CN114099491A - 3-芳基苯并呋喃衍生物eapp-2在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种如式(Ⅰ)所示的3‑芳基苯并呋喃衍生物EAPP‑2在制备治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。本发明所述的3‑芳基苯并呋喃衍生物EAPP‑2制备方法简单，具有明显的抗炎活性，对慢性阻塞性肺疾病具有显著的治疗作用，对COPD模型小鼠肺部组织炎症病理改变具有改善作用，并可改善COPD气道炎症的各项指标：显著抑制BALF中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞的募集，显著降低BALF中炎症因子TNF‑α、IL‑17A、IFN‑γ等的生成水平，可以单体或药用组合物的形式应用于慢性阻塞性肺疾病的临床治疗中，对慢性阻塞性肺疾病以及免疫相关疾病的治疗具有潜在的应用价值。

Description

3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2在制备治疗慢性阻塞性肺疾病 药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2或其药学上可接受的盐，及含有该衍生物或其医学上可接受的盐的药用组合物，在制备预防和/或治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种进行性发展、以不完全可逆气流受限为特征的呼吸系统疾病，具有高发病率、致残率和死亡率的特点，全球40岁以上发病率已高达9％-10％，而且仍呈逐年增高趋势，严重危害全球人类健康。

COPD气流受限与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的异常慢性炎性反应有关。慢性气道炎症是COPD的重要特征，研究表明气道炎症与COPD气流受限程度正相关，COPD的病理进程始终伴随着持续的慢性气道炎症。该炎症以气道上皮细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等细胞的炎症反应为典型表现，致炎因子引起局部血管扩张、毛细血管通透性增加，白细胞浸润，产生白三烯、细胞因子等炎症介质；炎症介质之间、炎症介质与细胞之间以及炎性细胞之间相互作用，加剧组织和细胞的损伤，加重炎症反应，并使炎症反应迁延。因此，控制气道炎症是COPD临床治疗的必要手段之一；然而，迄今为止，仍没有用于COPD气道炎症治疗的理想药物。皮质激素类抗炎药的吸入疗法是当前临床一致推荐用于COPD气道炎症治疗的用药方案，但是，研究发现，皮质激素吸入用于气道炎症治疗存在抗药性，约70％-80％的患者吸入皮质激素治疗病情未见显著改善。皮质激素长期使用存在较多的问题，如显著增加感染性肺炎等不良反应发生风险。而且，而临床上应用的非甾体类抗炎药也存在引发心脏病或全身凝血障碍性疾病等不良反应问题。因此，寻找更为安全有效的抗气道炎症药物仍是当前COPD炎症治疗的重要任务。

Amurensin H(7,8-脱氢葡萄藤戊素)是从民间药用植物山葡萄(Vitisamurensis)根中分离得到白藜芦醇二聚体，具有良好的体内外抗炎活性与较低的毒性。本发明科研人员以Amurensin H为先导化合物，经一系列结构改造与优化，得到了一种新结构的3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2，其结构如式(Ⅰ)所示。药理研究显示，该化合物对慢性阻塞性肺疾病具有显著的治疗作用，且该化合物在治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病方面的应用目前尚未见相关报道。本专利首次公开了该化合物在治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病中的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2或其药物组合物在制备用于预防、治疗或辅助治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用。

为实现本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明以Amurensin H为先导化合物，通过结构修饰方法合成了一种3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2，并深入研究了该类化合物在治疗慢性阻塞性肺疾病方面的应用。

本发明技术方案的第一方面是提供一种如式(Ⅰ)所示的3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2及其药效学上可接受的盐在制备治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

为了完成本发明的目的，本发明涉及该3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2及其药效学可接受的盐，及其药物组合物在慢性阻塞性肺疾病和其它免疫相关疾病中的应用。

慢性阻塞性肺疾病的主要风险因素为吸烟，以LPS+香烟诱导模拟小鼠的COPD模型。该EAPP-2在7.5，15，30mg/kg剂量下灌胃给药。研究结果显示，本发明化合物可抑制LPS诱导的中性粒细胞中炎症因子IL6、IL-8的分泌，可减轻COPD小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白细胞的募集，抑制BALF中炎性细胞因子IL-17A、IFN-γ、TNF-α的生成，并可显著减轻COPD小鼠肺部炎症病理损伤程度。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种含有药物有效剂量的如式(Ⅰ)所述的化合物EAPP-2和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于预防、治疗或辅助治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用。

