CN111096963A - Amurensin H衍生物EAPP在治疗和预防再生障碍性贫血中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如式(Ⅰ)所示的Amurensin H衍生物EAPP在制备治疗和/或预防再生障碍性贫血产品中的应用。本发明所述的Amurensin H衍生物EAPP制备方法简单，具有明显的抗炎活性，对再生障碍性贫血具有显著的治疗作用，可以单体或药用组合物的形式应用于再生障碍性贫血的临床治疗中，对再生障碍性贫血以及免疫相关疾病的治疗具有潜在的应用价值。

Description

Amurensin H衍生物EAPP在治疗和预防再生障碍性贫血中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种Amurensin H衍生物EAPP或其药学上可接受的盐，及含有该衍生物或其医学上可接受的盐的药用组合物，在预防和/或治疗再生障碍性贫血中的应用。

背景技术

再生障碍性贫血(简称再障，aplastic anemia，AA)是一种较为严重的血液系统疾病，由化学、物理、生物因素或其它不明原因所致，以骨髓造血功能衰竭致全血细胞减少为特征，临床主要表现为贫血、出血和感染，可危及生命。其发病原因与发病机制十分复杂，目前认为与造血干/祖细胞缺陷、骨髓造血微环境异常和免疫失调介导的骨髓造血抑制有关。其中免疫功能失调在再障发病过程中的关键作用已经取得了比较广泛的共识。异基因造血干细胞移植是目前唯一能够治愈再障的治疗方案，但由于移植配型难，大部分患者只能采取药物进行免疫抑制治疗。然而，免疫抑制剂对免疫系统的整体抑制会给患者带来严重的不良反应，且价格昂贵、复发率高，治疗效果不尽人意。因此寻找更为有效的治疗途径和药物是再障治疗的迫切需求。

Amurensin H(7,8-脱氢葡萄藤戊素)是从民间药用植物山葡萄(Vitisamurensis)根中分离得到白藜芦醇二聚体，具有良好的体内外抗炎活性与较低的毒性。本发明科研人员以Amurensin H为先导化合物，经一系列结构改造与优化，得到了一种具有显著抗再生障碍性贫血作用的Amurensin H衍生物EAPP，其结构如式(Ⅰ)所示。且该化合物在治疗和/或预防再生障碍性贫的应用目前尚未见相关报道。本专利涉及该化合物在治疗和/或预防再生障碍性贫血中的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种Amurensin H衍生物EAPP或其药物组合物在制备用于预防、治疗或辅助治疗再生障碍性贫血的药物和/或保健品中的应用。

本发明的目的之一在于提供一种如式(I)所示的Amurensin H衍生物EAPP及其药效学上可接受的盐，在制备用于预防、治疗或辅助治疗再生障碍性贫血的药物和/或保健品中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物，其中包括至少一个如式(I)所示的Amurensin H衍生物EAPP及其药学上可接受的盐，在制备用于预防、治疗或辅助治疗再生障碍性贫血的药物和/或保健品中的应用。

本发明的第三方面是提供第一方面所述衍生物的制备方法。

为实现本发明上述目的，本发明以Amurensin H为先导化合物，通过结构修饰方法合成了一种Amurensin H衍生物EAPP，并研究了该类化合物在治疗再生障碍性贫血方面的应用。

具体而言，本发明涉及一种如式(Ⅰ)所示的Amurensin H衍生物EAPP及其药效学上可接受的盐，在制备治疗和/或预防再生障碍性贫血产品中的应用。

为了完成本发明的目的，本发明涉及该Amurensin H衍生物EAPP及其药效学可接受的盐，及其药物组合物在再生障碍性贫血和其它免疫相关疾病中的应用。

再生障碍性贫血是一种血液科常见疾病。以钴-60γ射线+胸腺脾免疫细胞接种制备小鼠再生障碍性贫血模型，该EAPP在5，10，20mg/kg剂量下灌胃给药。结果显示，本发明化合物可减缓再障模型小鼠的体重下降，改善生存质量；增加模型小鼠脾、胸腺的脏器指数，有助于恢复免疫器官功能；增加外周血中血红蛋白、白细胞、血小板含量，使贫血症状得到改善；增加模型小鼠外周血网织红细胞数、骨髓CD34+细胞比例，恢复骨髓组织增生活跃度，促进模型小鼠骨髓造血功能的恢复。

