CN110592258A - 一种基于damd分子标记鉴定甜菜品种的方法 - Google Patents

一种基于damd分子标记鉴定甜菜品种的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法及应用，属于DAMD分子标记技术领域。为了解决传统的甜菜品种鉴定方法时间长的问题，本发明提供了一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，具体操作步骤如下：提取甜菜的基因组DNA；以提取的甜菜基因组DNA为模板，利用序列表所示引物，进行PCR扩增；将PCR扩增产物采用凝胶电泳进行分离；成像，根据电泳条带的差异对甜菜品种加以区分。本发明只需利用三条DAMD引物就可以鉴别出目前我国大面积种植的40个甜菜登记品种，涵盖范围广；并可以在甜菜的任何一个生长期进行品种的鉴定，且操作简单，时间短，从提取DNA到鉴别成功一般只需要2‑3天时间，大大缩短了鉴定时间。

Description

一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法
技术领域
本发明涉及DAMD分子标记技术领域，具体涉及一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法及应用。
背景技术
甜菜(学名：Beta vulgaris L.)是藜科，甜菜属二年生草本植物，根圆锥至纺锤状，多汁。茎直立，基生叶矩圆形，长叶柄，上面皱缩不平，下面有粗壮凸出的叶脉，全缘或略呈波状，叶柄粗壮，茎生叶互生，较小，花团集，花被裂片条形或狭矩圆形，胞果上部稍肉质。种子双凸镜形，红褐色，5-6月开花，7月结果。原产于欧洲西部和南部沿海，从瑞典移植到西班牙，中国主要分布在新疆、黑龙江、内蒙古等地。喜温作物，但耐寒性较强。甜菜在深而富含有机质的松软土壤上生长良好。
目前甜菜品种的鉴定方法采用形态学的方法，形态学鉴定需要将鉴定品种和真实品种播种在一起，在整个生育期对形态学性状进行观察、比对，该方法耗时比较长，而且需要非常专业的训练，需要整个生育期进行观察，一般需要5个月左右。
发明内容
针对传统的甜菜品种鉴定方法时间长的问题，本发明提供了一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法。具体操作步骤如下：
(1)提取甜菜的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的甜菜基因组DNA为模板，利用DAMD分子标记引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳进行分离；
(4)成像，根据电泳条带的差异对甜菜品种加以区分；
所述DAMD引物如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；
所述电泳条带的差异是指电泳后条带数量不同或条带数量相同时条带大小不同。
优选的，步骤(1)中所述甜菜的基因组DNA通过CTAB法提取获得。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为每5μL体系包括MIX 2.5μL、引物0.8μL、模板10ng，其余用灭菌的去离子水进行补充，所述MIX是dNTPs、Taqase和buffer的混合物。
优选的，在步骤(2)所述的PCR扩增程序：94℃预变性4min；然后94℃变性30s，65℃-56℃退火，每降低1℃两个循环，每个循环30s；72℃延伸30s；降落PCR结束后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；最后72℃延伸7min。
优选的，步骤(3)所述的凝胶电泳采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
优选的，步骤(3)所述的凝胶电泳条件为恒压180V，电泳110分钟。
优选的，步骤(4)所述成像具体操作如下：
①固定：电泳结束后，将胶置于固定液中，脱色摇床上摇动5min；
②漂洗：用去离子水清洗；
③显色：加入显色液，脱色摇床上摇动至肉眼看到清晰的DNA条带；
④冲洗：用清水对胶进行清洗；
⑤最后拍照。
优选的，所述的固定液由体积浓度为10％无水乙醇，体积浓度为0.5％的冰乙酸和质量浓度为0.2％AgNO3组成；所述的显色液由质量分数为1.5％的氢氧化钠和0.4％甲醛溶液组成。
有益效果
本发明只需利用三条DAMD引物就可以鉴别出目前我国大面积种植的40个甜菜登记品种，涵盖范围广；并可以在甜菜的任何一个生长期进行品种的鉴定，且操作简单，时间短，从提取DNA到鉴别成功一般只需要2-3天时间，大大缩短了鉴定时间。
附图说明
图1为采用引物URP6R对40个待测甜菜品种PCR扩增结果，M代表maker，1-40代表待鉴定的40个甜菜品种；
图2为采用引物URP17R对40个待测甜菜品种PCR扩增结果，M代表maker，1-40代表待鉴定的40个甜菜品种；
图3为采用引物URP1F对40个待测甜菜品种PCR扩增结果，M代表maker，1-40代表待鉴定的40个甜菜品种。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。MIX由北京百泰克生物技术有限公司够买；
以下实施例中待鉴定的甜菜品种编号及对应的品种名称如下表所示：
实施例1.基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法。
本实施例提供了一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，具体步骤如下：
1、甜菜基因组DNA的提取
每个样品取30mg甜菜干种子，去除表面污物后，将样品置于研钵中研磨成粉末；将粉末移入2mL离心管中，加入600μL CTAB提取液，65℃水浴40分钟；放入4℃冰箱片刻使其温度降至室温；加入300μL24:1的氯仿/异戊醇，上下混匀，12000r/min离心8分钟；将上清液吸出，加入预先加好300μL异丙醇的1.5mL离心管中，轻轻上下颠倒混匀；冰浴5分钟；11000r/min离心8分钟，弃掉上清液；放置在室温下至异丙醇挥发干净；加入100μL灭菌的TE溶解DNA，之后室温放置30分钟，自然降解RNA；-20℃保存备用。
2、PCR扩增
①扩增体系
总体积是5ul，其中包括MIX 2.5μL、引物URP6R(序列如序列表SEQ ID NO：1所示)0.8μL、模板10ng，其余用灭菌的去离子水进行补充。
②扩增程序
94℃预变性4min；然后94℃变性30s，65℃-56℃退火，1℃两个循环，每个循环30s；72℃延伸30s，共15个循环；最后72℃延伸7min。
3、电泳
利用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对产物进行分离，PCR结束后，每个产物中均加入3μLLoading Buffer(6X)，混匀后，在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶的每孔中加入预混样品1.5μL，缓冲液为0.5×TBE，恒压180V，电泳110分钟。
4、银染
①固定：电泳结束后，将胶置于100ml固定液中(10％无水乙醇，0.5％冰乙酸，0.2％AgNO3)，脱色摇床上缓慢摇动5min.
②漂洗：用100ml ddH2O清洗30s，倒掉后再清洗一次。
③显色：加入100ml显色液(1.5％氢氧化钠，0.4％甲醛)，脱色摇床上缓慢摇动至肉眼看到清晰的DNA条带。
④冲洗：用清水将胶清洗三次
⑤最后拍照。
实施例2.基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法。
重复实施例1，与实施例1的不同之处仅在于本实施例所用引物为URP17R，序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例3.基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法。
重复实施例1，与实施例1的不同之处仅在于本实施例所用引物为URP1F，序列如SEQ ID NO：3所示。
图1为通过引物URP6R对40个不同甜菜品种PCR扩增结果，从扩增条带可以看出40个样本PCR扩增条带或是条带数目不同或是扩增片段长度不同，不存在完全一致的扩增条带，因此可以对40个甜菜品种加以区分。
图2为通过引物URP17R对40个不同甜菜品种PCR扩增结果，从扩增条带可以看出40个样本PCR扩增条带或是条带数目不同或是扩增片段长度不同，不存在完全一致的扩增条带，因此可以对40个甜菜品种加以区分。
图3为通过引物URP1F对40个不同甜菜品种PCR扩增结果，从扩增条带可以看出40个样本PCR扩增条带或是条带数目不同或是扩增片段长度不同，不存在完全一致的扩增条带，因此可以对40个甜菜品种加以区分。
通过以上实施例所用的三条引物进行PCR扩增均可以对40个不同甜菜品种加以区分，可以对40个甜菜品种加以鉴定。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
核苷酸序列表
<110> 黑龙江大学
<120> 一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> URP17R
<400> 1
aatgtgggca agctggtggt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> URP1F
<400> 2
atccaaggtc cgagacaacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> URP6R
<400> 3
ggcaagctgg tgggaggtac 20

