CN110624099A - 一种醋酸格拉替雷多囊脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种醋酸格拉替雷多囊脂质体，其以普通磷脂、三甘油酯和带电磷脂构成的脂质体膜材，在多囊脂质体中还包封有活性成分醋酸格拉替雷。所述的脂质体膜材还包括胆固醇。普通磷脂，带电磷脂与三甘油酯的质量比为3‑10:1:0.8‑1.2。本发明的制备得到的醋酸格拉替雷脂质体制备方法简单，载药量高，能够达到缓慢释放的效果。

Description

一种醋酸格拉替雷多囊脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及格拉替雷的组合物，特别是涉及一种缓慢释放的格拉替雷多囊脂质体及其制备方法，属于药物制剂领域。

背景技术

醋酸格拉替雷是一种人工合成的肽类制剂,由谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸四种氨基酸组成,用于治疗多发性硬化症。

醋酸格拉替雷(商品名:Copaxone)由全球知名的以色列药厂TEVA所研发制造,于1996年首先在以色列核准上市,同年获FDA批准在美国上市,目前已在43个主要国家上市。在具有较多多发性硬化症患者的西方国家中,醋酸格拉替雷的疗效与耐受性皆获得十足的肯定。TEVA2013年年报显示醋酸格拉替雷当年销售额达到43亿美元。根据IMS报告,醋酸格拉替雷2013年度全球药物市场销售额位列第15名。

醋酸格拉替雷注射液为白色至灰白色的灭菌冻晶粉末，包装另附注射用水以调制成注射溶液之用。主要作为单次皮下注射以治疗多发性硬化症.

醋酸格拉替雷由4种氨基酸组成：L-glutamic acid(L-谷氨酸)，L-alanine(L-丙氨酸)，L-lysine(L-赖氨酸)与L-tyrosine(L-络氨酸)，分子式为：C25H45N5O13,平均分子量约为7,000daltons。

在具有较多多发性硬化症患者的西方国家中,Copaxone的疗效与耐受性皆获得十足的肯定。除了许多研究与临床经验证实其能大幅度地减低患者的复发率,改善失能的病况,减少脑部损伤之外,Copaxone的副作用发生率少,有助于提升患者的耐受性。另外,相关研究亦显示Copaxone较之干扰素更能显著地降低复发率,防止神经进一步的损伤与恶化,而且也具有更好的耐受性。在其它长期使用的疗效研究里(6年至最长12年不等),Copaxone亦证实能持续地延缓患者其神经学上病程的恶化或者让患者维持稳定的病况,减少脑内损伤并防止神经元大量遭受破坏终至丧失功能的恶化情形。作用机制主要是由Copaxone调控多发性硬化症患者体内的免疫进程以达到治疗的目的。进入体内后,Copaxone与免疫系统内的调控因子结合并进入中枢神经,透过一连串的免疫作用扭转多发性硬化症患者其自体免疫进程；亦即刺激有害或前发炎性的T细胞转换为有益的或抗发炎的T细胞。Copaxone可直接作用于神经细胞损伤部位并直接减少发炎情形.这些效益都有助于减少多发性硬化症患者其复发率,以及有效降低其进一步的损伤.

多发性硬化症(Multiple Sclerosis)是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统疾病。可引起各种症状，包括感觉改变、视觉障碍、肌肉无力、忧郁、协调与讲话困难、严重的疲劳、认知障碍、平衡障碍、体热和疼痛等，严重的可以导致活动性障碍和残疾。多发性硬化症影响脑和脊髓的神经细胞──神经元。神经元传递信息，形成思维和感觉，以使大脑控制身体。保护这些神经元的脂肪层为髓鞘(Myelin Sheath)，协助神经元进行电信号传递。多发性硬化症逐渐造成大脑和脊髓的斑块性的神经髓鞘的破坏(脱髓鞘)，髓鞘的瘢痕形成影响神经轴突的信号传递，以失去大脑和脊髓对外周的控制，以至多部位的僵硬或丧失功能。