为了完成本发明的目的，本发明技术方案的第二方面是提供了一种含有药物有效剂量的如式(Ⅰ)所述的化合物EAPP和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于预防、治疗或辅助治疗再生障碍性贫血的药物和/或保健品中的应用。

根据本发明，本发明化合物可以以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。

根据本发明的实施方案，所述的本发明化合物还包括其药学上可接受的盐、盐的水合物或前体药物。

本发明还涉及含有作为活性成分的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg，优选的单元剂型含有4～50mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的第三方面是提供第一方面所述衍生物的制备方法。

用于制备本发明化合物的原料，3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯及1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮，可根据文献[Org.Biomol.Chem.,2009,7(13):2788-2759；Synlett,2016,27:1587-1591]报道的方法，分别以3,5-二羟基苯甲酸和3,5-二羟基苯乙酮为原料分别制备获得。

本发明中所述式(Ⅰ)Amurensin H衍生物EAPP的基本合成路线如下：

本发明所述化合物为活性天然产物Amurensin H的结构改造衍生物，分子式为C₂₆H₂₂O₇，命名为3-(3,5-二甲氧基苯基)-6-甲氧基-4-苯并呋喃甲酸-4-乙酰基苯基酯。

本发明所述化合物的基本合成方法包括如下步骤：

步骤一：3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮通过醚化反应合成α-苯氧基酮苯甲酸甲酯中间体。

3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯和1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮于无水丙酮中，在K₂CO₃固体的催化下进行醚化反应，所得产物经重结晶或色谱分离纯化得目标产物α-苯氧基酮甲酸甲酯中间体。

步骤二：α-苯氧基酮甲酸甲酯中间体在酸性条件下环合合成苯并呋喃甲酸甲酯中间体。

步骤一所得产物于二氯甲烷中，在甲烷磺酸等酸性催化剂的作用下进行环合反应，所得固体产物经重结晶或色谱分离纯化得苯并呋喃甲酸甲酯中间体。

本反应中，催化剂为甲烷磺酸(MSA)，三氟甲磺酸铋(Bi(OTf)₃)，三氟乙酸(TFA)，三氯化铁(FeCl₃)等，优选甲烷磺酸和三氟甲磺酸铋。

步骤三：苯并呋喃甲酸甲酯中间体在碱性条件下进行水解合成苯并呋喃甲酸中间体。

步骤二所得化合物在THF、MeOH和H₂O(1∶1∶1，v/v/v)的混合溶液中，以NaOH等碱性试剂为催化剂进行水解反应，反应混合物经HCl中和、过滤，所得固体为苯并呋喃甲酸中间体。

步骤四：苯并呋喃甲酸中间体与4-羟基苯乙酮通过酯化反应合成目标化合物(I)。

步骤三所得中间体化合物于干燥的二氯甲烷中，在DMAP及EDCI的催化下，与4-羟基苯乙酮进行酯化反应，所得固体经硅胶柱层析分离得目标产物EAPP(I)。

根据本发明还涉及药物组合物的制备方法。用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化纳、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘泊、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素纳、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢纳与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸纳等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酶、明胶、半合成甘油酶等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3一丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酶等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的治疗再生障碍性贫血和其它免疫相关疾病的目的。

通常对体重约75公斤患者，所给本发明化合物的日剂量为0.001mg/kg体重～200mg/kg体重，优选1mg/kg体重～100mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其它治疗药物或对症药物合并使用。

有益技术效果

本发明的优点在于：(1)本发明的化合物为全合成的天然活性Amurensin H衍生物EAPP，具有更好的药效学特征和相对较小的毒副作用；(2)本发明的化合物具有显著的体内外抗炎活性；(3)本发明的化合物能有效防治再生障碍性贫血；(4)本品原料易得，制备工艺简单，易于规范化生产。

