CN1105575C - 冻干的干细胞因子制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的含有氨基酸缓冲剂的冻干SCF制剂。本发明的优选方式是用组氨酸和谷氨酸组合物来调节pH的。本制剂任选地包括附加的稳定剂，比如蔗糖。本制剂也可以任选地包括填充剂，和/或渗透性调节剂，比如甘露醇。

Description

冻干的干细胞因子制剂
                        发明领域
本发明涉及新的干细胞因子组合物和方法。更特别地，本发明涉及新的冻干的干细胞因子制剂和制备方法。
                        发明背景
干细胞因子(SCF)是早期作用造血因子。见PCT WO 91/05795，题目是“干细胞因子”，在此引入作为参考。SCF药物学组合物在本领域中是已知的，见PCT WO 91/05795，supra，20-21页，然而，具有较长贮藏寿命的SCF药物学组合物对其生产者和消费者而言都是有益的。
在溶液中，SCF的稳定性由一些降解反应所限定，包括切断、脱酰胺作用，以及RP-HPLC的修饰作用。冷冻干燥法(冻干)被认为对许多生物活性材料(包括蛋白质)的保存都是有用和有效的。但是，冻干法也具有其自身的限制性，包括在冷冻和除水过程中，蛋白过浓，可能会导致产物的不稳定。因此，除了在冻干状态以及液态都可以发生的脱酰胺作用以及氧化反应外，冻干法可能导致交联(生成共价寡聚物)以及非共价聚合比率的升高。为了增强药物的稳定性，经常需要一些保护剂，其机制包括提高制剂的玻璃化转变温度(即组合物从流动的，似橡胶的，可反应状态转变成硬的，因而难以发生反应的状态的温度)；作为冷或溶解保护剂(即冷冻和/或干燥过程中的保护剂)；和/或对蛋白构象稳定性所必需的结合水分子进行置换。
已知在某些情况下氨基酸可以作为冻干蛋白产品的稳定剂。据报道，谷氨酸钠和赖氨酸盐酸盐对一种蛋白，乳酸脱氢酶，的冷冻变性具有防冻作用(Seguro，et al.，Cryobiology 27：70-79(1990))。Hora等报道了用L-精氨酸，L-肉毒碱氯化物或L-甜菜碱作为rhIL-2的缓冲剂(Developments in Biological Standardization，Vol.74，Karger，Basel，1992)。在加速试验中，甜菜碱缓冲的制剂中有二聚物生成，同时，以Arg/肉毒碱缓冲的制剂有较差的物理稳定性，导致制备过程中蛋白的聚合。这样，无法预测使用氨基酸能否增加冻干的蛋白产品的稳定性。其他种类的分子，包括单糖和二糖，以及聚合物比如PVP，已被报道为冻干蛋白的稳定剂，但是，再一次地，对任一给定的蛋白产品，它们的效用是无法预测的。
                         发明概述
本发明涉及新的含有氨基酸缓冲剂的冻干的SCF制剂。奇怪的是，与用无机的或其他类型的有机化合物来调节或维持pH值的制剂相比，加入组氨酸和/或谷氨酸作为缓冲剂可以提高SCF的稳定性。本制剂的优选方式是以组氨酸和谷氨酸的组合物缓冲的。本制剂可以任选地包括附加的稳定剂，比如蔗糖。此制剂也可以任选地包括填充剂和/或渗透性调节剂，比如甘露醇。
尽管观察了此氨基酸缓冲剂的保护作用，但其作用的精确方式依然未知。一个可能的解释涉及组氨酸的玻璃化转变温度。从根本上讲，玻璃化转变温度是这样一个温度，在此温度下，组合物(在这里，包含SCF)从一种相对来说非柔性的，不起反应的(因此相当稳定)状态转换到相对柔性的，更易反应的(因此不太稳定)状态。因为与非氨基酸缓冲剂成分相比，组氨酸的玻璃化转变温度相对较高，所以组氨酸可能对冻干制剂的总的稳定性起了一定作用。
氨基酸保护SCF的另一种可能机制是在冷冻过程中，其与蛋白共浓缩，从而起到稀释和保护蛋白的作用。还有一种可能是在冷冻和/或冻干过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用，保护蛋白不变性。
本发明还观察到蔗糖对冻干的SCF制剂有保护作用。它的精确的作用方式也是未知的，但是一种可能的解释涉及玻璃化转变温度，类似于前面对组氨酸的解释。玻璃化转变温度总的来说依赖于制剂组成成分的玻璃化转变温度，以及它们的相对比例，蔗糖也有一个相对高的玻璃化转变温度。因为在冷冻状态下蔗糖与SCF共浓缩，因此它可以起到稀释SCF的作用，从而防止了聚合。
一个可选的解释涉及水的置换。象SCF这样的蛋白包含有结合水分子，这些水分子被多元醇置换后可以提高蛋白的稳定性。蔗糖具有比其他多元醇更优越的水置换特性。
这些制剂，其使用了组氨酸和/或谷氨酸，以及任选的蔗糖，以及任选的填充剂比如甘露醇，以及进一步任选的渗透性调节剂，也可以是甘露醇，可以满足提高SCF制剂稳定性的需要。本发明还涉及制备这些制剂的方法。
                       附图详述