多发性硬化症的平均发病年龄一般在20至40岁，女性发病人数两倍于男性。多发性硬化症的病因不清，多被认为是自身免疫性疾病。少数人认为是一种代谢依赖性神经变性疾病。

未来10年，全球多发性硬化症市场(MS)将以4％的年度复合增长率(CAGR)增长，并在2023年达到200亿美元。

的唯一建议投予途径为皮下注射，不该作静脉注射，其建议投予剂量为每天20mg皮下(皮肤下脂肪层)注射；由于需要每天注射1次，临床上使用不太方便；每周注射3次的长效版Copaxone获FDA批准，方便了病人的使用。

由于该药的血浆半衰期短，使用相对缓释作用的剂型就显得尤为重要。而多囊脂质体由于天然的生物膜结构，且具有较好的缓释作用，而备受青睐。

多囊脂质体(Multivescular liposome,商品名DepoFoam)是一种非同心脂质体。该脂质体是1983年美国科学家Kim S等首先发现的。当时他们研究制备一种与细胞大小相近的脂质体用于生物膜模拟，采用复乳法制备，处方中添加了三油酸甘油脂，发现得到的脂质体具有蜂窝状多囊结果，像一个大的肥皂泡沫中有很多小泡隔室。后来发现该脂质体可用于药物的缓控释，缓释时间可以达到几天至几星期。经过多年的研究与发展，现在已经有两个产品问世。这两个产品均为美国DepoTech公司(现已并入SkyePharma公司)所研发的，技术已成为该公司的一个技术平台。这两个品种是Depomorphine^TM和Depocyt^TM。Depocyt^TM主要用于治疗淋巴性脑膜炎。将阿糖胞苷制成Depocyt^TM后，给药次数从每2 d 1次减少为每3周1次，极大地改善了病人的顺应性。Depomorphine^TM主要用于缓解手术后疼痛。传统的吗啡制剂由于作用时间短，需要多次给药。而Depomorphine^TM的作用可以持续48 h，这段时间正是手术后疼痛的高峰期。

众所周知，微球、微囊也可以用于缓控释。与微球、微囊相比，多囊脂质体有以下优点：药物的包封率、回收率较高，与其内水相体积较大有关；药物释放时没有突释现象；制备原料为磷脂、胆固醇、三甘油酯等材料，具有很好的生物相容性和生物可降解性；制备条件相对温和，不仅可以用于小分子药物的包封，还可用于蛋白、多肽等大分子药物的包封。目前已研究的包封于多囊脂质体中的一些药物有阿米卡星、甲氨喋呤、庆大霉素、顺铂、吗啡等小分子药物和骨髓细胞生长因子(myelopoietin)、造血生长因子(progenipoietin)、载脂蛋白E(apolipoprotein E)、人干扰素α-2b等蛋白多肽类药物。

由于以上优点，目前多囊脂质体被誉为独一无二的脂质药物储库。多囊脂质体与普通的单室、多室脂质体是有区别的，主要体现在三方面：形态结构、组成和粒径大小。在组成上，多囊脂质体除含有磷脂和胆固醇外，还需使用三甘油酯。在粒径方面，典型的多囊脂质体的粒径一般为5-50μm，而典型的普通的单室、多室脂质体一般为0.1-5μm，多囊脂质体的粒径较普通脂质体大一到两个数量级。与单室、多室脂质体具有相同的圆心的结构不同，多囊脂质体是没有相同的圆心的(非同心的)，其内部有许多大小不一、形状很不规则的小囊，这些小囊是紧密地堆积在一起的，小囊与小囊之间被脂质双层膜隔开，其内部结构与泡沫很相像，这也可能是其商品名叫DepFoam(即depot-foam)的原因。这种结构赋予了脂质膜较强的机械强度，使其稳定性优于普通脂质体。多囊脂质体能实现药物的缓控释的原因，也就在于它具有这种独特的结构。