附图说明

图1.EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓病理形态学改变的影响(HE染色，Mean±Std,n＝6)

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：化合物(I)[3-(3,5-二甲氧基苯基)-6-甲氧基-4-苯并呋喃甲酸-4-乙酰基苯基酯]的制备。

化合物EAPP(I)的合成步骤如下：

步骤一：3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮通过醚化反应合成α-苯氧基酮甲酸甲酯。

3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(4.5g,26.8mmol)与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮(6.94g,26.8mmol)溶于150ml干燥丙酮中，剧烈搅拌下缓慢加入K₂CO₃固体7.39g(53.5mmol)，反应液室温搅拌3h，继续加热回流3h。TLC监测显示原料反应完毕。反应液冷却至室温，硅藻土过滤，丙酮洗涤，有机相减压浓缩，所得固体以200-300目硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(30∶2∶5)洗脱得白色无定型粉末为α-苯氧基酮苯甲酸甲酯(9.49g,产率98.3％)。

化合物17：白色无定形粉末,m.p.96.1-99.7℃.¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.19(d,J＝2.2Hz,2H),7.17(brs,1H),7.15(brs,1H),6.80(t,J＝2.3Hz,1H),6.78(t,J＝2.2Hz,1H),5.57(s,2H),3.86(s,6H),3.85(s,3H),3.83(s,3H).ESI-MS m/z 361.1[M+H]⁺,383.2[M+Na]⁺,399.0[M+K]⁺.

步骤二：α-苯氧基酮甲酸甲酯在酸性条件下环合合成苯并呋喃甲酸甲酯。

上一步所得α-苯氧基酮苯甲酸甲酯(5.00g,13.9mmol)溶于500mL二氯甲烷中，加入3.0mL甲烷磺酸。反应混合物于40℃搅拌反应30小时，反应液依次以饱和NaHCO₃溶液和水洗涤，有机相合并，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，所得固体以200-300目硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(60:2:5)洗脱得淡黄色粉末为苯并呋喃甲酸甲酯中间体(3.43g,72.1％)。

苯并呋喃甲酸甲酯中间体：淡黄色无定形粉末,m.p.138.9-141.1℃.¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.89(s,1H),7.38(d,J＝2.2Hz,1H),7.24(d,J＝2.2Hz,1H),6.50(s,3H),3.93(s,3H),3.81(s,6H),3.30(s,3H).¹³C NMR(500MHz,acetone-d₆):δ168.05,161.79,158.60,157.97,144.09(2×C),135.81,127.09,123.82,118.81,113.72,107.16(2×C),100.17,100.10,56.44,55.69(2×C),51.61.ESI-MS m/z 365.2[M+Na]⁺.

步骤三：上一步得到的苯并呋喃苯甲酸甲酯在碱性条件下进行水解合成苯并呋喃苯甲酸中间体

上一步所得苯并呋喃甲酸甲酯中间体(10.0g,29.2mmol)溶于150mL THF、MeOH和H₂O(1∶1∶1，v/v/v)的混合溶液中，搅拌溶解后加入NaOH 1.17g。反应混合物加热回流12h，减压浓缩至小体积，滴加1mol/L的HCl溶液，至没有白色沉淀析出为止。反应混合物抽滤，蒸馏水洗涤，滤饼烘干所得白色粉末状固体为苯并呋喃苯甲酸中间体(9.48g,98.9％)。

苯并呋喃甲酸中间体：白色粉末。¹H NMR(500MHz,acetone-d₆)δ7.89(s,1H),7.37(d,J＝2.0Hz,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.54(d,J＝2.0Hz,2H),6.43(t,J＝2.0Hz,1H),3.94(s,3H),3.78(s,6H)；¹³C NMR(125MHz,acetone-d₆):δ168.07,161.41,158.52,158.15,144.22,135.64,127.81,124.09,118.49,113.85,107.31(2×C),100.30,99.88,56.40,55.54(2×C).ESI-MS m/z329.2[M+H]⁺,351.1[M+Na]⁺,367.0[M+K]⁺.

