CN110607555B - 一种制备紫杉醇单晶或无定型物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单晶制备技术领域，具体是涉及一种制备紫杉醇单晶或无定型物的方法。所述方法以溶液冻结诱导紫杉醇的成核与结晶，在溶液的冻结过程中实现溶解的紫杉醇的结晶，快速有效的制备紫杉醇的单晶或无定型物。同时，解决传统紫杉醇单晶培养中难以结晶分子的单晶或无定型物制备问题。所述方法首次实现极低溶液浓度下紫杉醇单晶或无定型物的获取；还解决了高浓度下由于紫杉醇的聚集过快而导致的单晶形成不易控制、易形成多晶，孪晶等问题。所述方法适用范围广。

Description

一种制备紫杉醇单晶或无定型物的方法

本申请要求2018年10月30日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为2018112806394，发明名称为“一种制备与培养药物或药物中间体单晶的方法”的在先申请的优先权，该在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明涉及单晶或无定型物的制备技术领域，具体是涉及一种利用溶液冻结诱导紫杉醇结晶或形成无定型物的方法，特别地，所述方法还可以调控紫杉醇单晶或无定型物粒径大小。

背景技术

紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物，广泛应用于临床治疗，但难溶于水的特征严重限制了其应用范围。当前，临床使用的紫杉醇注射液包括白蛋白结合型(人血白蛋白运载紫杉醇)和溶解型(紫杉醇溶于聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇混合溶剂)两种剂型；然而，前者价格昂贵且载药量不高，后者容易引起过敏反应。因此，研制紫杉醇的高效剂型一直是研究者关注的热点。随着纳米制造技术的发展，通过制备紫杉醇纳米颗粒(包括紫杉醇单晶纳米颗粒和紫杉醇无定型纳米颗粒)，其比表面积可以得到显著增加，从而提升紫杉醇载药量和优化药物表观溶解度和溶解速度，提高生物利用度。目前，湿法研磨法、高压均质法和溶剂蒸发法是制备纳米颗粒的常用方法，具有制备工艺简单，操作性强的优势；但是，批次产品的差异性、能耗巨大和有机溶剂污染等不足，以及难以控制纳米药物晶型和粒径的局限性依然有待解决。研究表明：晶型不同的紫杉醇药物，其稳定性差异巨大；不同粒径的纳米紫杉醇药物针对不同类型的癌症具有治疗的靶向性。由此可见，开发高效制备晶型稳定且粒径可控的紫杉醇纳米药物的生产方法，对拓展紫杉醇的临床应用意义巨大。

发明内容

针对现有技术在紫杉醇单晶或无定型物的制备方法上的不足，本发明旨在提供一种利用紫杉醇溶液的冻结和任选地熟化来控制紫杉醇的供给和聚集速率从而制备紫杉醇单晶或无定型物的方法；本发明首次通过冻结溶液的方式实现对紫杉醇的单晶或无定型物的可控制备，即通过控制紫杉醇溶液的冻结和任选地熟化过程，实现对紫杉醇供给速率和聚集速率的调控，从而调控紫杉醇是否可以成核结晶及其晶体生长情况，实现高效制备紫杉醇的单晶或无定型物，特别地，通过控制冻结溶液的熟化温度，还可以实现粒径可调的单晶或无定型物的制备。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种制备紫杉醇的单晶或无定型物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a1)配制紫杉醇的溶液，其中，配制所述溶液的溶剂为可冻结的溶剂；

(a2)对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，任选地熟化，制备得到含有紫杉醇的单晶或无定型物和冻结态溶剂的混合体系；任选地，

(a3)从步骤(a2)的混合体系中分离得到紫杉醇的单晶或无定型物。

本发明中，所述可冻结的溶剂是指可在一定温度、一定压力下，形成固态的溶剂。

本发明中，所述紫杉醇在溶剂中的溶解度为易溶、可溶、微溶或难溶。

本发明中，所述步骤(a2)具体包括如下步骤：

将步骤(a1)的紫杉醇的溶液降温冻结成固体混合物，并任选地进行熟化处理，制备得到所述混合体系。

本发明的步骤(a2)中，所述冻结是将步骤(a1)的紫杉醇的溶液中的溶剂由液态转化为固态。

本发明中，所述冻结的方法包括但不限于自然冷却冻结、压缩制冷设备降温冻结、半导体制冷设备降温冻结、液氮降温冻结、液氦降温冻结、液态二氧化碳降温冻结、液态氧降温冻结、液态乙烷降温冻结、干冰降温冻结、冰降温冻结等中的一种或几种降温冻结方法的组合。

本发明中，所述冻结的过程包括但不限于快速降温、缓慢降温、分步降温、先升温后降温等中的一种或者几种冻结过程的组合。

本发明中，所述冻结包括但不限于完全冻结，未完全冻结。

本发明中，所述熟化过程即为紫杉醇的溶液在保持冻结状态下停留一段时间。

本发明中，所述的熟化时间是指冻结过程结束后，升温至熟化温度所需的时间，以及在熟化温度下维持的时间。

在一个实施方式中，所述步骤(a2)，对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，制备得到含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系。

