CN110559305B - 唾液酸在制备电离辐射致肠道或dna损伤防护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种唾液酸在制备电离辐射致肠道或DNA损伤防护药物中的应用，并公开了药剂形式和给药方式。本发明所提供的以唾液酸为活性成分的电离辐射致肠道损伤防护药物具有毒副作用小、疗效显著、用药方便安全等优势，对于急性放射病患者、涉核从业人员、官兵、宇航员、放疗病人等不同人员均适用，在治疗前或执行任务、工作中均可用药。同时本发明提供了唾液酸作为DNA损伤修复蛋白DNA‑PKcs激活剂的新应用和处理浓度、处理方式，在生物医学领域具有广泛的潜在应用前景。

Description

唾液酸在制备电离辐射致肠道或DNA损伤防护药物中的应用

技术领域

本发明涉及放射性肠损伤治疗相关的药物领域，尤其涉及一种唾液酸在制备电离辐射致肠道或DNA损伤防护药物中的应用。

背景技术

由于小肠上皮细胞更新极快，因此小肠对电离辐射非常敏感，是电离辐射最为重要的靶器官，电离辐射导致的肠损伤是急性放射病患者早期死亡的重要原因之一。另外，恶性肿瘤患者是接触电离辐射的又一特殊人群，放射治疗是针对恶性肿瘤的重要治疗手段，据报道，70％以上的恶性肿瘤患者需要经过放射治疗，肠损伤是腹部和骨盆内肿瘤放射治疗常见的副作用，导致病人生存质量大大降低，甚至出现由于放射损伤非常严重而被迫终止治疗。由此可见，电离辐射致肠损伤防护药物开发，对于在核安全保障体系构建和肿瘤临床辅助治疗中至关重要。CN 104023560 A公开了用于预防胃肠道损伤和/或促进胃肠道愈合的人乳寡糖，但是电离辐射引起引起的小肠组织损伤与其他诱因造成的胃肠道损伤在发生发展机制上具有较大差异，目前没有治疗放射性肠损伤的有效手段或药物。

纯的唾液酸为N-乙酰神经氨酸(也称为燕窝酸)，在天然燕窝中占比10％左右，因此又被称为燕窝酸。唾液酸是人体必需的多糖，在介导细胞免疫反应、细胞代谢、细胞运动等多种生命活动中发挥重要的功能。唾液酸也是人乳低聚糖(HMO)结构的基本组分。美国FDA 和欧洲食品安全局批准唾液酸作为婴儿奶粉和普通食品的原料，2017年5月，我国卫健委也将唾液酸列入新食品原料目录。目前，唾液酸作为主要功能成分在医药、化妆品和食品营养强化领域多项产品中具有广泛的应用。

目前对于电离辐射致肠道损伤防护药物研究多处于临床前阶段，虽然部分药物有保护作用，但是存在显著缺点，主要包括：作用浓度高、活性偏低和存在明显的毒副作用，从而限制了临床应用，寻找无毒或低毒、高效的电离辐射致肠道损伤防护药物一直是医药界的追求热点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种唾液酸在制备电离辐射致肠道或DNA 损伤防护药物中的应用，在上述应用中，唾液酸的毒副作用小、疗效显著。

本发明的第一个目的是公开唾液酸在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。

进一步地，药物为水溶性药物，含有一种或多种药学上可接受的载体。

进一步地，药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

进一步地，药物经由灌胃或口服给药。

进一步地，药物的剂型为注射剂、悬浮剂、粉剂、片剂或颗粒剂。

进一步地，药物以磷酸盐缓冲液作为稀释剂载体。

进一步地，药物为注射剂，所述注射剂包括唾液酸和磷酸盐缓冲溶液。

进一步地，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，其中所述唾液酸在磷酸盐缓冲液中的质量浓度为5-10mg/mL。

进一步地，药物的给药剂量为50-100mg/kg/天，分别在电离辐射前1小时给药，电离辐射后一天、两天和三天再给药各一次。

进一步地，防护药物用于治疗电离辐射致小肠损伤。

进一步地，采用50-100μg/mL唾液酸处理小肠上皮细胞，在照射前2小时给药。

进一步地，电离辐射致肠损伤为α射线、β射线、γ射线或X射线辐射导致的肠损伤，或放射线物质辐射导致的肠损伤。

本发明的第二个目的是公开唾液酸在制备电离辐射诱发的DNA损伤防护药物中的应用。

进一步地，电离辐射为α射线、β射线、γ射线、X射线或放射性物质辐射。

本发明的第三个目的是公开唾液酸在制备DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs激酶激活剂中的应用。