Claims (8)

1.一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)提取甜菜的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的甜菜基因组DNA为模板，利用DAMD分子标记引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳进行分离；
(4)成像，根据电泳条带的差异对甜菜品种加以区分；
所述DAMD引物如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；
所述电泳条带的差异是指电泳后条带数量不同或条带数量相同时条带大小不同。
2.根据权利要求1所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(1)所述甜菜的基因组DNA通过CTAB法提取获得。
3.根据权利要求1所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为每5μL体系包括MIX 2.5μL、引物0.8μL、模板10ng，其余用灭菌的去离子水进行补充，所述MIX是dNTPs、Taqase和buffer的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR，扩增程序如下：94℃预变性4min；然后94℃变性30s，65℃-56℃退火，每降低1℃两个循环，每个循环30s；72℃延伸30s；降落PCR结束后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；最后72℃延伸7min。
5.根据权利要求1所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(3)所述的凝胶电泳采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.根据权利要求5所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(3)所述的凝胶电泳条件为恒压180V，电泳110分钟。
7.根据权利要求1所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，步骤(4)所述成像具体操作如下：
①固定：电泳结束后，将胶置于固定液中，脱色摇床上摇动5min；
②漂洗：用去离子水清洗；
③显色：加入显色液，脱色摇床上摇动至肉眼看到清晰的DNA条带；
④冲洗：用清水对胶进行清洗；
⑤最后拍照。
8.根据权利要求7所述的一种基于DAMD分子标记鉴定甜菜品种的方法，其特征在于，所述的固定液由体积浓度为10％无水乙醇，体积浓度为0.5％的冰乙酸和质量浓度为0.2％AgNO3组成；所述的显色液由质量分数为1.5％的氢氧化钠和0.4％甲醛溶液组成。
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