在一个实施方式中，所述步骤(a2)中包括熟化过程，即所述步骤(a2)，对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结和熟化处理，制备得到含有紫杉醇的单晶或无定型物和冻结态溶剂的混合体系。

在一个实施方式中，所述步骤(a2)，在熟化过程中，将温度以大于或等于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，且所述熟化的时间小于25min，制备得到含有紫杉醇的无定型物和冻结态溶剂的混合体系。

在一个实施方式中，所述达到某一温与冻结温度之间的差异越大，所得到的单晶或无定型物的颗粒尺寸越大。因此可以通过调整该温差的大小来控制所获得的单晶或无定型物的颗粒尺寸。

在一个实施方式中，所述步骤(a2)，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，和/或所述熟化的时间至少为25min，制备得到含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，保持一段时间，制备得到含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，在熟化过程中，将温度以任意升温或降温速度达到某一温度，熟化至少25min，制备得到含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，熟化至少25min，制备得到含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系。

本发明中，在步骤(a3)中，所述分离是采用物理方式和/或化学方式将冻结成固体的溶剂自混合体系中分离出来。

本发明中，所述的物理方式包括但不限于骤冷分离、升华(如真空升华)、溶解中的一种或几种方式的组合。

本发明中，所述的化学方式包括但不限于化学反应、电解中的一种或几种方式的组合。

本发明中，所述方法还包括如下步骤：

(a4)收集步骤(a3)制备得到的单晶或无定型物。

本发明中，在步骤(a4)中，所述收集包括但不限于采用光学显微镜收集、扫描电子显微镜收集、双束电子显微镜收集、透射电子显微镜收集中的一种或几种的组合。

本发明还提供一种培养紫杉醇单晶的方法，所述方法包括上述的制备单晶的方法。

本发明中，所述培养紫杉醇单晶的方法还包括如下步骤：

(b1)将上述制备的紫杉醇的单晶转移到紫杉醇的母液中进行培养；

(b2)对步骤(b1)的单晶进行收集。

本发明中，在步骤(b1)中，所述的转移可以是将步骤(a2)的含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养；或者所述的转移可以是将步骤(a3)的去除溶剂后的单晶直接转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养；或者是将步骤(a4)收集到的单晶转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养。

本发明中，所述的转移包括但不限于光学显微镜移取、扫描电子显微镜移取、双束电子显微镜移取、透射电子显微镜移取中的一种或几种的组合。

本发明中，在步骤(b1)中，所述单晶的培养方法包括但不限于蒸发法、降温法、扩散法中的一种或几种的组合。

本发明中，在步骤(b2)中，所述收集包括但不限于采用光学显微镜收集、扫描电子显微镜收集、双束电子显微镜收集、透射电子显微镜收集中的一种或几种的组合。

有益效果

1.针对传统方法在制备紫杉醇单晶或无定型物过程中存在分子供给、聚集及成核速度难以控制等缺点，本发明首次提出了溶液冻结诱导紫杉醇的成核与结晶的方法。通过调控冻结的紫杉醇的溶液的冻结过程，和任选地熟化过程，快速有效制备紫杉醇单晶或无定型物。同时，该方法还可以进一步调控紫杉醇单晶或无定型物的粒径大小。

2.相比于传统蒸发法或降温结晶法，本发明采用的冻结处理方式使得紫杉醇的溶液浓度调控范围更大，从很低浓度到过饱和浓度均可实现紫杉醇单晶或无定型物的制备。首次实现了在极低溶液浓度下获取紫杉醇单晶或无定型物；同时解决了高浓度下由于紫杉醇的聚集过快而导致的单晶形成不易控制、易形成多晶，孪晶等问题；另外，本发明还具有在很短时间(几分钟到数小时)内得到紫杉醇单晶或无定型物的优势。

3.本发明中溶液冻结为一技术关键点。所述冻结过程是指使溶液以任意的方式冻结，冻结的时间、冻结的温度、冻结的温度梯度、冻结的方法、冻结的过程等均没有特别的限定。实验证实，通过溶液冻结制备紫杉醇单晶或无定型物的本质在于，在冻结的过程中，溶剂冻结成固体状态(如水分子形成冰晶)的同时，紫杉醇会被释放并聚集在固体状态的溶剂的界面处(如冰晶界面处)，通过对溶剂结晶过程以及结晶的溶剂的重结晶过程的调控(如对水结晶过程以及冰晶重结晶过程的调控)，从而进一步调控其中紫杉醇的释放和聚集速率，有效地实现对于紫杉醇的成核及生长的调控，进而获取紫杉醇的单晶或无定型物。

