL每孔)填满，预防周边效应。37℃、5％CO2培养箱中孵育。实验分为以下组：
Control：PBS，空白对照组
RSL-3：2μM RSL-3
Fer-1：5μM RSL-3+0.5μM Fer-1
AU-L：2μM RSL-3+1μM AU(低剂量)
AU-M：2μM RSL-3+10μM AU(中剂量)
AU-H：2μM RSL-3+100μM AU(高剂量)
AG-L：2μM RSL-3+1μM AG(低剂量)
AG-M：2μM RSL-3+10μM AG(中剂量)
AG-H：2μM RSL-3+100μM AG(高剂量)
加入上述药物后培养箱中继续孵育48h。48h后弃掉旧培基，加入DMEM-F12培养基(100μL/孔)和C11-BODIPY探针(20μL/孔)，培养箱中孵育0.5h；流式细胞仪分析各组探针荧光量。
如图13所示，与对照组相比，RSL-3诱导后HK-2细胞中LPO含量显著升高；随着加入的桃叶珊瑚苷或其苷元浓度升高，HK-2细胞中LPO含量逐渐降低，且与铁死亡抑制剂Fer-1的作用相当。这说明，在RSL-3诱导的HK-2细胞中，桃叶珊瑚苷或其苷元可有效抑制LPO产生，从而发挥抑制铁死亡的作用。
实施例14：桃叶珊瑚苷或其苷元对肾功能衰竭模型发生铁死亡的抑制实验
阿霉素(ADR)是一种含醌式结构的抗肿瘤药物，在体内药物代谢酶作用下，形成半醌自由基，半醌自由基发生氧化反应生成羟基自由基和超氧阴离子，二者均可氧化脂质膜，形成膜脂质过氧化物，诱导肾小管上皮细胞等发生铁死亡。周龄为6-7周的SD大鼠随机分为以下5组，每组6只。
Control：PBS，空白对照组
ADR：6mg/kg尾静脉注射一次+生理盐水灌胃一天一次
Fer-1：6mg/kg ADR尾静脉注射一次+10mg/kg Fer-1腹腔注射一天一次
AU-100：6mg/kg ADR尾静脉注射+100mg/kg AG灌胃一天一次
AG-100：6mg/kg ADR尾静脉注射+100mg/kg AG灌胃一天一次
连续处理2周，取血测定血肌酐(Scr)和尿素氮(Bun)含量；取肾脏组织，H&E染色，观察肾脏病理结构变化，并进行肾小管损伤评分；western blot检测GPX-4含量变化。
如图14和15所示，与对照组相比，阿霉素诱导的肾衰竭实验组血肌酐(Scr)和尿素氮(Bun)含量显著升高；给予桃叶珊瑚苷或其苷元灌胃治疗2周后，血肌酐和尿素氮显著降低，其抑制效果与铁死亡抑制剂Fer-1相当；如图16所示，H&E病理结果显示，阿霉素诱导后肾脏发生形态学改变，包括肾小管上皮细胞变性，刷状边缘丢失和扩张，伴淋巴及单核细胞浸润,肾小管萎缩或消失,肾小球出现缺血性皱缩。给予桃叶珊瑚苷或其苷元以及铁死亡抑制剂Fer-1治疗后，上述病理症状得到明显缓解。肾小管损伤评分显示，经桃叶珊瑚苷或其苷元以及铁死亡抑制剂Fer-1治疗后，肾小管损伤明显减轻(图17)。如图18所示，westernblot结果显示，经桃叶珊瑚苷或其苷元以及铁死亡抑制剂Fer-1治疗后，肾脏组织中GPX-4含量显著得到提升。这说明，桃叶珊瑚苷或其苷元对阿霉素诱导肾功能衰竭模型发生的铁死亡具有抑制作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神和实质的基础之上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，其特征在于，所述的桃叶珊瑚苷或其苷元为具有或含有如下结构式的化合物：
Figure FDA0002689789060000011
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包含上述结构式的化合物选自6-O取代桃叶珊瑚苷衍生物，10-O取代桃叶珊瑚苷衍生物，6,10-O双取代桃叶珊瑚苷衍生物和6’-O取代桃叶珊瑚苷衍生物。
4.根据权利要求1所述的桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，其特征在于，所述药物是含有预防或治疗有效量的桃叶珊瑚苷或其苷元以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。
5.根据权利要求1-4任一所述项桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括口服给药，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，鼻腔给药，腹腔注射，舌下给药或经皮给药。
6.根据权利要求5所述的桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，其特征在于，特别是桃叶珊瑚苷或其苷元在制备预防或治疗铁死亡相关疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的桃叶珊瑚苷或其苷元在制备抑制铁死亡药物中的应用，其特征在于，所述铁死亡相关疾病选自脑卒中，脑外伤，脏器纤维化，缺血再灌注损伤，神经退行性疾病，肝肾衰竭，心脏病，药物心脏和肝脏毒性。
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