发明内容

现有技术通过把药物制备成注射剂，在体内作用时间较短；而多囊脂质体相对来说释放缓慢，在体内作用较长。

本发明一个方面提供了一种醋酸格拉替雷多囊脂质体，其以普通磷脂、三甘油酯和带电磷脂构成的脂质体膜材，在多囊脂质体中还包封有活性成分醋酸格拉替雷。

在本发明的技术方案中，所述的脂质体膜材还包括胆固醇。

本发明旨在提供一种能有效延长醋酸格拉替雷在体内释放时间的多囊脂质体，该组合物含有活性成分醋酸格拉替雷，通过选择合适的处方和工艺获得适合病人需求的组合物。

本发明提供的多囊脂质体，普通磷脂选自豆磷脂，卵磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，氢化磷脂(HSPC)或其组合。

三甘油酯选自三油酸甘油酯，三辛酸甘油酯，三棕榈酸甘油酯，三月桂酸甘油酯，三癸酸甘油酯，三辛酸甘油酯，三己酸甘油酯或其组合。

带电磷脂选自磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，心磷脂，磷脂酰肌醇等或其组合，内水相/外水相可以选择蔗糖，甘露醇，乳糖，山梨醇，葡萄糖，柠檬酸，氯化钠，精氨酸，赖氨酸，PBS缓冲盐等；还可以选择性加入或不加调节脂质体磷脂双分子层膜流动性的胆固醇。

在一些实施例中，本发明提供的多囊脂质体中，醋酸格拉替雷与脂质体膜材的质量比为1：10到1：300。优选为，1:30到1:250，更优选为，1:36.5到1:224。

在一些实施例中，带电磷脂和三甘油酯的质量比为0.8-1.2，优选为0.9-1.1。

在一些实施例中，磷脂，带电磷脂与三甘油酯的质量比为3-10:1:0.8-1.2。

在一些实施例中，有机溶剂选自易挥发的溶剂，优选为氯仿，丙酮，氯仿，乙醚或其混合物，更优选的是氯仿，乙醚的混合溶剂。

在本发明的一个具体的技术方案中，以质量份计，将1份醋酸格拉替雷溶于水中得到水相，将100份大豆磷脂、100份胆固醇、12份磷脂酰丝氨酸、12份三油酸甘油酯溶于有机溶剂中得到油相，将水相加入油相中，制备初乳；将所得的初乳加入同体积外水中，继续乳化，得到复乳；所得的复乳吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。

在本发明的一个具体的技术方案中，以质量份计，将1份醋酸格拉替雷溶于水中得到水相，将25份卵磷脂、6份磷脂酰丝氨酸、5.5份三辛酸甘油酯溶于有机溶剂中得到油相，将水相加入同体积的油相中，制备初乳；将所得的初乳加入同体积外水中，继续乳化，得到复乳；所得的复乳吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。

本发明另一方面提供了的醋酸格拉替雷多囊脂质体的制备方法：

1)将醋酸格拉替雷溶于水中得到水相；

2)将脂质体膜材溶于有机溶剂中，得到油相；

3)将水相与油相混合制备W/O初乳；

4)将初乳与等量水混合，继续乳化，得到复乳；

5)去除复乳中的有机相，得到醋酸格拉替雷多囊脂质体。

有机相中的有机溶剂一般采用易挥发的溶剂，通常为氯仿或氯仿与乙醚的混合液。脂质为磷脂、中性脂质(常为三甘油酯)、胆固醇等。制备初乳的方法可以从制备乳剂的方法中选择，包括超声、高速分散、乳匀机、喷嘴雾化等方法。实验室制备常采用高速分散器或涡旋混合器乳化；W/O初乳与第二水相缓冲液混合制备复乳；除去复乳中的有机溶剂，形成多囊脂质体。除去的方法常用氮气，可以在表面通氮气，也可以将氮气的导管伸入盛有多囊脂质体容器的底部；适于储存和生理上可以接受的盐溶液置换第二水相，除去未包封的药物，浓缩。

这些步骤中都包括一个制备复乳的过程。必须说明的是，制备多囊脂质体的脂质中一定要含有中性脂质，否则只能得到普通脂质体。同时脂质中还含有三甘油酯，影响多囊脂质体释放速率的主要因素是三甘油酯中长链三甘油酯与短链三甘油酯的比例，采用长链三甘油酯，药物的释放速率慢；而短链三甘油酯则相反。可以通过调节两者之间的比例获得所需的药物释放速率。三甘油酯不是均一地夹杂在脂质双层膜中，而是有一部分以小油滴的形式分散在多囊脂质体的内水相中，另一部分则填充在小囊与小囊之间的脂质膜交联部位的空隙中，起着连接、架桥、稳定内部小囊的作用