图1是个条形图，精细的SCF种类按增加的顺序(片段以轮廓线表示，二聚体以黑色填充的轮廓线表示)，表明不同的SCFmet1-165(浓度为6.0mg/ml)制剂的相对稳定性，这些制剂在加速稳定性研究中在高温(45℃)下处理4个星期。第一个条形(在左边)代表包含10mM乙酸钠，pH5.0，和140mM NaCl的SCFmet1-165溶液。第二个条形(S5M)代表10mM琥珀酸钠，pH5.0，5％甘露醇；第三个条形(G5M)代表10mM谷氨酸，pH5.0，5％甘露醇；第四个条形(GH5M)是10mM谷氨酸，8.35mM组氨酸，pH5.0，5％甘露醇；第五个条形(H6M)代表10mM组氨酸，pH6.0，5％甘露醇；第六个条形(HG6M)代表10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，5％甘露醇。此图表明，谷氨酸或组氨酸缓冲的样品比非氨基酸(琥珀酸)缓冲的类似的制剂更稳定；组氨酸和谷氨酸的组合物缓冲的制剂比同样pH值下用单一氨基酸缓冲的制剂含有更少的交联二聚体。
图2是一个条形图，根据聚合情况(包含交联和非交联的分子形式)，表明不同SCFmet1-165制剂的相对稳定性。样品和条件与图1中的相同。
图3是一个条形图，根据能被RP-HPLC检测的种类形式，表明不同SCFmet1-165制剂的相对稳定性，这些制剂在加速的稳定性研究中，在高温(45℃)下处理了12周。除了不含氨基酸缓冲剂的样品被从此图删除外，所示的样品与图1中的相同。图上方的点，以小的方形表示，表明在研究开始时样品的纯度。
图4是一张银染的SDS凝胶的照片，显示在45℃下保温4周后，不同SCFmet1-165制剂的交联度。泳道1，(左起)是分子量标准，泳道2是空白；泳道3是一个SCFmet1-165标准；泳道4是空白；泳道5是作为对照的SCFmet1-165液体制剂(图1所述的A5N，浓度为1.5mg/mL)；泳道6是图1所述的HG6M(所含SCF的浓度为1.5mg/mL)；7泳道(K6M)是一个1.5mg/mL SCFmet1-165制剂，其包含10mM磷酸钾，pH6.0，5％甘露醇)；泳道8是一个1.5mg/mL SCFmet1-165制剂，其包含10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，4.5％甘露醇(K6SuM)；泳道9是一个1.5mg/mL SCFmet1-165制剂，其包含10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，0.5％聚乙二醇-8000，和4.5％甘露醇(K6SuPM)。
图5是在(45℃)保温6周后不同SCF制剂的SEC-HPLC色谱。所用样品与图4中所述相同。
图6是45℃保温5周后，不同SCFmetz1-165(1.5mg/mL)制剂的银染SDS凝胶的照片。这些制剂，除非另外说明，与图4所述相同。泳道1，(左起)是分子量标准；泳道2是空白；泳道3是SCFmet1-165标准；泳道4是A5N(SCF液体对照)；泳道5是HG6M；泳道6(HG6PM)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，0.5％PEG-8000，和5％甘露醇；泳道7(HG6SuM)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，0.5％蔗糖，和4.5％甘露醇；泳道8是SCFmet1-165制剂，除了与HG6SuM相同的成分外，还含有0.5％聚乙二醇-8000；泳道9(K6M)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM磷酸钾，pH6.0，和5％甘露醇；泳道10(K6PM)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM磷酸钾，pH6.0，5％甘露醇，和0.5％聚乙二醇-8000；泳道11(K6SuM)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，和4.5％甘露醇；泳道12(K6SuPM)是SCFmet1-165制剂，其含有10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，0.5％聚乙二醇-8000，和4.5％甘露醇。
图7是一个条形图，根据能被离子交换HPLC检测到的种类，表明与图6所述相同的不同SCF制剂在37℃下温育5周后的相对纯度。
                      发明详述
本发明涉及提高了稳定性的SCF制剂。本发明一方面涉及含有组氨酸和/或谷氨酸的冻干的SCF制剂。此冻干的制剂可以任选地包括蔗糖，和任选的填充剂以及渗透性调节剂。另一方面，本发明涉及制备这种制剂的方法。
可以选用任何SCF，优选地使用PCT WO 91/05795中公开和讲授的，最优选地使用大肠杆菌生产的人类重组SCFmet1-165，作为活性组分。
