CN102151255A - 白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种来源广阔、安全有效、经济适用的多酚类化合物白藜芦醇在防治辐射诱导骨髓抑制中的应用。结果表明白藜芦醇对辐射诱导的骨髓细胞损伤，包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良、再生障碍性贫血，功能下降具有明显的保护作用，白藜芦醇可以大剂量使用没有明显的毒副作用。

Description

白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，涉及一种已知的多酚类化合物在骨髓抑制药物中的应用。更具体的说是白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。

背景技术

机体暴露于外界物理化学及体内代谢产生的各种有害因素，如暴露于辐射或某些化学毒物，以及临床接受放疗、化疗患者，造血系统由少量骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）及不同发育时期不同系列的造血细胞组成，对各种有害因素非常敏感，受到损伤后会出现不同程度的抑制，表现为外周血白细胞降低、骨髓增殖功能下降甚至发生再生障碍性贫血，对患者的生存质量造成严重的危害甚至危及生命。

目前临床上对出现骨髓抑制多是采用加强营养或给与各种生长因子增加造血细胞的增殖，另外一些具有抗氧化损伤作用的化合物或中药制剂。药物种类很多，多是联合应用，单独评价时疗效不很确定，还会有各种副作用的产生，如生长因子类，也比较昂贵。

白藜芦醇(Resveratrol, Res)是一种非黄酮多酚类化合物，化学名为3,5,4’-三羟基反-二苯代乙烯(3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbene)，分子量228.24，分子式为C₁₄H₁₂O₃；

主要来源于蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum）的根茎提取物，还广泛存在于葡萄、花生等植物中。Res是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通；可预防癌症的发生及发展，防治动脉粥样硬化、冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的作用；对神经性障碍疾病也具有治疗或改善预后的作用；对多种生物具有延长寿命的作用。其保护作用机制主要是抑制NADPH氧化酶活性以减少细胞内源性ROS的生产，增强过氧化氢酶活性以清除细胞内自由基，此外Res的3个酚羟基具有极强的清除ROS的能力。近期研究还表明，Res是Sirt1强有力的激动剂。Sirt1是一种NAD依赖性的去乙酰化酶，可以通过去乙酰化作用抑制P53活性起到抗凋亡，抗细胞周期阻滞；通过去乙酰化FOXO能够促进DNA损伤修复及抗氧化损伤，抗衰老的作用。但有关Res对电离辐射诱导造血系统损伤具有防护作用的研究，未见文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是寻找能够防治骨髓抑制的药物，其能够保护各种因素诱导的骨髓细胞和功能的损伤药物。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

本发明的第一个目的是提供白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供了白藜芦醇在制备防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用；其中的药物为白藜芦醇或白藜芦醇与其他营养物质、促进骨髓造血细胞增殖的药物或抗辐射药物合用。

本发明所述的骨髓抑制包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良、再生障碍性贫血。

本发明所述的辐射诱导骨髓抑制，包括接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

本发明所述的化学毒物诱导骨髓抑制，包括接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学物接触的工作人员及意外暴露的人员。

本发明所述的药物包括临床各种剂型的治疗药物、预防药物或保健食品。

本发明所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、预乳剂、微乳剂、混悬剂、糖浆剂、肠溶制剂或注射剂。

本发明所述的白藜芦醇由市场采购（西安冠宇生物技术有限公司，批号:Re100307）。

本发明所述的接受放射治疗的肿瘤患者，如接受放疗的鼻咽癌、食道癌、早期口腔癌患者；本发明所述的辐射暴露的工作人员，如医院X射线、CT工作人员，铀矿的采矿工人；本发明所述的意外辐射性同位素暴露的人员，如前苏联切尔诺贝利核电站事故中意外遭受辐射的人员。

本发明所研究的内容包括以下几个方面：

1．Res对辐射导致的骨髓细胞损伤具有保护作用。

2．Res对骨髓细胞没有明显的细胞毒性。

3．Res对辐射所引起骨髓功能抑制具有保护作用。

本发明公开的白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用的优点是：

1、Res是常用的具有抗衰老、抗氧化作用的多酚化合物，来源广泛。

2、Res短期、低浓度作用即具有显著的造血系统辐射损伤防护作用。

3、Res可以大剂量使用没有明显的毒副作用。

本发明使用标准和常规的技术，将Res或多个与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成各种制剂。这些制剂形式包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。所述的药学上可接受的固体或液体载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂（如乳糖、聚乙二醇），粘合剂（淀粉、微晶纤维素），崩解剂（如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素），润滑剂（如滑石粉、硬脂酸镁），湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂（EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺）等等。其中固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、干淀粉、聚山梨酯-80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

本发明所述药物制剂的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，所用（活性成分的有效部位）的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性成分的有效部位的量范围为组合物的0.5％～90％（重量）。另一优选的范围为0.5%-70%。