4.本发明所述熟化过程是指使冻结的溶液在固体状态或固液混合态下保持一定的时间，温度不受限定，升温或降温速度可以进行控制。实验证实，本发明所述的熟化过程作为冻结过程的补充手段，能够优化对固态溶剂重结晶的调控，从而调控固态溶剂中紫杉醇分子的释放速率以及紫杉醇分子向固态溶剂界面处的聚集速率，有利于进一步优化溶液冻结后无定型物的生长和/或单晶成核、生长。不仅如此，熟化过程由于对温度没有过多的限定，较低的熟化温度可以减缓固态溶剂的熟化过程，抑制小尺寸固态溶剂晶粒的熔合，从而减少紫杉醇分子的释放量，有利于制备较小颗粒尺寸的紫杉醇药物单晶或无定型物；较高的熟化温度能够促进固态溶剂的重结晶过程，使更多数量的小尺寸固态溶剂晶粒发生熔合，从而增加冻结在固态溶剂中的紫杉醇分子的释放量，有利于形成较大颗粒尺寸的紫杉醇药物单晶或无定型物。调控经过熟化过程的温度变化，可以获得颗粒尺寸在纳米至微米范围内的单晶或无定型物，从而有利于选择在更经济的温度下，以更高的效率实现无定型物或单晶的优化制备，有利于能耗的降低，从而极大节省成本。更为惊喜地是，申请人研究表明，随着熟化的温度的提升，可以制备得到颗粒尺寸更大的单晶或无定型物。

5.本发明提供的紫杉醇单晶或无定型物的制备方法简单，操作性强。本发明所述方法不仅在实验室基础研究中适用，同样满足在工业生产的需求。

6.本发明的溶剂选取方便，无论是极性或者非极性溶剂，只要可以冻结均可。

附图说明

图1为紫杉醇单晶纳米颗粒的扫描电镜照片及分子式。

图2为紫杉醇单晶纳米颗粒在悬浮液中的粒径分布。

图3为紫杉醇无定型纳米颗粒的透射电镜照片。

图4为紫杉醇无定型纳米颗粒在悬浮液中的粒径分布。

图5为紫杉醇单晶纳米颗粒的扫描电镜照片。

图6为紫杉醇单晶纳米颗粒在悬浮液的粒径分布。

图7为紫杉醇无定型纳米颗粒的透射电镜照片及分子式。

图8为紫杉醇无定型纳米颗粒在悬浮液中的粒径分布。

具体实施方式

本发明中，“任选地”表示进行或者不进行后续步骤。

本发明中，所述紫杉醇的无定型物即为无定型的紫杉醇。

[制备单晶或无定型物的方法]

如前所述，本发明提供一种制备紫杉醇的单晶或无定型物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a1)配制紫杉醇的溶液，其中，配制所述溶液的溶剂为可冻结的溶剂；

(a2)对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，任选地熟化，制备得到含有紫杉醇的单晶或无定型物的冻结态溶剂的混合体系；任选地，

(a3)从步骤(a2)的混合体系中分离得到紫杉醇的单晶或无定型物。

[制备单晶的方法]

如前所述，本发明提供一种制备紫杉醇的单晶的方法，所述方法包括如下步骤：

(a1)配制紫杉醇的溶液，其中，配制所述溶液的溶剂为可冻结的溶剂；

(a2)对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，任选地熟化，制备得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系；任选地，

(a3)从步骤(a2)的混合体系中分离得到紫杉醇的单晶；

其中，所述熟化的过程中升温或降温速率小于10℃/min，和/或，所述熟化的过程中熟化的时间至少为25min。

示例性地，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，保持一段时间，即得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，在熟化过程中，将温度以任意升温或降温速度达到某一温度，熟化至少25min，即得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，熟化至少25min，即得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系。

示例性地，所述达到的某一温度例如小于等于0℃，还例如小于等于-5℃；具体的，可以是-10℃、-15℃、-18℃、-20℃、-24℃、-25℃、-30℃、-72℃、-80℃、-90℃、-100℃或液氮温度，等等。

如上所述，所述升温或降温速率小于10℃/min，例如可以是小于9℃/min，进一步例如小于等于5℃/min。不难理解，若速度为0℃/min，则表示维持与冻结温度一样的温度熟化。

如上所述，所述熟化时间至少为25min，例如可以为30min、40min、50min、55min、60min、90min、100min、120min、150min、200min、300min、500min或更长等等。

[制备无定型物的方法]

如前所述，本发明提供一种制备紫杉醇无定型物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a1)配制紫杉醇的溶液，其中，配制所述溶液的溶剂为可冻结的溶剂；

(a2)对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，熟化，制备得到含有紫杉醇的无定型物的冻结态溶剂的混合体系；任选地，

(a3)从步骤(a2)的混合体系中分离得到紫杉醇的无定型物；

其中，所述熟化的过程中升温或降温速率大于等于10℃/min，所述熟化的过程中熟化的时间小于25min。

示例性地，所述步骤(a2)的熟化过程中，将温度以大于等于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度熟化小于25min，即得到含有紫杉醇的无定型物的冻结态溶剂的混合体系。

在一个实施方式中，所述达到的某一温度与冻结温度之间的差异越大，所得到的无定型物的颗粒尺寸越大。因此可以通过调整该温度的高低来控制所获得的无定型物的颗粒尺寸。示例性地，所述达到的某一温度例如小于等于0℃，还例如小于等于-5℃；具体的，可以是-5℃、-7℃、-8℃、-10℃、-12℃、-20℃、-45℃，等等。优选地，自液氮温度以大于等于10℃/min的升温速度上升到上述温度。

如上所述，所述升温或降温速率大于等于10℃/min，例如大于等于15℃/min，例如可以是15℃/min、16℃/min、17℃/min、18℃/min、19℃/min、20℃/min、21℃/min、22℃/min、23℃/min、24℃/min、25℃/min、26℃/min、27℃/min、28℃/min、29℃/min、30℃/min或更高；所述熟化时间小于25min，例如可以小于25min、小于等于23min、小于等于22min、小于等于21min、小于等于20min，小于等于19min、小于等于18min、小于等于17min或小于等于16min等。