三甘油酯填充于多囊脂质体小囊与小囊之间连接处的空隙中，起着连接、架桥、稳定内部小囊的作用。不同链长的三甘油酯起稳定作用的程度不同，导致药物在体内外的释放速率不同。采用长链三甘油酯，药物的释放速率慢；而短链三甘油酯则相反。一般采用长链和短链的三甘油酯混合，通过调整它们的比例调节药物释放速率。长链三甘油酯占的比例越大，释放速率越慢。

影响脂质体稳定性的原因主要与脂质体的电位有关，处方中带有带电磷脂，防止脂质体之间的聚集，而酸性越强，沉淀越多的原因可能是带电磷脂在酸性条件下电荷被屏蔽，导致脂质体易聚集。

在本发明的技术方案中，内水相/外水相可以选择蔗糖，甘露醇，山梨醇，葡萄糖，柠檬酸，氯化钠，精氨酸，赖氨酸，PBS缓冲盐，氢氧化钠，碳酸氢钠，碳酸钠，硫酸胺等。

还可以选择性加入或不加调节脂质体磷脂双分子层膜流动性的胆固醇。

本发明实施例公开了一种格拉替雷多囊脂质体及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进制剂处方实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的处方或工艺进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

具体实施方式

实施例1格拉替雷多囊脂质体的制备

将醋酸格拉替雷50mg溶于30mL水相中，大豆磷脂5g、胆固醇5g、磷脂酰丝氨酸0.6g、三油酸甘油酯0.6g溶于氯仿-乙醚(1：1)30mL(油相)中，将水相加入油相中，涡旋混合器振荡乳化8min，制备初乳。将所得的初乳加入同体积外水相中，涡旋混合器振荡乳化1-240s，通常20-80s。所得的复乳经氮气吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。所得的多囊脂质体粒径与二次乳化的时间长短有关，时间越长，粒径越小。离心，除去上清液，用生理盐水重新混悬多囊脂质体。

实施例2格拉替雷多囊脂质体的制备

将醋酸格拉替雷200mg溶于100mL水相中，卵磷脂5g、磷脂酰丝氨酸1.2g、三辛酸甘油酯1.1g，溶于氯仿或氯仿与乙醚的混合溶剂120mL(油相)中，将水相加入同体积的油相中，高速分散器8000-15000r/min乳化6-12min，制备初乳。将所得的初乳加入同体积外水相中，高速分散器4500-5000r/min乳化30-120s。所得的复乳经氮气吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。离心，除去上清液，用生理盐水重新混悬多囊脂质体。

实施例3格拉替雷多囊脂质体的制备

将醋酸格拉替雷50mg溶于30mL水相中，大豆磷脂5g、胆固醇5g、磷脂酰丝氨酸0.6g、三油酸甘油酯0.1g溶于氯仿-乙醚(1：1)30mL(油相)中，将水相加入油相中，涡旋混合器振荡乳化8min，制备初乳。将所得的初乳加入同体积外水相中，涡旋混合器振荡乳化1-240s，通常20-80s。所得的复乳经氮气吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。所得的复乳经氮气吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。离心，除去上清液，用生理盐水重新混悬脂质体。

实施例4格拉替雷多囊脂质体的制备

将醋酸格拉替雷200mg溶于100mL水相中，卵磷脂5g、磷脂酰丝氨酸3g、三辛酸甘油酯1.1g，溶于氯仿或氯仿与乙醚的混合溶剂120mL(油相)中，将水相加入同体积的油相中，高速分散器8000-15000r/min乳化6-12min，制备初乳。将所得的初乳加入同体积外水相中，高速分散器4500-5000r/min乳化30-120s。所得的复乳经氮气吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。离心，除去上清液，用生理盐水重新混悬脂质体。