根据本发明，本发明化合物可以以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。

根据本发明的实施方案，所述的本发明化合物还包括其药学上可接受的盐。

本发明还涉及含有作为活性成分的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg，优选的单元剂型含有4～50mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

根据本发明还涉及药物组合物的制备方法。用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化纳、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘泊、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素纳、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢纳与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸纳等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酶、明胶、半合成甘油酶等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3一丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酶等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的治疗炎症性疾病的目的。

通常对体重约75公斤患者，所给本发明化合物的日剂量为0.001mg/kg体重～200mg/kg体重，优选1mg/kg体重～100mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其它治疗药物或对症药物合并使用。

本发明技术方案的第三方面是提供第一方面所述衍生物的制备方法。

用于制备本发明化合物的原料，3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯及1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮，可根据文献[Org.Biomol.Chem.,2009,7(13):2788-2759；Synlett,2016,27:1587-1591]报道的方法，分别以3,5-二羟基苯甲酸和3,5-二羟基苯乙酮为原料分别制备获得。

本发明中所述式(Ⅰ)3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2的基本合成路线如下：

本发明所述化合物分子式为C₂₆H₂₂O₇，命名为3-(3,5-二甲氧基苯基)-6-甲氧基-4-苯并呋喃甲酸-4-乙酰基苯基酯。

本发明所述化合物的基本合成方法包括如下步骤：

步骤一：3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮通过醚化反应合成α-苯氧基酮苯甲酸甲酯中间体。

3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯和1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮于无水丙酮中，在K₂CO₃固体的催化下进行醚化反应，所得产物经重结晶或色谱分离纯化得目标产物α-苯氧基酮甲酸甲酯中间体。

步骤二：α-苯氧基酮甲酸甲酯中间体在酸性条件下环合合成苯并呋喃甲酸甲酯中间体。

步骤一所得产物于二氯甲烷中，在甲烷磺酸等酸性催化剂的作用下进行环合反应，所得固体产物经重结晶或色谱分离纯化得苯并呋喃甲酸甲酯中间体。

本反应中，催化剂为甲烷磺酸(MSA)，三氟甲磺酸铋(Bi(OTf)₃)，三氟乙酸(TFA)，三氯化铁(FeCl₃)等，优选甲烷磺酸和三氟甲磺酸铋。

步骤三：苯并呋喃甲酸甲酯中间体在碱性条件下进行水解合成苯并呋喃甲酸中间体。

步骤二所得化合物在THF、MeOH和H₂O(1∶1∶1，v/v/v)的混合溶液中，以NaOH等碱性试剂为催化剂进行水解反应，反应混合物经HCl中和、过滤，所得固体为苯并呋喃甲酸中间体。

步骤四：苯并呋喃甲酸中间体与4-羟基苯乙酮通过酯化反应合成目标化合物(I)。

步骤三所得中间体化合物于干燥的二氯甲烷中，在DMAP及EDCI的催化下，与4-羟基苯乙酮进行酯化反应，所得固体经硅胶柱层析分离得目标产物EAPP-2(I)。

有益技术效果

本发明的优点在于：(1)本发明的化合物为全合成的天然活性3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2，比Amurensin H具有更好的药效学特征和相对较小的毒副作用；(2)本发明的化合物具有显著的体内外抗炎活性；(3)本发明的化合物对香烟诱导的小鼠慢性阻塞性肺疾病具有显著的抑制作用；(4)本品原料易得，制备工艺简单，易于规范化生产。

附图说明

图1.EAPP-2对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织病理形态学改变的影响(HE染色，Mean±SD,n＝4)