进一步地，唾液酸的浓度为25-100μg/mL。

如无特殊说明，本发明的“唾液酸”指的是纯唾液酸。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明所提供的以唾液酸为活性成分的电离辐射致肠道损伤防护药物具有以下优点： (1)毒副作用小，100mg/kg体重浓度下处理小鼠无明显不良反应；(2)疗效显著，照射前1小时、照射后1天、2天和3天以50mg/kg体重浓度的剂量各给药一次，能够显著调高 10Gy射线照射后小鼠存活时间；保护接受电离辐射小鼠肠道绒毛结构完整，促进小鼠肠道隐窝细胞增殖；(3)细胞结果显示，100μg/mL浓度的唾液酸能调控电离辐射诱发的DNA 损伤，并且促进DNA损伤修复蛋白激活；(4)体外结果显示25-100μg/mL唾液酸显著促进DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs激酶活性；(5)主要给药途径为口服，用药方便、安全，对于急性放射病患者、涉核从业人员、官兵、宇航员、放疗病人等不同人员均适用，在治疗前或执行任务、工作中均可用药。上述性能均显示出唾液酸在防护电离辐射致肠损伤中的独特之处，在我国医学领域具有广阔的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明采用10Gy X射线照射小鼠后，照射对照组和照射同时唾液酸给药组小鼠存活曲线对比图；

图2为本发明唾液酸保护10Gy X射线照射后小鼠肠道绒毛和隐窝结构示意图；

图3为本发明唾液酸维持10Gy X射线照射后小鼠肠道隐窝增殖示意图；

图4为本发明唾液酸体外抑制2Gy X射线照射后人小肠上皮细胞(HIEC)DNA损伤情况测试结果；

图5为本发明唾液酸体外促进4Gy X射线照射后人小肠上皮细胞中DNA损伤修复蛋白 DNA-PKcs自磷酸化以及其靶蛋白Chk2磷酸化的免疫印迹测试结果；

图6为本发明利用Promega公司的DNA-PKcs体外检测系统，体外检测唾液酸对DNA-PKcs的激活作用的测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

首先建立辐射(X射线)致肠道损伤小鼠模型，选用6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半(体重25±2g)，随机分两组：照射组(10Gy)15只和照射联合唾液酸给药组(10Gy+唾液酸)15只；用X射线照射机对小鼠进行全身单次均匀照射，小鼠吸收剂量为10Gy。将唾液酸溶解于0.01M磷酸盐水溶液，得到混合液，其中混合液中唾液酸的浓度为5mg/mL，照射前照射联合唾液酸给药组小鼠灌胃给药(剂量：50mg/kg)1小时后进行照射，照射组小鼠给予同等体积、质量浓度的磷酸盐水溶液。照射后一天、两天和三天分别对照射联合唾液酸给药组小鼠灌胃给药(剂量：50mg/kg)，对照组小鼠继续给予同等体积、质量浓度的磷酸盐水溶液。考察唾液酸对照射小鼠一般情况和体征指标的影响，照射组小鼠在照射后1天即出现活动度显著下降，饮食量显著降低，而照射联合唾液酸给药组在照射后小鼠活动度显著优于照射对照组。对小鼠存活天数进行分析，如附图1所示，图中辐射指的是照射组，辐射 +唾液酸指的是照射联合唾液酸给药组，结果表明，唾液酸给药可有效延长照射高剂量(10 Gy)X射线照射后小鼠存活时间。因此，唾液酸可以改善受照小鼠的体征、延长受照小鼠存活时间。

实施例二

(1)首先建立X射线致小鼠肠道损伤模型。选用6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半(体重25±2g)，随机分四组：未经照射处理、正常饲养的对照组6只、单纯唾液酸处理组6只、照射组6只、照射前和照射后(三次)唾液酸处理组6只。用X射线机对小鼠进行全身单次均匀照射，小鼠吸收剂量为10Gy。唾液酸溶解于0.01M磷酸盐水溶液，其中唾液酸的浓度为5mg/mL，照射前唾液酸处理组小鼠灌胃给药(剂量：50mg/kg)1小时后进行照射，照射组小鼠给予同等体积、质量浓度的磷酸盐水溶液。照射后一天、两天和三天分别对唾液酸处理组小鼠灌胃给药(剂量：50mg/kg)，对照组小鼠继续给予同等体积、质量浓度的磷酸盐水溶液。

