CN105560218A - 白藜芦醇同系物预防和治疗骨髓抑制的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了如式I所示的白藜芦醇同系物ISO在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。结果表明ISO对辐射诱导的骨髓细胞损伤、功能下降具有明显的保护作用。

Description

白藜芦醇同系物预防和治疗骨髓抑制的用途

技术领域

本发明涉及ISO的新医药用途，其具体为ISO在制备防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。

背景技术

机体暴露于外界物理化学及体内代谢产生的各种有害因素，如暴露于辐射或某些化学毒物，以及临床接受放疗、化疗患者，造血系统由少量骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)及不同发育时期不同系列的造血细胞组成，对各种有害因素非常敏感，受到损伤后会出现不同程度的抑制，表现为外周血白细胞降低、骨髓增殖功能下降甚至发生再生障碍性贫血，对患者的生存质量造成严重危害甚至危及生命。

目前临床上治疗骨髓抑制多是采用加强营养或给与各种生长因子增加造血细胞增殖，另外给与一些具有抗氧化损伤作用的化合物或中药制剂。药物种类很多，多是联合应用，单独评价时疗效不很确定，还会有各种副作用产生，如生长因子类，也比较昂贵。

白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种广泛存在于葡萄、花生等植物中的多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素。

研究表明Res对多种疾病具有治疗或改善预后的作用，包括心血管疾病，神经性障碍疾病等，对多种生物具有延长寿命的作用。其保护作用机制主要是抑制NADPH氧化酶活性以减少细胞内源性ROS产生，增强过氧化氢酶活性以清除细胞内自由基，此外Res的3个酚羟基具有极强的清除ROS的能力。

研究表明，Res是Sirt1强有力的激动剂。Sirt1是一种NAD⁺依赖性的去乙酰化酶，通过去乙酰化抑制p53活性起到抗凋亡、抗细胞周期阻滞作用；通过去乙酰化FOXO，起到促进DNA损伤修复及抗氧化损伤，抗衰老作用。

异丹叶大黄素(Isorhapotigenin，ISO)与Res结构相似，比Res多一个甲氧基，ISO广泛存在于葡萄、花生等中草药中。研究表明异丹叶大黄素具有抗炎、抗氧化等作用，是多种中药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病等的有效成分，还未见对造血系统防护作用的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种防治骨髓抑制的药物，保护各种因素诱导的骨髓细胞和功能损伤。

为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了如式I所示化合物ISO在制备预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物中的应用

所述的骨髓抑制是由辐射和\或化学毒物诱导。

所述的骨髓抑制包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良、再生障碍性贫血。

所述的由辐射诱导的骨髓抑制疾病是选自如下人员患有的疾病：接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

所述的由化学毒物诱导的骨髓抑制疾病是选自如下人员患有的疾病：接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学物接触的工作人员及意外暴露的人员。

本发明通过药理实验证明：

1、ISO对辐射导致的骨髓细胞损伤具有保护作用。

2、ISO对骨髓细胞没有明显细胞毒性。

3、ISO对辐射引起骨髓功能抑制具有保护作用。

本发明第二方面涉及一种预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物组合物，含有有效剂量的如式I所示化合物ISO和药学上可接受的载体

本发明的药物组合物以本发明化合物作为活性成份，还可以含有其他有效成分。所述的其他有效成分选自其他营养物质、促进骨髓造血细胞增殖的药物、抗辐射药物。

本发明的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

1、ISO短期、低浓度作用即具有显著的造血系统辐射损伤防护作用。

2、ISO可以大剂量使用没有明显毒副作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

1、骨髓单个核细胞分离

无菌取C57BL/6小鼠股骨，含2％FCS的Hanks液冲洗骨髓，密度梯度离心法分离，制备骨髓单个核细胞悬液，PBS洗涤，计数后调整所需的细胞浓度后待用。

2、细胞活力测定

向96孔板中设定孔加入100μl的单个核细胞悬液，按设计加入处理药物100μl，置入37℃二氧化碳孵箱中，培养6h或者18h。取出培养板，放置室温，加入生物发光试剂cell-titer20μl，振荡混匀后，转入黑色测定板，GloMax^TM发光检测仪采用Promega自带检测程序Cell-titerProtocol进行检测。检测结果自动生成Excel数据。

3、集落形成(克隆)能力测定

分装甲基纤维素培养基(M3534)，每管2ml，-20℃保存。用前置于2-8℃冰箱内或室温下解冻；分离小鼠骨髓细胞，台盼蓝染色要求存活细胞数大于95％，计数细胞，调整细胞浓度加入M3534，振荡器充分混匀，静置待气泡消失，用3ml注射器连接16^#平头注射器针头，加入24孔板放入湿盒，置入37℃，5％CO₂培养箱中培养7天。

从培养第5天开始在倒置显微镜下进行观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落，集落形成率以每10⁵个细胞形成的集落数表示。