[上述方法中的具体方案]

根据本发明的实施方案，在步骤(a1)中，所述紫杉醇的溶液的配制采用本领域技术人员已知的操作方式进行即可，如采用标准溶液的配制方法。

根据本发明的实施方案，在步骤(a1)中，所述可冻结的溶剂包括但不限于水和/或有机溶剂。

所述水包括但不限于二次水，蒸馏水，超纯水。

所述可冻结的有机溶剂是指可在一定温度、一定压力下形成固态的有机溶剂。

所述可冻结的有机溶剂包括但不限于烃类有机溶剂、卤代烃类有机溶剂、醇类有机溶剂、酚类有机溶剂、醚和缩醛类有机溶剂、酮类有机溶剂、酸和酸酐类有机溶剂、酯类有机溶剂、含氮化合物类有机溶剂、含硫化合物类有机溶剂、多官能团类有机溶剂等。

所述烃类有机溶剂包括脂肪烃(直链脂肪烃、支链脂肪烃、脂环烃)、芳香烃；例如：甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、石油醚、丁烯、环戊烷、环己烷、苯、苯乙烯、甲苯、二甲苯、乙苯、二乙苯、联苯、萘等等；所述卤代烃类有机溶剂为卤素取代的上述烃类有机溶剂，例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、二溴甲烷、溴乙烷、二溴乙烷、二溴丙烷、氯苯、二氯苯、二氯甲苯、二溴苯等，所述醇类溶剂例如包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、2-甲基-1-丁醇、环乙醇、苯乙醇、乙二醇、丙二醇、甘油、丁二醇、戊二醇、乙二醇等；所述酚类溶剂例如为：苯酚、苯二酚、甲酚、二甲酚等；所述醚和缩醛类溶剂例如为：甲醚、乙醚、甲乙醚、丙醚、乙基丁基醚、苯甲醚、二苯醚、环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷、二噁烷、呋喃、四氢呋喃、乙二醇甲醚、乙二醇丁醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二甘醇甲醚、甘油醚、冠醚、苯甲醛、肉桂醛等；所述酮类溶剂例如为：丙酮、甲乙酮、甲基丙酮、戊酮、环己酮、苯乙酮等；所述酸和酸酐溶剂例如为：甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丁酸、乙酸酐、丙酸酐等；所述酯类溶剂例如为：甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、肉桂酸乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、丁内酯等；所述含氮化合物溶剂包括硝基类溶剂、腈类溶剂、胺类溶剂、酰胺类溶剂、内酰胺类溶剂等，例如为：硝基乙烷、硝基苯、乙腈、丙腈、甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、苯胺、吡咯、四氢吡咯、哌啶、吡啶、四氢吡啶、乙二胺、丙二胺、甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、已内酰胺等；所述含硫化合物例如为：二硫化碳、甲硫醚、噻吩、四氢噻吩、二甲基亚砜、二甲基砜等；所述多官能团溶剂例如为：乙二醇一甲醚、二甘醇、聚乙二醇、聚丙二醇、2-氯乙醇、烯丙醇、丙烯腈、二乙醇胺、对甲氧基苯甲醇、吗啉、N-甲基吗啉、乳酸、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸乙酯等。

根据本发明的实施方案，所述有机溶剂还包括上述多种有机溶剂的组合。

根据本发明的实施方案，所述紫杉醇在所述溶剂中具有一定的溶解度；本领域技术人员可以理解，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量可以为任意的，即将紫杉醇溶解在溶剂中即可，而对其溶解在溶剂中的量没有特别的限定；可以理解，所述紫杉醇在溶剂中的溶解度可以为难溶、微溶、可溶及易溶。

根据本发明的实施方案，优选地，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于1×10^-7g/100g(所用溶剂)，例如大于等于0.001g/100g(所用溶剂)，如大于等于0.01g/100g(所用溶剂)，如大于等于0.1g/100g(所用溶剂)，如大于等于1g/100g(所用溶剂)，如大于等于10g/100g(所用溶剂)。

根据本发明的实施方案，所述紫杉醇的溶液的浓度没有特别的限定，即紫杉醇能够溶解在溶剂中即可；本领域技术人员知晓的，所述紫杉醇在溶剂中可以为非饱和溶液或饱和溶液，也可以为过饱和溶液；当然，所述紫杉醇的溶液的浓度的高低对于紫杉醇的聚集速率会有很大影响，浓度较低时，紫杉醇聚集速度较慢，获取单晶或无定型物所需时间会相应增加；浓度较高时，紫杉醇聚集速度较快，获取单晶或无定型物所需时间会相应减少。因此，通过合理的选择浓度，实现通过溶液浓度调控单晶或无定型物的制备时间；当然制备单晶或无定型物的时间不仅仅只取决于溶液的浓度，这与熟化也有紧密的联系。