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述。

实施例1：化合物(I)[3-(3,5-二甲氧基苯基)-6-甲氧基-4-苯并呋喃甲酸-4-乙酰基苯基酯]的制备。

化合物EAPP-2(I)的合成步骤如下：

步骤一：3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮通过醚化反应合成α-苯氧基酮甲酸甲酯。

3-甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯(4.5g,26.8mmol)与1-(3,5-二甲氧基苯基)-2-溴苯乙酮(6.94g,26.8mmol)溶于150ml干燥丙酮中，剧烈搅拌下缓慢加入K₂CO₃固体7.39g(53.5mmol)，反应液室温搅拌3h，继续加热回流3h。TLC监测显示原料反应完毕。反应液冷却至室温，硅藻土过滤，丙酮洗涤，有机相减压浓缩，所得固体以200-300目硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(30：2∶5)洗脱得白色无定型粉末为α-苯氧基酮苯甲酸甲酯(9.49g,产率98.3％)。

α-苯氧基酮苯甲酸甲酯：白色无定形粉末,m.p.96.1-99.7℃.¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.19(d,J＝2.2Hz,2H),7.17(brs,1H),7.15(brs,1H),6.80(t,J＝2.3Hz,1H),6.78(t,J＝2.2Hz,1H),5.57(s,2H),3.86(s,6H),3.85(s,3H),3.83(s,3H).ESI-MS m/z 361.1[M+H]⁺,383.2[M+Na]⁺,399.0[M+K]⁺.

步骤二：α-苯氧基酮甲酸甲酯在酸性条件下环合合成苯并呋喃甲酸甲酯。

上一步所得α-苯氧基酮苯甲酸甲酯(5.00g,13.9mmol)溶于500mL二氯甲烷中，加入3.0mL甲烷磺酸。反应混合物于40℃搅拌反应30小时，反应液依次以饱和NaHCO₃溶液和水洗涤，有机相合并，无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，所得固体以200-300目硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷(60:2:5)洗脱得淡黄色粉末为苯并呋喃甲酸甲酯中间体(3.43g,72.1％)。

苯并呋喃甲酸甲酯中间体：淡黄色无定形粉末,m.p.138.9-141.1℃.¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.89(s,1H),7.38(d,J＝2.2Hz,1H),7.24(d,J＝2.2Hz,1H),6.50(s,3H),3.93(s,3H),3.81(s,6H),3.30(s,3H).¹³C NMR(500MHz,acetone-d₆):δ168.05,161.79,158.60,157.97,144.09(2×C),135.81,127.09,123.82,118.81,113.72,107.16(2×C),100.17,100.10,56.44,55.69(2×C),51.61.ESI-MS m/z 365.2[M+Na]⁺.

步骤三：上一步得到的苯并呋喃苯甲酸甲酯在碱性条件下进行水解合成苯并呋喃苯甲酸中间体

上一步所得苯并呋喃甲酸甲酯中间体(10.0g,29.2mmol)溶于150mL THF、MeOH和H₂O(1∶1∶1，v/v/v)的混合溶液中，搅拌溶解后加入NaOH 1.17g。反应混合物加热回流12h，减压浓缩至小体积，滴加1mol/L的HCl溶液，至没有白色沉淀析出为止。反应混合物抽滤，蒸馏水洗涤，滤饼烘干所得白色粉末状固体为苯并呋喃苯甲酸中间体(9.48g,98.9％)。

苯并呋喃甲酸中间体：白色粉末。¹H NMR(500MHz,acetone-d₆)δ7.89(s,1H),7.37(d,J＝2.0Hz,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.54(d,J＝2.0Hz,2H),6.43(t,J＝2.0Hz,1H),3.94(s,3H),3.78(s,6H)；¹³C NMR(125MHz,acetone-d₆):δ168.07,161.41,158.52,158.15,144.22,135.64,127.81,124.09,118.49,113.85,107.31(2×C),100.30,99.88,56.40,55.54(2×C).ESI-MS m/z329.2[M+H]⁺,351.1[M+Na]⁺,367.0[M+K]⁺.