4、竞争移植实验

准备C57BL/645.1小鼠，C57BL/645.2小鼠和C57BL/645.1/2杂合小鼠。C57BL/645.2小鼠作为受体，4.5Gy剂量的¹³⁷Cs源γ射线照射2次后备用；冲洗杂合小鼠骨髓单个核细胞，用无血清1640培养基调整浓度作为竞争细胞备用；冲洗C57BL/645.1小鼠骨髓单个核细胞，用药物孵育并接受γ射线照射后作为供体细胞备用；供体细胞和竞争细胞按1:1比例混合后从外眦静脉窦注射入受体小鼠，每只小鼠注射2×10⁶个细胞；注射细胞8w后检测受体小鼠外周血、骨髓单个核细胞淋系和粒系的分型，以分析药物对供体细胞中造血干细胞的保护作用。

结果与讨论

(1)对造血细胞免疫细胞毒性

分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2×10⁶个/ml。不同浓度的ISO分别由RPMI-1640培养基进行配制。取细胞悬液100μl及不同浓度处理药物加入96孔培养板，孵育18h后，生物发光法进行细胞活力测定。结果发现利用RPMI-1640培养基进行实验，ISO在浓度低于10^-4M时未发现明显的细胞毒性作用。结果见表1、表2。

表1ISO对骨髓细胞活力的影响(RLU×1000)

表2ISO对骨髓细胞活力的影响(％)

(2)对造血免疫细胞体外辐射损伤的保护作用

分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度的药物后，孵育30min，进行照射。照射后继续孵育18h，进行细胞活力测定。结果发现：1Gy剂量照射组细胞活力较对照组下降16.7％(p<0.05)，ISO未见防护作用；4Gy剂量照射组的细胞活力较对照组下降51.6％(p<0.05)，ISO组提高28.8％(1×10^-7M，p<0.05)，结果见表3、表4。

表3ISO对受照射骨髓细胞活力的影响(RLU×1000)

表4ISO对受照射骨髓细胞活力的影响(％)

实验结果表明，照射后骨髓细胞活力1、4Gy分别下降16.7％、51.6％，提示照射可以导致造血系统中骨髓单个核细胞功能活力下降。与放射对照组比较，ISO对骨髓单个核细胞活力有一定的保护作用；有效保护浓度在10^-6-10^-8M，是细胞毒性剂量10^-4M的1/100-1/10000，提示ISO在用于药物或保健品时具有良好的安全性。

(3)集落形成率

分离骨髓单个核细胞，加入不同浓度药物后，孵育30min，进行照射，照射后接种，进行CFU-GM测定。1Gy剂量照射组的CFU-GM克隆数较对照组下降35.7％(p<0.05)，ISO(1×10^-6M)组较照射组CFU-GM克隆数提高了31.4％，差异具有统计学意义(p<0.05)；4Gy剂量照射组的CFU-GM克隆数较对照组下降87.3％(p<0.05)，ISO(1×10^-7M)组较照射组CFU-GM克隆数提高了26.5％，差异具有统计学意义(p<0.05)。结果见表5。

表5ISO对照射小鼠骨髓CFU-GM的影响(/5×10⁵)

结果发现，不同照射剂量对小鼠CFU-GM具有明显的抑制作用，提示照射可以抑制造血系统中造血祖细胞(hematopoieticprogenitorcell，HPC)的功能，而ISO对1、4Gy照射对HPC的功能抑制具有明显的保护作用。

(4)竞争移植实验

C57BL/645.2小鼠9Gy剂量的¹³⁷Cs源γ射线照射后作为受体；冲洗杂合小鼠骨髓单个核细胞作为竞争细胞备用，冲洗C57BL/645.1小鼠骨髓单个核细胞用药物孵育并接受γ射线照射后作为供体细胞，供体细胞和竞争细胞按1:1比例混合后从外眦静脉窦注射入受体小鼠；8w后进行检测。根据竞争移植实验结果计算供体细胞再殖能力(Repopulatingunitsofdonors，RU_D)，结果表明照射可以降低供体细胞的再殖能力，提示可以抑制造血系统中HSC的功能。结果见表6。

表6ISO对竞争移植实验供体细胞再殖能力的影响(％)

根据细胞毒性实验、骨髓单个核细胞活力实验、集落形成实验和竞争移植实验，实验结果发现，ISO对辐射诱导的造血系统功能损伤具有一定的保护作用，保护作用体现在骨髓单个核细胞、HPC和HSC三个层次，提示预防性给药可防治辐射诱导骨髓的损伤；实验结果还表明ISO毒副作用低，可以作为临床用药或保健品为放疗病人和职业接触辐射人员提供保护。

Claims (8)

1.如式I所示化合物ISO制备预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物中的应用

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨髓抑制是由辐射和\或化学毒物诱导。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨髓抑制包括外周血白细胞下降、骨髓增生不良、再生障碍性贫血。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的由辐射诱导的骨髓抑制疾病是选自如下人员患有的疾病：接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的由化学毒物诱导的骨髓抑制疾病是选自如下人员患有的疾病：接受化学治疗的肿瘤患者、抑制骨髓的化学物接触的工作人员及意外暴露的人员。

6.一种预防和\或治疗骨髓抑制疾病的药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的如式I所示化合物ISO和药学上可接受的载体

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，还含有其他有效成分。

8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于，所述的其他有效成分选自其他营养物质、促进骨髓造血细胞增殖的药物、抗辐射药物。