根据本发明的实施方案，所述紫杉醇的溶液的浓度为大于等于1×10^-7g/100g(所用溶剂)，例如大于等于0.001g/100g(所用溶剂)，如大于等于0.01g/100g(所用溶剂)，如大于等于0.1g/100g(所用溶剂)，如大于等于1g/100g(所用溶剂)，如大于等于10g/100g(所用溶剂)。所述紫杉醇的有机溶剂溶液的浓度的上限没有特别的限定，其可以为紫杉醇在溶剂中的过饱和溶液或饱和溶液。

优选地，所述紫杉醇的溶液的浓度为1×10^-7g/100g(所用溶剂)到1g/100g(所用溶剂)。

根据本发明，所述步骤(a2)具体包括如下步骤：

将步骤(a1)的紫杉醇的溶液降温冻结成固体混合物，并任选地进行熟化处理，制备得到含有紫杉醇的单晶或无定型物的冻结态溶剂的混合体系；

优选地，所述冻结是将步骤(a1)的紫杉醇的溶液由液态转化为固态。

本发明中，发明人出人意料地发现了所述溶液在冻结过程中，溶剂会冻结为固体，而溶解于溶液中的紫杉醇会在溶剂界面处实现浓度聚集，为形成单晶或无定型物提供可能。另外，冻结的紫杉醇的溶液，当处于冻结过程和任选地进一步的熟化过程时，溶剂形成的晶粒尺寸会逐渐变大，从而紫杉醇会在每个晶体的界面处不断聚集，不断长大并形成无定型物或单晶，最后可以获得颗粒尺寸在几十纳米至几百纳米的紫杉醇纳米颗粒。

根据本发明的实施方案，所述冻结包括但不限于完全冻结，未完全冻结。本领域技术人员可以理解，所述完全冻结是指紫杉醇的溶液被完全冻结成固体；所述未完全冻结是指紫杉醇的溶液部分被冻结成固体，部分还为液体状态。

根据本发明的实施方案，本领域技术人员可以理解，所述冻结可以是以任意一种或几种降温方法对具有任意体积和形状的紫杉醇的溶液以任意一种或几种降温过程将其冻结为固体或固液混合物。即所述冻结是将紫杉醇的溶液冻结为固体或固液混合物。所述冻结结晶法相比于传统的蒸发法和降温结晶法，对紫杉醇的溶液浓度调控范围更大，得到紫杉醇单晶所需时间极大缩短。

根据本发明的实施方案，所述冻结的时间、冻结的温度、冻结的温度梯度、冻结的方法、冻结的过程等均没有特别的限定，将任意体积和形状的紫杉醇的溶液冻结为固体或固液混合物即可。当然，在冻结过程中也可以考量紫杉醇的溶液的浓度进行合理的选择，目的是为了控制紫杉醇的扩散速率，进而影响其结晶过程。示例性地，若紫杉醇的溶液的浓度较高时，此时选用的冻结时间可以适当缩短、冻结温度可以适当降低；这样操作的目的是为了防止较高浓度的溶液中的紫杉醇难以控制地形成多晶；若紫杉醇的溶液的浓度较低时，此时选用的冻结时间可以适当延长、冻结温度可以适当提高；这样的操作的目的是实现紫杉醇有效的聚集，进而可控形成无定型物或单晶。

根据本发明的实施方案，所述冻结的方法为本领域技术人员已知的操作方式，例如采用任意制冷装置进行降温冻结操作或是采用任意低温物质进行降温冻结；示例性地，所述冻结的方法包括但不限于压缩制冷设备降温冻结、半导体制冷设备降温冻结、液氮降温冻结、液氦降温冻结、液态二氧化碳降温冻结、液态氧降温冻结、液态乙烷降温冻结、干冰降温冻结、冰降温冻结等中的一种或几种降温冻结方法的组合。

根据本发明的实施方案，所述冻结的操作压力同样没有限定，其可以为常压下的冻结，也可以为高压或低压下的冻结处理。

根据本发明的实施方案，所述冻结的过程为本领域技术人员已知的操作方式，例如通过任意过程使紫杉醇的溶液由液态冻结为固态，示例性地，所述冻结的过程包括但不限于快速降温、缓慢降温、分步降温、先升温后降温等中的一种或者几种冻结过程的组合。

根据本发明的实施方案，所述紫杉醇的溶液的体积和形状没有特别的限定；紫杉醇的溶液冻结成的固体的体积与形状同样没有特别的限定，只要能将其冷冻得到固体或固液混合物即可；本领域技术人员可以理解的，所述冻结可以是将任意体积的紫杉醇的溶液进行整体冻结、或者是将任意体积的紫杉醇的溶液形成的膜进行冻结、又或者是将任意体积的紫杉醇的溶液形成的液滴进行冻结。

根据本发明的实施方案，对冻结成固体或固液混合物的紫杉醇的溶液可以任选进一步进行熟化处理；所述熟化处理过程中熟化的温度、熟化的时间、熟化的过程均没有特别的限定，但需保证所述熟化处理过程中冻结的紫杉醇的溶液仍至少部分或全部保持固体状态即可，即所述熟化过程中紫杉醇的溶液仍保持冻结状态；例如采用与冻结处理相同的方法对所述固体进行熟化处理，或采用其他的方法对所述固体进行熟化；所述熟化处理的目的是为了实现紫杉醇聚集与纳米颗粒生长速度的调控，进而得到紫杉醇的单晶或无定型物。本领域技术人员能够理解，所述熟化温度应为低于使已冻结的紫杉醇的溶液重新融化的温度(即T_融化)，优选的所述熟化温度低于T_融化5℃以上，更优选低于T_融化10℃以上。