具体实施方式

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明动物模型构建方法及作为模型进行机制做进一步的说明。

实施例1

（1）骨髓单个核细胞分离

无菌取C57BL/6小鼠（中国医学科学院实验动物研究所）股骨，含2％胎牛血清的Hanks液冲洗骨髓，密度梯度离心法分离，制备骨髓单个核细胞悬液，PBS洗涤，计数后调整所需的细胞浓度后待用。

（2）细胞活力测定

向96孔板中设定孔加入100μl的单个核细胞悬液，按设计加入处理药物100μl，置入37oC二氧化碳孵箱中，培养18h。取出培养板，放置室温，加入生物发光试剂cell-titer 20μl，振荡混匀后，转入黑色测定板，GloMax^TM发光检测仪采用Promega自带检测程序Cell-titer Protocol进行检测。检测结果自动生成Excel数据。

（3）集落形成（克隆）能力测定

分装甲基纤维素培养基（M3534），每管2ml，-20oC保存。用前置于2－8oC冰箱内或室温下解冻；分离小鼠骨髓细胞，台盼蓝染色要求存活细胞数大于95%，计数细胞调整细胞浓度加入M3534，振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16^＃平头注射器针头，加入24孔板放入湿盒，置入37oC，5％CO₂ 培养箱中培养7天。

从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落，集落形成率以每10⁵个细胞形成的集落数表示。

（4）竞争移植实验

准备C57BL/6 45.1小鼠（中国医学科学院实验动物研究所），C57BL/6 45. 2小鼠（北京维通利华公司）和C57BL/6 45. 1/2杂合小鼠（本单位）。C57BL/6 45.2小鼠作为受体，4.5Gy剂量的¹³⁷Cs源γ射线照射2次后备用；冲洗杂合小鼠骨髓单个核细胞，用无血清1640培养基调整浓度作为竞争细胞备用；冲洗C57BL/6 45.1小鼠骨髓单个核细胞，用Res孵育并接受γ射线照射后作为供体细胞备用；供体细胞和竞争细胞按1：1比例混合后从外眦静脉窦注射入受体小鼠，每只小鼠注射2×10⁶个细胞；注射细胞8w后检测受体小鼠外周血、骨髓单个核细胞淋系和粒系的分型，以分析药物对供体细胞中造血干细胞的保护作用。

（5）Res体内应用对照射导致小鼠造血系统损伤的防护作用

C57BL/6小鼠（北京维通利华公司）分为对照组、照射组、给药组，每组10只。照射组、给药组小鼠接受¹³⁷Cs源γ射线全身照射，剂量6.0Gy。给药组小鼠照射前7天至照射后28天连续灌胃给Res，剂量为20mg/kg。照射后第29日取外周血检测血常规，取单侧股骨冲洗骨髓单个核细胞计数，评估造血系统功能。

实施例2

实验结果与讨论

（1）对造血细胞免疫细胞毒性

分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2×10⁶/ml。不同浓度的Res培养基进行配制。取细胞悬液100μl及不同浓度处理药物加入96孔培养板，孵育18小时后，生物发光法进行细胞活力测定。结果发现利用RPMI-1640培养基(来源？其中的成分？有市售？)进行实验，Res在浓度低于10^-4M时均未发现明显的细胞毒性作用。结果见表1、表2。.

(2)对造血免疫细胞体外辐射损伤的保护作用

分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度的药物后，孵育30min，进行照射。照射后继续孵育18h，进行细胞活力测定。结果发现：1Gy剂量照射组的细胞活力较对照组下降36.2% (p<0.05)， Res未见防护作用；4Gy剂量照射组的细胞活力较对照组下降70.3% (p<0.05)，Res组提高33.32%（1×10^-8M，p<0.05）。

表 3  Res对受照射骨髓细胞活力的影响（RLU ×1000）

实验结果表明，照射后骨髓细胞活力1、4Gy分别下降36.2％、70.3％，提示照射可以导致造血系统中骨髓单个核细胞功能活力下降。与照射组比较，Res对骨髓单个核细胞活力有一定的保护作用；有效保护浓度在10^-6-10^-8M，是细胞毒性剂量10^-4M的1/100-1/10000，提示Res在用于药物或保健品时具有良好的安全性。

（3）集落形成率

分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度的药物后，孵育30min，进行照射，照射后接种，进行CFU-GM测定。1Gy剂量照射组的CFU-GM克隆数较对照组下降35.7%（p<0.05），Res（1×10^-8M）组较照射组CFU-GM克隆数提高了24.1%，差异具有统计学意义（p<0.05）；4Gy剂量照射组的CFU-GM克隆数较对照组下降87.3%（p<0.05），Res（1×10^-6M）组，较照射组CFU-GM克隆数提高了88.2%，差异具有统计学意义（p<0.05）。