实施例5粒径的测定

采用马尔文2000激光粒度仪，采用湿法测定得到的脂质体粒径，实施例1的粒径为19.43±7.63um，实施例2的粒径为16.39±3.45um，实施例3的粒径为18.67±5.83um，实施例4的粒径为14.45±5.75um，实施例1、2，实施3和实施4，均与普通脂质体有明显区别，但实施例3与4形成的粒径相对较小。

实施例6释放度的测定

取得到的多囊脂质体置于具塞试管中，加入4ml含0.01％NaN3的人血浆，固定于溶出仪的搅拌浆上并浸入溶出杯的水液中，水液温度保持37℃，搅拌浆100rpm转动。于设定的时间取样0.5ml，所得样品加入4.5ml生理盐水，10000*g离心10min，弃去上清液，沉淀溶于适量酸化甲醇中，过滤后，HPLC测定，即得各时间点多囊脂质体中未释放的药物量，以下式计算各个时间点的药物释放百分数：

药物释放(％)＝(包封于多囊脂质体中的总药物量-未释放的药物量)/包封于多囊脂质体中的药物量×100％。

表1：不同实施例制备的样品的释放度

结论：从上表可以看出使用实施例3-4制备的多囊脂质体比实施例1-2制备的多囊脂质体释放相对较快，存在突释的问题，可能与实施3处方中中性磷脂三油酸甘油酯比较较低，实施例4处方中带电磷脂磷脂酰丝氨酸比较较高有关。

实施例7包封率的测定

将载药后的脂质体溶液置离心机中，10000*g离心10min，弃去上清液，洗涤收集得到脂质体，测定包封率。

结论：从包封率结果来看，实施例1，2制备的多囊脂质体比实施例3与4制备的多囊脂质体包封率要高，可能与处方中带电磷脂与中性磷脂比例有关。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种醋酸格拉替雷多囊脂质体，其以普通磷脂、三甘油酯和带电磷脂构成的脂质体膜材，在多囊脂质体中还包封有活性成分醋酸格拉替雷。

2.根据权利要求1所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，普通磷脂选自豆磷脂，卵磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱，氢化磷脂或其组合。

3.根据权利要求1-2所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，三甘油酯选自三油酸甘油酯，三辛酸甘油酯，三棕榈酸甘油酯，三月桂酸甘油酯，三癸酸甘油酯，三辛酸甘油酯，三己酸甘油酯或其组合。

4.根据权利要求1-3所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，带电磷脂选自磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，心磷脂，磷脂酰肌醇等或其组合。

5.根据权利要求1-4所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，所述的脂质体膜材还任选地包括胆固醇。

6.根据权利要求1-5所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，醋酸格拉替雷与脂质体膜材的质量比为1：10到1：300。

7.根据权利要求1-6所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，带电磷脂和三甘油酯的质量比为0.8-1.2，优选为0.9-1.1。

8.根据权利要求1-7所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，普通磷脂，带电磷脂与三甘油酯的质量比为3-10:1:0.8-1.2。

9.根据权利要求1所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体，所述多囊脂质体，以质量份计，将1份醋酸格拉替雷溶于水中得到水相，将100份大豆磷脂、100份胆固醇、12份磷脂酰丝氨酸、12份三油酸甘油酯溶于有机溶剂中得到油相，将水相加入油相中，制备初乳；将所得的初乳加入同体积外水中，继续乳化，得到复乳；所得的复乳吹干有机溶剂，即得多囊脂质体；

或者，以质量份计，将1份醋酸格拉替雷溶于水中得到水相，将25份卵磷脂、6份磷脂酰丝氨酸、5.5份三辛酸甘油酯溶于有机溶剂中得到油相，将水相加入同体积的油相中，制备初乳；将所得的初乳加入同体积外水中，继续乳化，得到复乳；所得的复乳吹干有机溶剂，即得多囊脂质体。

10.权利要求1-8所述的醋酸格拉替雷多囊脂质体的制备方法：

1)将醋酸格拉替雷溶于水中得到水相；

2)将脂质体膜材溶于有机溶剂中，得到油相；

3)将水相与油相混合制备W/O初乳；

4)将初乳与等量水混合，继续乳化，得到复乳；

5)去除复乳中的有机相，得到醋酸格拉替雷多囊脂质体。