根据本发明的实施方案，所述熟化过程即为紫杉醇的溶液在保持冻结状态下停留一段时间。这里的冻结状态可以为完全冻结，也可以为未完全冻结，根据本领域技术人员已知的操作进行选择即可。

根据本发明的实施方案，所述熟化过程，例如采用快速升温(或降温)或缓慢升温(或降温)等方式，示例性地，所述熟化过程的升温或降温速率大于等于10℃/min，此范围的升温或降温速率会使紫杉醇从固体混合物中快速释放并且产生无序聚集，通过对熟化时间的限定，为制备得到无定型物提供保障。

示例性地，所述熟化过程的升温或降温速率小于10℃/min，此范围的升温或降温速率会使紫杉醇从固体混合物中缓慢释放进而产生有序聚集，可以制备得到单晶。

根据本发明的实施方案，熟化温度(即所述达到的某一温度)控制的是冻结溶剂的晶粒的尺寸大小进而控制紫杉醇聚集速度，即熟化温度与冻结温度的温差越大，冻结溶剂的晶粒尺寸较大，紫杉醇聚集速度较快，形成单晶或无定型物所需时间较短，那么制备得到的紫杉醇的单晶或无定型物的颗粒尺寸也较大；熟化温度与冻结温度的温差越小，冻结溶剂的晶粒尺寸较小，紫杉醇聚集速度较慢，形成单晶或无定型物所需时间较长，且制备得到的紫杉醇的单晶或无定型物的颗粒尺寸也较小。即熟化温度与冻结温度的温差越大，制备得到的紫杉醇的单晶或无定型物的颗粒尺寸也较大。

根据本发明的实施方案，对所述熟化的时间没有特别的限定，其可以为本领域技术人员已知的过程，从上述关于本申请的方法的机理描述可以看出，熟化的过程可以理解为无定型物的成核与生长或单晶形成与生长的过程，适当的延长熟化的时间，可以获得颗粒尺寸、形态完整的无定型物或单晶，但需要注意的是，由于调节熟化时间的本质是对紫杉醇的聚集浓度进行调控，过久的熟化可能会导致聚集浓度过高，反而不利于形成无定型物或单晶。示例性地，所述熟化的时间为大于1皮秒，优选地，所述熟化的时间为1～1000分钟，进一步优选地，所述熟化的时间为10～300分钟。

示例性地，所述熟化的时间小于25min，通过与熟化过程的升温或降温速率进行调控，可以实现无定型物的制备。所述熟化的时间至少为25min时，可以进一步对紫杉醇的聚集浓度进行调控，例如可以制备得到单晶。但是所述熟化的时间也不能过长，过长的熟化时间可能会使已知得到的单晶进一步变成多晶结构。

根据本发明的实施方案，熟化过程可以采用任意制冷装置或采用任意低温，使紫杉醇的溶液仍保持冻结状态即可；例如采用自然冷却方式、压缩制冷设备、半导体制冷设备、或采用液氮、液氦、液态二氧化碳、液态氧、液态乙烷、干冰、冰等中的一种或几种方法的组合。

根据本发明的实施方案，在步骤(a3)中，所述分离可以是采用物理方式和/或化学方式将冻结成固体的溶剂自所述体系中分离出来。冻结或任选进一步熟化结束后已经制备得到单晶或无定型物，此时的单晶或无定型物是存在于溶剂晶体界面处的，需要通过适当的方法将其分离开；或者是将溶剂去除。

根据本发明的实施方案，所述的物理方式包括但不限于骤冷分离、升华(如真空升华)、溶解中的一种或几种方式的组合。所述升华例如可以利用冷冻干燥的方式进行；所述真空升华例如可以利用真空条件下的冷冻干燥的方式进行；所述溶解例如用另一种液态溶剂将已冻结的溶剂进行溶解。

根据本发明的实施方案，所述的化学方式包括但不限于化学反应、电解中的一种或几种方式的组合。

根据本发明，所述方法还包括如下步骤：

(a4)收集步骤(a3)制备得到的单晶或无定型物。

根据本发明的实施方案，在步骤(a4)中，所述收集包括但不限于采用光学显微镜收集、扫描电子显微镜收集、双束电子显微镜收集、透射电子显微镜收集中的一种或几种的组合。

[培养单晶的方法]

如前所述，本发明还提供一种培养单晶的方法，所述方法包括上述的制备单晶的方法。

根据本发明的实施方案，所述培养单晶的方法还包括如下步骤：

(b1)将上述制备的紫杉醇的单晶转移到紫杉醇的母液中进行培养；

(b2)对步骤(b1)的单晶进行收集。

根据本发明的实施方案，所述的转移为本领域技术人员知晓的任意一种能够移取单晶的方法，包括但不限于光学显微镜移取、扫描电子显微镜移取、双束电子显微镜移取、透射电子显微镜移取中的一种或几种的组合。