表 5  Res对照射小鼠骨髓CFU-GM的影响（/5×10⁵）

结果发现，不同照射剂量对小鼠CFU-GM具有明显的抑制作用，提示照射可以抑制造血系统中造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell, HPC）的功能，而Res对1、4Gy照射对HPC的功能抑制具有明显的保护作用。

(4)竞争移植实验

C57BL/6 45. 2小鼠9Gy剂量的¹³⁷Cs源γ射线全身照射后作为受体；冲洗杂合小鼠骨髓单个核细胞作为竞争细胞备用，冲洗C57BL/6 45.1小鼠骨髓单个核细胞用药物孵育并接受γ射线照射后作为供体细胞，供体细胞和竞争细胞按1：1比例混合后从外眦静脉窦注射入受体小鼠；8w后进行检测。根据竞争移植实验结果计算供体细胞再殖能力（Repopulating units of donors, RU_D），结果表明照射可以降低供体细胞的再殖能力，提示可以抑制造血系统中HSC的功能。在外周血、骨髓单个核细胞淋系中Res（1×10^-6M）组的RU_D高于照射组43.8%和34.6%。结果提示Res对照射导致的造血系统中HSC的功能损伤有保护作用。

表 6  Res对竞争移植实验供体细胞再殖能力的影响（%）

	Blood	淋系	粒系
				Control	100	100	100
IR	40.79	32.71	27.13
				Res	58.64	44.02	13.94

(5)体内实验

C57BL/6小鼠（北京维通利华公司），全身照射前7天至照射后28天连续灌胃给Res，设置对照组和照射组，照射后29日取外周血检测血常规，取单侧股骨冲洗骨髓单个核细胞(BMMNC)计数，评估造血系统功能。如表7，小鼠照射后，照射组WBC、RBC、BMMNC分别较对照组降低76.2%、11.3%、79.4%（p<0.05），表明辐射可以诱导小鼠造血功能损伤，外周血红细胞和白细胞计数均显著降低，骨髓单个核细胞降低提示外周血细胞生成还将进一步降低；Res用药组WBC、RBC、BMMNC分别较照射组高117.3%、9.5%、56.0%（p<0.05），表明Res干预的照射小鼠造血功能有所恢复，表现在外周血红细胞和白细胞计数相比照射组有所恢复，骨髓单个核细胞计数升高提示外周血细胞计数将进一步恢复。

表 7  Res对全身照射小鼠外周血和骨髓单个核细胞影响

我们进行了细胞毒性实验、骨髓单个核细胞活力实验、集落形成实验、竞争移植实验和体内实验，体外和体内实验结果发现，Res对辐射诱导的造血系统功能损伤具有一定的保护作用，保护作用体现在外周血、骨髓单个核细胞、HPC和HSC四个层次，提示预防性给药可防治辐射诱导骨髓的损伤；实验结果还表明Res毒副作用低，可以作为临床用药或保健用品为放疗病人和职业接触辐射人员提供保护。

实施例3

活性成分Res 320mg ，干淀粉200mg ，硬脂酸镁10mg ，将上述成分混合后，以460mg填充入硬明胶胶囊中。

实施例4

活性成分Res 10mg， 淀粉45 mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg ，硬脂酸镁0.5mg ，滑石粉1 mg 。将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2－3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整理，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。

实施例5

注射液的制备

活性成分Res 200mg，丙二醇100mg，聚山梨300ml。取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入药用碱调节PH值至4－8使其溶解。加入活性炭，搅拌吸附30分钟，除炭、精滤、灌封、灭菌。

实施例6

活性成分Res 100mg，药用碱1-7%，甘露醇55－85%。取活性成分加入注射用水，用药用碱调节PH值至4-8使其溶解。再加入甘露醇，按注射剂的要求进行高压灭菌，加入活性炭，采用微孔滤膜过滤，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得疏松块状物，封口即得。

Claims (7)

1.白藜芦醇在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。

2.白藜芦醇在制备防治辐射、化学毒物诱导骨髓抑制药物中的应用；其中的药物为白藜芦醇。

3.权利要求1或2所述的应用，其中所述的骨髓抑制包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良、再生障碍性贫血。

4.权利要求2所述的应用，其中所述的辐射诱导骨髓抑制，包括接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

5.权利要求2所述的应用，其中所述的化学毒物诱导骨髓抑制，包括接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学物接触的工作人员及意外暴露的人员。

6.权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的药物包括临床各种剂型的治疗药物、预防药物或保健食品。

7.权利要求1或2所述的应用，其中所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、预乳剂、微乳剂、混悬剂、糖浆剂、肠溶剂或注射剂。