步骤四：苯并呋喃甲酸中间体与4-羟基苯乙酮经酯化反应合成目标物(I)。

步骤三所得化合物(100mg,0.30mmol)溶于50mL干燥的二氯甲烷中，加入DMAP(44.7mg,0.37mmol)及EDCI(70.1mg,0.37mmol)，室温搅拌20min，加入4-羟基苯乙酮(1.2equiv)，继续室温搅拌4h。反应液减压浓缩，所得固体以石油醚∶乙酸乙酯∶二氯甲烷(3:1:2)为展开剂，硅胶制备板制备分离得到目标产物(I)，产率79.7％。化合物(I)的理化参数如下：

化合物EAPP-2(I)：米白色固体。¹H NMR(500MHz,acetone-d₆):δ7.96(d,J＝3.5Hz,1H),7.94(d,J＝9.0Hz,2H),7.50(d,J＝2.5Hz,1H),7.48(d,J＝2.5Hz,1H),6.99(d,J＝9.0Hz,2H),6.59(d,J＝2.5Hz,2H),6.37(t,J＝2.5Hz,1H),3.98(s,3H),3.75(s,6H),2.57(s,3H)；¹³C NMR(125MHz,acetone-d₆):δ196.83,165.36,161.92(2×C),158.65,158.17,154.93,144.75,135.66,135.59,130.19(2×C),125.70,123.79,122.24(2×C),119.03,114.82,107.65(2×C),101.13,99.91,56.58,55.67(2×C),26.69.(+)-ESI-MS m/z:447.2[M+H]⁺,469.2[M+Na]⁺,485.1[M+K]⁺.HR-ESI-MS m/z:447.1433[M+H]⁺(calcd.for C₂₆H₂₃O₇,447.1438).

药理实验：

实验例1：EAPP-2体外对LPS诱导的HL-60中性粒样细胞炎症的作用

实验方法：

HL-60是一种嗜中性的早幼粒细胞，可被诱导分化为单核细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的表型。以DMSO为诱导剂诱导HL-60分化为中性粒样细胞，在细菌脂多糖LPS诱导下可产生趋化性因子IL-8等炎性因子，参与并介导炎症反应。通过检测LPS诱导的HL-60分化的中性粒样细胞培养基上清中的IL-8的生成量，可于体外初步观察化合物的抗炎活性。

实验方法：

取生长状态良好、处于对数生长期的HL-60细胞，用含有10％FBS、1.25％DMSO的RPMI-1640培养基培养5～6天，诱导HL-60分化为中性粒样细胞。将分化的HL-60细胞接种到96孔板中，加入含不同浓度的EAPP-2预保护1h；然后，加入LPS使其终浓度为1μg/ml，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，收集上清液，采用ELISA法测定趋化因子IL-8的含量，根据计算得的各组OD值与空白对照组平均OD值的比值进行组间统计学比较。

实验结果：

结果如表1所示，与模型对照组相比较，EAPP-2能显著抑制LPS诱导的HL-60分化的中性粒样细胞培养基上清中IL-8的生成，显现出较好的体外抗炎活性(p＜0.01)。

表1.EAPP-2对LPS诱导的HL-60中性粒样细胞中IL-8生成的影响(Mean±SD,n＝3)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

实验例2：EAPP-2对LPS诱导的小鼠骨髓来源的中性粒细胞炎症因子分泌的影响

实验方法：取数只SPF级雄性BALB/c小鼠，处死并无菌剥离股骨和胫骨，剪去股骨胫骨两端，露出红色的骨髓腔，取1ml的无菌注射器，吸取含有5％血清的1640培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。最终制备成2×10⁸～1×10⁹/ml的骨髓单细胞悬液备用；使用小鼠骨髓中性粒细胞分离液试剂盒分离得到中性粒细胞。将小鼠骨髓中性粒细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的化合物预先保护1h，1h后向孔板中加入LPS(终浓度为1μg/mL)，于37℃、5％CO₂环境中孵育培养6h；6h后，吸取培养基上清，检测上清中IL-6的含量，根据计算得的各组OD值与空白对照组平均OD值的比值进行组间统计学比较。

实验结果：

EAPP-2对小鼠骨髓来源的中性粒细胞IL-6分泌的影响

中性粒细胞被激活后能产生多种生物活性物质，IL-6是一种多效性细胞因子，在机体内平衡被破坏时或在LPS、GM-CSF等外源性因子刺激下诱使中性粒细胞产生IL-6，其产生的IL-6亦作用于其自身。本实验通过检测小鼠骨髓来源的中性粒细胞IL-6的分泌水平，评估EAPP-2对该细胞模型炎症反应的影响。结果如表2所示，与模型对照组比较，EAPP-2能显著降低小鼠骨髓来源的中性粒细胞中IL-6的分泌(p＜0.01或0.05)。