根据本发明的实施方案，所述的母液为本领域技术人员知晓的与待培养的单晶相适配的母液体系，例如可以为饱和溶液体系，也可以为过饱和溶液体系或为不饱和溶液体系。

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

用质量比为1:99的二甲基亚砜-水配制浓度为5μM的紫杉醇溶液，用量筒分别取5份5mL的溶液至烧杯中，将其放置于-196℃的液氮中冷却至完全冻结，然后以5℃/min缓慢升温将其分别置于-53℃，-42℃，-34℃，-30℃，-23℃的控温冷阱中维持45min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇单晶纳米颗粒，且其颗粒尺寸在10nm到1500nm连续可调，如图1所示，随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL吐温-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇单晶纳米颗粒形成稳定的悬浮液，检测结果见图2，从图2中可以看出，从左往右制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒分布为12nm，120nm，430nm，680nm，1200nm。

实施例2

用质量比为1:99的二甲基亚砜-水配制浓度为3μM的紫杉醇溶液，用注射器取100μL的溶液，将其铺展在硅片上，放置于-80℃的冷台降温冻结至完全冻结，冷台控温20℃/min分别升至-53℃，-34℃，-23℃并维持10min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇无定型纳米颗粒，且其颗粒尺寸在7nm到1000nm连续可调，如图3所示，随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL吐温-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇无定型纳米颗粒形成稳定的悬浮液，检测结果见图4，从图4中可以看出，从左往右制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒的粒径分别为7nm，130nm，910nm。

实施例3

用水作为溶剂配制浓度为1μM的紫杉醇溶液，用注射器取1mL的溶液，将其铺展在硅片上，放置于-196℃的液氮降温冻结至完全冻结，冷台控温5℃/min分别升至-45℃，-25℃，-15℃，-10℃，-5℃并维持45min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇单晶纳米颗粒，且其颗粒尺寸在10nm到1500nm连续可调，如图5所示，随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL吐温-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇单晶纳米颗粒形成稳定的悬浮液，检测结果见图6，从图6中可以看出，从左往右制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒的粒径分别为10nm，120nm，340nm，790nm，1300nm。

实施例4

用水作为溶剂配制浓度为1μM的紫杉醇溶液，用注射器取0.5mL的溶液，将其铺展在硅片上，放置于-196℃的液氮降温冻结至完全冻结，冷台控温20℃/min分别升至-45℃，-15℃，-5℃并维持12min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇无定型纳米颗粒，且其颗粒尺寸在7nm到1000nm连续可调，如图7所示，随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL吐温-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇无定型纳米颗粒形成稳定的悬浮液，检测结果见图8，从图8中可以看出，从左往右制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒的粒径分别为6.4nm，106nm，840nm。

实施例5

用氯仿配制浓度为5mM的紫杉醇溶液，用注射器取100μL的溶液，将其铺展在硅片上，将其放置-196℃液氮中降温至完全冻结，然后以5℃/min升温并将其分别升温到-120℃，-109℃，-95℃，-88℃，-82℃的控温冷阱中熟化55min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态化溶剂，便可得到紫杉醇单晶纳米颗粒，且其颗粒尺寸在10nm到1500nm连续可调，具体地，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒的粒径分别为13nm，150nm，390nm，770nm，1180nm，说明随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL司盘-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇单晶纳米颗粒形成稳定的悬浮液。

另外，取上述紫杉醇溶液50μL铺展在降温到-150℃的硅片上，然后以25℃/min的升温速率，分别将其升温到-120℃，-95℃，-82℃的控温冷台上维持15min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇无定型纳米颗粒，且其颗粒尺寸在7nm到1000nm连续可调，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒的粒径分别为9.5nm，320nm，900nm，说明随着熟化温度的升高，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒随之增大。最后采用0.1mg/mL司盘-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇无定型纳米颗粒形成稳定的悬浮液。

实施例6

用乙腈配制浓度为1mM的紫杉醇溶液，用移液枪取10μL的溶液，将其滴落在已降温到-196℃的硅片上，然后以5℃/min升温，并将其分别置于-83℃的冷台表面维持30min，于-78℃的冷台表面维持45min，于-65℃的冷台表面维持55min，于-57℃的冷台表面维持65min，于-48℃的冷台表面维持75min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态化溶剂，便可得到紫杉醇单晶纳米颗粒且其颗粒尺寸在10nm到1500nm连续可调，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒的粒径分别为11.8nm，140nm，410nm，830nm，1200nm，说明随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇单晶纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL司盘-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇单晶纳米颗粒形成稳定的悬浮液。

另外，取20μL上述紫杉醇溶液铺展在降温到-150℃的硅片上，然后以25℃/min的升温速率，将其升温到-83℃，-65℃，-48℃并维持10min，随后冷冻干燥样品，完全升华固态溶剂，便可得到紫杉醇无定型纳米颗粒且其颗粒尺寸在7nm到1000nm连续可调，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒的粒径分别为78.2nm，300nm，935nm，说明随着熟化温度的提升，制备得到的紫杉醇无定型纳米颗粒随着增大。最后采用0.1mg/mL司盘-80溶液1000mL分别收集得到的紫杉醇无定型纳米颗粒形成稳定的悬浮液。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种制备紫杉醇的单晶或无定型物的方法，其特征在于，所述方法不同于传统的蒸发法和降温结晶法，其利用溶液冻结诱导紫杉醇结晶或形成无定型物，所述方法利用溶液冻结诱导紫杉醇结晶或形成无定型物，