照射后3.5天处死小鼠，取小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后进行HE染色。如附图2所示，电离辐射明显导致小鼠小肠绒毛断裂、脱落(图2A3)；照射唾液酸给药(照射+唾液酸)明显改善受照射后小鼠肠道结构，绒毛脱落减少(图2A4)，肠道结构与对照组(图 2A1)类似，绒毛整齐、完整。

对绒毛长度进行定量分析，如附图2(B)所示，发现唾液酸可显著维持接受电离辐射小鼠小肠绒毛长度。

(2)按照(1)中所述处理方式收集小鼠肠道组织，切片后用抗Ki-67抗体进行免疫组化染色，Ki-67是细胞增殖的标志分子之一。从附图3中，我们发现正常饲养的对照组小鼠肠道隐窝呈Ki-67阳性(图3A1)，表明隐窝细胞具有持续增殖能力，如附图3(B)和图 3A3所示，单纯接受照射后3.5天的照射组小鼠肠道Ki-67阳性隐窝数显著降低。照射前后唾液酸给药组(照射+唾液酸)小鼠肠道隐窝Ki-67阳性率和平均每个隐窝Ki-67阳性细胞数得到大幅度恢复(图3A4)。

综上所述，唾液酸保护受电离辐射后小鼠肠道结构、功能。

实施例三

选用目前体外研究肠损伤较为公认的人肠道上皮细胞HIEC为模型。将唾液酸溶解于磷酸盐缓冲液中，母液浓度为20mg/mL，采用逐级稀释的方法配制使用浓度分别为50、100μg/mL的唾液酸溶液，稀释液为培养细胞用的DMEM培养液。对照组用等体积于100μg/mL 唾液酸溶液的磷酸盐缓冲液。HIEC细胞接种于6孔板，在细胞处于对数生长期时分别加入上述不同浓度燕窝酸溶液和磷酸盐缓冲液对照，处理2小时后将细胞进行2Gy X射线照射，照射后0、1、4和12小时将细胞用4％多聚甲醛固定，将固定的细胞用针对γH2AX的抗体进行免疫荧光染色。结果如附图4所示，电离辐射可显著诱发蛋白聚焦点形成，50和100 μg/mL唾液酸可显著降低电离辐射诱发的蛋白聚焦点，磷酸盐缓冲液并不具备这种功能。

实施例四

选用目前体外研究肠损伤较为公认的人肠道上皮细胞HIEC为模型。将唾液酸溶解于磷酸盐缓冲液中，母液浓度为20mg/mL，采用逐级稀释的方法配制使用浓度为100μg/mL的唾液酸溶液，稀释液为培养细胞用的DMEM培养液。对照组用等体积的磷酸盐缓冲液。HIEC细胞接种于100mm²的平皿中，在细胞处于对数生长期时分别加入上述不同浓度燕窝酸溶液和磷酸盐缓冲液对照，处理2小时后将细胞进行4Gy X射线照射，照射后0、1、4、12和 24小时收集细胞，提取蛋白，定量后进行电泳，免疫印迹分析DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs 自磷酸化水平和蛋白质水平，结果如附图5所示，唾液酸可激活DNA-PKcs自磷酸化，同时唾液酸能够促进DNA-PKcs的下游分子Chk2磷酸化，表明唾液酸可通过促进DNA损伤修复保护肠道细胞。

实施例五

Promega公司具有一款体外检测DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs激活活性的试剂盒(DNA-PK Kinase Enzyme System和ADP-Glo^TM Kinase Assay)，我们利用此系统分析唾液酸对DNA-PKcs活性的影响。将唾液酸溶解于磷酸盐缓冲液中，母液浓度为50mg/mL，将唾液酸加入到DNA-PKcs激酶检测体系中，使其终浓度分别为25、50和100μg/mL。结果如附图6所示，结果表明，唾液酸可在体外激活DNA-PKcs磷酸化活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发。

Claims (9)

1.唾液酸在制备电离辐射致肠损伤防护药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为水溶性药物，含有一种或多种药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物经由口服给药。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为注射剂、悬浮剂、粉剂、片剂或颗粒剂。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂，所述注射剂包括唾液酸和磷酸盐水溶液。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的给药剂量为50-100 mg/kg/天，分别在电离辐射前1小时给药，电离辐射后一天、两天和三天再给药各一次。

8.唾液酸在制备电离辐射诱发的肠道DNA损伤防护药物中的应用。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：电离辐射为α射线、β射线、γ射线或X射线。

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