表2 EAPP-2对小鼠骨髓来源的中性粒细胞IL-6分泌的影响(Mean±Std,n＝3)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

实验例3：EAPP-2对LPS+香烟诱导小鼠COPD气道炎症的抑制作用

实验方法：SPF级雄性BALB/c小鼠，18-20g，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(地塞米松，0.5mg/kg，灌胃给药)、EAPP组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg，灌胃给药)。除空白对照组外，各组动物分别于实验第1天麻醉后气管滴入50μl/只含有40μg LPS的生理盐水溶液，第13天气管滴入50μl/只含有30μg LPS的生理盐水溶液；并于实验第2-12天和第14-28天，将小鼠置于小动物烟气吸入微环境制备系统(香烟烟雾：240-300ppm，温度22-28℃，氧气≥18.0％)中进行熏烟，1h/次，每天1次；同时，给药组于每日烟熏前1小时灌胃给药，空白对照组与模型对照组给予等体积的溶媒。小鼠于末次给药24小时后，取部分小鼠肺组织，进行组织病理学检测。其余各组小鼠用0.7mL预冷的生理盐水灌流，冲洗3次，吸出支气管肺泡灌洗液(BALF)，离心，上清用于分析IL-4、IL-17A及TNF-α的含量；PBS缓冲液重悬细胞，进行白细胞分类计数。

实验结果：

(1)EAPP-2对COPD小鼠肺组织炎性病理损伤的影响

如图1病理图片和表3.1炎症病理评分结果所示，模型组肺泡壁变宽，肺泡壁上皮细胞肿胀、变圆、部分脱落，肺泡腔可见巨噬细胞，小支气管和细支气管周围灶性炎性细胞浸润，肺组织边缘肺泡腔扩张。可见，EAPP-2在剂量30mg/kg下灌胃给药，对COPD小鼠肺组织的炎症病理改变具有显著的改善作用(p＜0.01)。

表3.1 EAPP-2对COPD小鼠肺组织病理炎症评价的影响(Mean±Std,n＝4)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，**p＜0.01

(2)EAPP-2对COPD小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞募集的抑制作用

①EAPP-2对COPD小鼠BALF中白细胞总数的影响

COPD以遍及气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征，这种炎症表现为中性粒细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞在肺内增多。激活的炎症细胞释放一系列破坏肺结构的炎性介质或维持中性粒细胞炎症的介质。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中总白细胞募集的影响，结果见表3.2。

结果：EAPP-2在剂量30mg/kg下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中总炎性细胞募集，与模型组比较，差异具有显著性(p＜0.05)。

表3.2 EAPP-2对COPD小鼠BALF中白细胞总数的影响(Mean±Std,n＝8)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

②EAPP-2对COPD小鼠BALF中中性粒细胞分类计数的影响

中性粒细胞在COPD发病中具有重要作用，可释放丝氨酸蛋白酶并诱导动物产生人类肺气肿样的病理变化。中性粒细胞寿命短暂，它循环招募到气道以及穿越间隙腔的过程十分迅速。病理研究证明有些COPD患者支气管组织内中性粒细胞数目增加与气流阻塞程度有关。吸烟的COPD患者气道内中性粒细胞数目增加，特别是那些伴有慢性支气管炎的患者。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中中性粒细胞募集的影响，结果见表3.3。

结果：EAPP-2在剂量30mg/kg下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中中性粒细胞募集，与模型组比较，差异具有显著性(p＜0.05)。

表3.3 EAPP-2对COPD小鼠BALF中中性粒细胞分类计数的影响(Mean±Std,n＝8)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，**p＜0.01

③EAPP-2对COPD小鼠BALF中单核/巨噬细胞分类计数的影响

吸烟者和COPD患者肺内巨噬细胞较正常人群水平增加，巨噬细胞多聚集在肺泡、细支气管和小气道。肺泡壁巨噬细胞数目和轻中度肺气肿以及COPD患者小气道疾病的严重程度呈正相关。组织病变和损伤部位可见到COPD缓慢进展和慢性病变，且与巨噬细胞的长期增加平行。巨噬细胞可能通过释放基质金属蛋白酶导致弹性组织降解能力异常增高，诱发肺气肿的发生。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中单核/巨噬细胞募集的影响，结果见表3.4。