所述制备紫杉醇的单晶的方法包括如下步骤：

(a1) 配制紫杉醇的溶液，其中，所述紫杉醇的溶液由紫杉醇和可冻结的溶剂组成；

(a2) 对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，熟化，制备得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系；其中，所述熟化的过程中升温速率小于10℃/min，和/或，所述熟化的过程中熟化的时间至少为25min；所述熟化温度应为低于使已冻结的紫杉醇的溶液重新融化的温度；任选地，

(a3) 从步骤(a2)的混合体系中分离得到紫杉醇的单晶；

所述制备紫杉醇的无定型物的方法包括如下步骤：

(a1) 配制紫杉醇的溶液，其中，所述紫杉醇的溶液由紫杉醇和可冻结的溶剂组成；

(a2’) 对步骤(a1)的紫杉醇的溶液进行冻结，熟化，制备得到含有紫杉醇的无定型物的冻结态溶剂的混合体系；其中，所述熟化的过程中升温或降温速率大于等于10℃/min，所述熟化的过程中熟化的时间小于25min；所述熟化温度应为低于使已冻结的紫杉醇的溶液重新融化的温度；任选地，

(a3’) 从步骤(a2’)的混合体系中分离得到紫杉醇的无定型物；

所述冻结是将步骤(a1)的紫杉醇的溶液由液态转化为固态，所述熟化过程为紫杉醇的溶液在保持冻结状态下停留一段时间，在冻结的过程中，溶剂冻结成固体状态的同时，紫杉醇会被释放并聚集在固体状态的溶剂的界面处，通过对溶剂结晶过程以及结晶的溶剂的重结晶过程的调控，进一步调控其中紫杉醇的释放和聚集速率，从而形成紫杉醇的单晶或无定型物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在熟化过程中，将温度以小于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度，熟化至少25min，即得到含有紫杉醇的单晶的冻结态溶剂的混合体系。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在熟化过程中，将温度以大于等于10℃/min的升温或降温速度达到某一温度熟化小于25min，即得到含有紫杉醇的无定型物的冻结态溶剂的混合体系。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，所述可冻结的溶剂包括水和/或有机溶剂。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，所述紫杉醇在溶剂中的溶解度为易溶、可溶、微溶或难溶。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于1×10^-7g/100g的所用溶剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于0.001g/100g的所用溶剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于0.01g/100g的所用溶剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于0.1g/100g的所用溶剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于1g/100g的所用溶剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述紫杉醇在溶剂中溶解的量为大于等于10g/100g的所用溶剂。

12.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(a2)或步骤(a2’)具体包括如下步骤：

将步骤(a1)的紫杉醇的溶液降温冻结成固体混合物，并任选地进行熟化处理，制备得到含有紫杉醇的单晶或无定型物的冻结态溶剂的混合体系。

13.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述冻结的方法包括自然冷却冻结、压缩制冷设备降温冻结、半导体制冷设备降温冻结、液氮降温冻结、液氦降温冻结、液态二氧化碳降温冻结、液态氧降温冻结、液态乙烷降温冻结、干冰降温冻结、冰降温冻结中的一种或几种降温冻结方法的组合。

14.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述冻结的过程包括快速降温、缓慢降温、分步降温、先升温后降温等中的一种或者几种冻结过程的组合。

15.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述冻结包括完全冻结或未完全冻结。

16.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a3)或步骤(a3’)中，所述分离是采用物理方式和/或化学方式将冻结成固体的溶剂自混合体系中分离出来。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的物理方式包括骤冷分离、升华、溶解中的一种或几种方式的组合；

所述的化学方式包括化学反应、电解中的一种或几种方式的组合。

18.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：

(a4) 收集步骤(a3) 或步骤(a3’)制备得到的单晶或无定型物。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在步骤(a4)中，所述收集包括采用光学显微镜收集、扫描电子显微镜收集、双束电子显微镜收集、透射电子显微镜收集中的一种或几种的组合。

20.一种培养紫杉醇单晶的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-19任一项所述制备单晶的方法。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述培养紫杉醇单晶的方法还包括如下步骤：

(b1) 将上述制备的紫杉醇的单晶转移到紫杉醇的母液中进行培养；

(b2) 对步骤(b1)的单晶进行收集。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在步骤(b1)中，所述的转移是将步骤(a2)的含有紫杉醇的单晶和冻结态溶剂的混合体系转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养；或者所述的转移是将步骤(a3)的去除溶剂后的单晶直接转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养；或者是将步骤(a4)收集到的单晶转移到紫杉醇的母液中进行单晶培养。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的转移包括光学显微镜移取、扫描电子显微镜移取、双束电子显微镜移取、透射电子显微镜移取中的一种或几种的组合。

24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在步骤(b1)中，所述单晶的培养方法包括蒸发法、降温法、扩散法中的一种或几种的组合。

25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在步骤(b2)中，所述收集包括采用光学显微镜收集、扫描电子显微镜收集、双束电子显微镜收集、透射电子显微镜收集中的一种或几种的组合。