步骤四：苯并呋喃甲酸中间体与4-羟基苯乙酮经酯化反应合成目标物(I)。

步骤三所得化合物(100mg,0.30mmol)溶于50mL干燥的二氯甲烷中，加入DMAP(44.7mg,0.37mmol)及EDCI(70.1mg,0.37mmol)，室温搅拌20min，加入4-羟基苯乙酮(1.2equiv)，继续室温搅拌4h。反应液减压浓缩，所得固体以石油醚∶乙酸乙酯：二氯甲烷(3:1:2)为展开剂，硅胶制备板制备分离得到目标产物(I)，产率79.7％。化合物(I)的理化参数如下：

化合物EAPP(I)：米白色固体。¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.96(d,J＝3.5Hz,1H),7.94(d,J＝9.0Hz,2H),7.50(d,J＝2.5Hz,1H),7.48(d,J＝2.5Hz,1H),6.99(d,J＝9.0Hz,2H),6.59(d,J＝2.5Hz,2H),6.37(t,J＝2.5Hz,1H),3.98(s,3H),3.75(s,6H),2.57(s,3H)；¹³C NMR(125MHz,acetone-d₆):δ196.83,165.36,161.92(2×C),158.65,158.17,154.93,144.75,135.66,135.59,130.19(2×C),125.70,123.79,122.24(2×C),119.03,114.82,107.65(2×C),101.13,99.91,56.58,55.67(2×C),26.69.(+)-ESI-MS m/z:447.2[M+H]⁺,469.2[M+Na]⁺,485.1[M+K]⁺.HR-ESI-MS m/z:447.1433[M+H]⁺(calcd.for C₂₆H₂₃O₇,447.1438).

药理实验：

实验例1：EAPP对再生障碍性贫血小鼠模型的作用

实验方法：

取18-20g雄性BALB/c小鼠，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(环孢素10mg/kg，灌胃给药)、EAPP组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，灌胃给药)。除空白对照组外，各组动物采用钴-60γ射线(5.80Gy钴-60γ射线一次全身照射)+DBA/2小鼠胸腺：脾免疫细胞(2：1)静脉注射接种制备再生障碍性贫血模型；从造模当日开始灌胃给药，每天1次，连续14天。于末次给药1小时后，小鼠眶静脉采血，EDTA-K₂抗凝，五分类血细胞分析仪检测血液常规以及流式细胞仪检测网织红细胞数；摘取小鼠胸腺和脾脏，称其湿重，并计算脏器指数；取小鼠一侧股骨，甲醛固定、EDTA脱钙后行进HE染色，观察股骨病理形态；取另一侧股骨骨髓，流式细胞仪检测骨髓CD34⁺细胞比例。

实验结果：

(1)EAPP对再生障碍性贫血小鼠体重的影响

体重是衡量患者生存质量的重要指标之一。再障患者由于长期处于贫血、出血、感染等症状中，极易出现由于消化吸收等功能紊乱所至的体重下降。本实验通过每周称量实验小鼠的体重评估EAPP对再障小鼠一般生长情况的影响。结果如表1所示，与正常对照组比较，再障模型小鼠7天、14天体重显著下降，而EAPP对模型小鼠的体重有恢复作用，且高剂量组(20mg/kg)恢复作用显著，提示EAPP对再障小鼠的生存质量具有改善作用。

表1EAPP对再生障碍性贫血小鼠体重生长的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05vs模型对照组

(2)EAPP对再生障碍性贫血小鼠胸腺、脾脏脏器指数的影响

免疫器官脾脏和胸腺的脏器指数可反映动物的免疫功能状态，本实验于给药第14天，摘取各组小鼠的胸腺和脾脏，称其湿重，并计算脏器指数(脏器指数＝脏器重量/当日体重)。结果见表2，与正常对照组比较，再障模型小鼠脾脏、胸腺的脏器重量与脏器指数均显著下降，EAPP可显著增加脾脏、胸腺的脏器重量与脏器指数，说明EAPP对再障小鼠免疫功能低下有改善作用。