结果：EAPP-2在30mg/kg剂量下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中单核/巨噬细胞的募集，与模型组比较，具有显著性差异(p＜0.01)

表3.4 EAPP-2对COPD小鼠BALF中单核/巨噬细胞分类计数的影响(Mean±Std,n＝8)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，**p＜0.01

(3)EAPP-2对COPD小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子生成的抑制作用

①EAPP-2对COPD小鼠BALF中TNF-α生成的影响

前炎性细胞因子TNF-α是COPD的发病过程中的启动因子。COPD患者的TNF-α水平高于正常人，培养的支气管上皮细胞与香烟的烟雾接触可分泌TNF-α。TNF-α可促使中性粒细胞脱颗粒，诱导粘膜细胞增生和高分泌，增加上皮细胞IL-8生成，增加巨噬细胞基质金属蛋白酶生成，促进气道高反应性。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中TNF-α生成的影响，结果见表3.5。

结果：EAPP-2在剂量7.5、15、30mg/kg下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中TNF-α的生成水平，与模型组比较，差异具有显著性(p＜0.01)。

表3.5 EAPP-2对COPD小鼠BALF中TNF-α生成的影响(Mean±Std,n＝8)

备注：与空白对照组比较,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

②EAPP-2对COPD小鼠BALF中IL-17A生成的影响

IL-17A是参与COPD气道炎症的重要细胞因子，在COPD进展过程中，IL-17诱导中性粒细胞的活化和聚集，使气道杯状细胞分泌粘液增多，造成肺损伤。研究显示COPD患者气管和肺实质IL-17显著高于健康人，且与病情严重程度正相关，吸烟者IL-17水平也高于非吸烟者，提示IL-17参与了COPD患者气道炎症反应和气道重塑，引起了气道阻塞。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中IL-17A生成的影响，结果见表3.6。

结果：EAPP-2在剂量7.5、15、30mg/kg下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中IL-17A的生成水平，相较于模型组，具有显著性差异(p＜0.05或0.01)。

表3.6 EAPP-2对COPD小鼠BALF中IL-17A生成的影响(Mean±Std,n＝8)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

③EAPP-2对COPD小鼠BALF中IFN-γ生成的影响

IFN-γ亦是参与COPD的发生、发展炎症过程的重要因子，可作为评估COPD病情的重要指标之一，具有重要的参考价值。本实验目的在于考察EAPP-2对COPD小鼠BALF中IFN-γ生成的影响，结果见表3.7。

结果：EAPP-2在剂量7.5、15、30mg/kg下灌胃给药可降低COPD小鼠BALF中IFN-γ的生成水平，与模型组比较，差异具有显著性(p＜0.05或0.01)。

表37EAPP-2对COPD小鼠BALF中IFN-γ生成的影响(Mean±Std n＝8)

备注：与空白对照组比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

综上研究结果显示，本发明所述3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2可以显著改善COPD小鼠肺组织炎症病理改变，抑制BALF中总白细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞的数目，降低BALF中炎症因子TNF-α、IL-17A、IFN-γ等的生成水平，尤以剂量30mg/kg显著，对COPD气道炎症具有显著的改善作用。而且，EAPP-2尚未发现有任何毒副作用，可见其在慢性阻塞性肺疾病的治疗中具有十分广阔的应用和开发前景。

Claims (5)

1.如式(Ⅰ)所示的3-芳基苯并呋喃衍生物EAPP-2及其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病药物中的应用；

2.一种药物组合物在制备治疗和/或预防慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物由有效剂量的权利要求1所述的衍生物EAPP-2或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其它有效成分，所述的其它成分包括抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗结核药物、免疫抑制剂、保肝药物、营养物质中的一种或几种。

4.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物组合物选自片剂、胶囊、丸剂、注射剂。

5.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述药物组合物选自缓释制剂、控释制剂、及各种微粒给药系统。

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