表2EAPP对再生障碍性贫血小鼠免疫脏器指数的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05vs模型对照组

(3)EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血液常规检查结果的影响

外周血全血细胞减少是再障贫血、出血、感染等临床症状发生的主要原因，以及骨髓造血功能衰竭的外在表现。本实验于给药第14天，取各组小鼠眶静脉血，采用五分类血细胞分析仪检测小鼠外周血红细胞、白细胞和血小板的各项指标，考察EAPP对其的影响。结果见表3A、3B及3C。

①EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血白细胞分类计数的影响

结果如表3A所示，EAPP对再生障碍性贫血模型小鼠外周血白细胞总数、以及各分类细胞计数(淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)均有升高作用，其中对白细胞总数、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的升高作用显著，并对嗜酸性粒细胞比例升高有一定恢复作用。

表3A EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血中白细胞分类计数的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：白细胞计数(WBC)，淋巴细胞计数(LYM#)，单核细胞计数(MONO#)，中性粒细胞计数(NEUT#)，嗜酸性粒细胞计数(EO#)，嗜碱性粒细胞计数(BASO#)，淋巴细胞百分比(LYM％)，单核细胞百分比(MONO％)，中性粒细胞百分比(NEUT％)，嗜酸性粒细胞百分比(EO％)，嗜碱性粒细胞百分比(BASO％)；^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01vs模型对照组。

②EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血红细胞计数和血红蛋白含量的影响

如表3B结果所示，EAPP20mg/kg剂量组对再生障碍性贫血模型小鼠外周血红细胞、血红蛋白含量下降有显著改善作用，各剂量组对再障模型小鼠红细胞体积分布宽度标准差、红细胞体积分布宽度变异系数升高有恢复作用。

表3B EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血红细胞计数和血红蛋白含量的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：红细胞(RBC)，血红蛋白(HGB)，血红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，红细胞体积分布宽度标准差(RDW-SD)，红细胞体积分布宽度变异系数(RDW-CV)；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01vs模型对照组。

③EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血血小板计数的影响

结果如表3C所示，EAPP可显著改善再生障碍性贫血模型小鼠外周血血小板的减少、平均血小板体积与血小板压积下降，并对血小板体积分布宽度增加有一定恢复作用。

以上结果表明，EAPP可通过恢复血红蛋白含量、增加白细胞和血小板数量，改善模型小鼠的贫血症状。

表3C EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血中血小板的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：血小板计数(PLT)，平均血小板体积(MPV)，血小板压积(PCT)，血小板体积分布宽度(PDW)；^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01vs模型对照组。

(4)EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血网织红细胞数的影响

网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，在外周血液中的数值可反映骨髓红细胞的生成功能和骨髓造血功能，对血液病的诊断和治疗反应的观察均有重要意义。在临床对再生障碍性贫血患者进行治疗的过程中，网织红细胞参数的升高是患者的骨髓造血功能得到恢复的一种重要指标。本实验于给药第14天，取各组小鼠眶静脉血，以噻唑橙作为RNA的荧光染料标记外周血网织红细胞，并采用流式细胞术检测外周血网织红细胞比例，并根据外周血红细胞计数计算外周血网织红细胞计数。实验结果见表4。表4结果显示，与正常对照组比较，再障模型组小鼠外周血网织红细胞比例及计数均显著降低，而EAPP在20mg/kg剂量下灌胃给药，可显著增加再生障碍性贫血小鼠外周血的网织红细胞比例和计数(p<0.05)。提示，EAPP对再生障碍性贫血小鼠的骨髓红细胞生成功能和骨髓造血功能具有明显的改善作用。

表4EAPP对再生障碍性贫血小鼠外周血网织红细胞数的影响(Mean±Std,n＝9)

备注：^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01vs模型对照组

(5)EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓病理形态与有核细胞计数的影响

骨髓是机体的主要造血组织，再生障碍性贫血患者骨髓造血功能下降，骨髓象检查可见增生下降、造血细胞明显减少、非造血细胞及脂肪细胞增多、淋巴细胞百分率增多等，是再生障碍性贫血诊断标准的重要内容。本实验于给药第14天取各组小鼠股骨，经甲醛固定、EDTA脱钙后进行HE染色，观察骨髓病理形态的改变，并进行有核细胞计数。实验结果见表5、图1。病理形态如图1所示，与正常对照组相比，模型组小鼠骨髓造血细胞减少，脂肪细胞增加，血窦扩张、充血。EAPP各剂量给药组可不同程度减轻再障小鼠骨髓病理形态的改变。骨髓有核细胞计数结果如表5所示，与正常对照组相比，模型组小鼠骨髓有核细胞总数、有核细胞/红细胞比例、红细胞系计数、粒细胞系计数、粒细胞比例、粒/红比均显著下降，红细胞比例、淋巴细胞比例均显著升高，表明骨髓增生活跃度显著下降，EAPP在10，20mg/kg剂量下对以上指标有显著恢复作用，可提高骨髓的增生活跃度。

(6)EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓CD34⁺细胞计数的影响

CD34⁺细胞主要表达于早期造血干细胞、祖细胞,可能在造血干细胞、祖细胞于骨髓的粘附和归巢过程中起作用。骨髓CD34⁺细胞可以直接反映出骨髓造血细胞的生成情况。再障患者骨髓CD34⁺细胞较正常显著减少，因此，骨髓CD34⁺细胞对再生障碍性贫血的发病机制研究具有重要的意义，亦可作为再生障碍性贫血的诊断、鉴别诊断和疗效判定的重要指标。本实验于给药第14天取各组小鼠股骨，冲洗并收集骨髓细胞，采用流式细胞术对骨髓中细胞数量及CD34⁺细胞比例进行测定。实验结果见表6。如表6结果显示，与正常对照组比较，再障模型小鼠骨髓CD34⁺细胞比例显著降低，EAPP在10，20mg/kg剂量下灌胃给药，可显著升高再生障碍性贫血小鼠的CD34⁺细胞比例与细胞计数，表明EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血干细胞、祖细胞有恢复作用。以上结果提示，EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能衰竭具有改善作用。

表6EAPP对再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞计数和CD34⁺细胞比例的影响(Mean±Std,n＝10-12)

备注：^##p＜0.01vs正常对照组；^*p＜0.05，^**p＜0.01vs模型对照组

综上研究结果显示，本发明所述Amurensin H衍生物EAPP可减缓再障模型小鼠的体重下降，改善生存质量；增加模型小鼠脾、胸腺的脏器指数，有助于免疫器官功能的恢复；增加外周血中血红蛋白、白细胞、血小板含量，从而减少再障的贫血、出血、感染等各种临床症状的发生，减轻外周血损伤；同时，EAPP可显著增加模型小鼠外周血网织红细胞数、骨髓CD34⁺细胞比例，恢复骨髓组织增生活跃度，促进模型小鼠骨髓造血功能的恢复，对再障发挥明显的治疗作用。而且，EAPP尚未发现有任何毒副作用，可见其在再生障碍性贫血以及免疫相关疾病的治疗中具有十分广阔的应用前景。

Claims (7)

1.如式(Ⅰ)所示的Amurensin H衍生物EAPP及其药效学上可接受的盐在制备治疗和/或预防再生障碍性贫血相关产品中的应用

2.一种药物组合物在制备治疗和/或预防再生障碍性贫血相关产品中的应用，其特征在于，所述的药物组合物由有效剂量的权利要求1所述的衍生物EAPP或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其它有效成分，所述的其它成分包括抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗结核药物、免疫抑制剂、保肝药物、营养物质中的一种或几种。

4.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物选自片剂、胶囊、丸剂、注射剂。

5.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物选自缓释制剂、控释制剂、及各种微粒给药系统。

6.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的产品选自药品、保健品。

7.如式(Ⅰ)所示的Amurensin H衍生物EAPP及其药效学上可接受的盐

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