填充剂优选地为甘露醇，但本领域的技术人员会认别出有助于形成具有适当质量和渗透性的冻干“团块”的合适的其他试剂。其他试剂包括NaCl，甘氨酸，聚合物比如葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，和羧甲基纤维素，但是，如前所述，甘露醇是优选的。
SCF制剂优选地包括一种选自组氨酸和谷氨酸的氨基酸，更优选地，该制剂包括组氨酸、谷氨酸和蔗糖。如下面将要看到的，最稳定因而最优选的制剂包括冻干的人类重组SCFmet1-165、组氨酸、谷氨酸、蔗糖填充剂和渗透性调节剂，后者，如前所述，最优选的是甘露醇。pH值优选地调在5.0和6.0之间，最优选地为pH6.0。
一个优选的冻干SCF制剂有10mM组氨酸、5mM谷氨酸、pH6.0、0.5％蔗糖和4.5％甘露醇。另一个优选的冻干SCF制剂有10mM组氨酸、5mM谷氨酸、pH6.0、和5％甘露醇。此外，对所有制剂，优选的活性组分是SCFmet1-165，如前所述，浓度为0.25-12.5mg/mL，其原因在于最大的商业可行性。
本方法涉及本制剂的制备。一方面，本发明涉及制备冻干SCF制剂的方法，此方法包括以下步骤：
(a)将所述SCF在缓冲剂中混合，该缓冲剂含有选自组氨酸和谷氨酸的一种或几种氨基酸，所述缓冲剂的pH值为5.0-6.0；并且
(b)冻干所述混合物。
本方法进一步包括一个或更多下述步骤：在冻干之前将所述混合物的pH值调到pH5.0和pH6.0之间，在冻干之前向混合物添加蔗糖，在冻干之前向混合物添加至少一种选自填充剂和渗透性调节剂的试剂。在后面的步骤中，试剂可以是甘露醇、甘氨酸、NaCl、或聚合物，如前面所列出的那些。
SCF可以应用于与造血、神经和再生有关的病症的治疗中。见WO91/05795，在此引入作为参考，也可见U.S.S.N 07/982,255，也在此引入作为参考。这样，本组合物和制造药物的方法对这些病症的治疗是有益的。这些病症包括但不限于白细胞减少症的治疗，血小板减少症的治疗，贫血症的治疗，在移植过程中增强骨髓的移植能力，在治疗放射、化学和化疗引起的骨髓再生障碍或骨髓抑制时增强骨髓的恢复，获得性免疫缺损综合症，以及化疗时致敏细胞。这些应用和组合物也包括为神经损伤，不育，或肠道受损的哺乳动物提供治疗。
本SCF制剂也可以应用于体外。比如，在一个基因治疗方案中，可能期望将外源DNA转染到造血细胞中，并用本SCF制剂培养此细胞。因此，本发明另一方面包括一种体外培养造血细胞的方法，该方法包括：
(i)将所述细胞置于合适的培养基中，所说的合适的培养基含有按本发明制备的SCF，以及(ii)为所述造血细胞提供合适的生长条件。
更特别地，本发明提供了一种用外源DNA转染造血细胞的方法，该方法包括：(i)用按本发明制备的SCF培养造血细胞，(ii)用外源DNA转染所培养的细胞。造血细胞可以是，比如，骨髓细胞或外周血祖先细胞。
另一方面，本发明提供了一个含有培养骨髓细胞或外周血祖先细胞所需成分的试剂盒，该试剂盒包括：
(i)本发明的SCF制剂；和
(ii)适于配制用来培养骨髓细胞或外周血祖  细胞的培养基的成
    分。
这里提到的应用或产品可能涉及施用或包含至少一种额外的因子，该因子选自EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IGF-1、LIF、干扰素(比如α，β，gamma或共同性)，神经营养因子(比如BDNF、NT-3、CTNF或noggin)，其他多功能生长因子(比如干细胞增生因子和全能干细胞因子)，成纤维细胞生长因子(比如FGF)，以及上述分子的类似物、融合分子或其他衍生物。例如，人们发现与G-CSF结合的SCF可以使外周血祖  细胞在体内活化。在体外，例如，与G-CSF、IL-3和IL-6结合的SCF有利于外周血细胞的扩张。
本例中应用的材料和方法是首次被描述的。实施例1表明，与用其他化合物维持pH值的SCF制剂相比，用氨基酸缓冲的SCF制剂对时间更为稳定。实施例2表明，蔗糖可以提高氨基或非氨基酸制剂中SCF的稳定性。它也再一次表明，使用氨基酸缓冲剂可以提高稳定性。实施例3表明本制剂的生物学活性。
                         材料和方法
                   制备重组人类SCFMET1-165
本制剂研究中的SCFmet1-165是在大肠杆菌(K-12菌株)中生产的。其核酸序列和氨基酸序列如下所示。发酵之后，裂解细胞糊状物。SCF被增溶、重折叠和氧化，并用若干层析步骤纯化。蛋白的表观分子量大约为18,500。ATGGAAGGTA TCTGCCGTAA CCGTGTTACT AACAACGTTA AAGACGTTACM  E  G   I  C  R  N   R  V  T   N  N  V   K  D  V  TTAAACTGGTT GCTAACCTGC CGAAAGACTA CATGATCACC CTGAAATACGK  L  V   A  N  L   P  K  D  Y   M  I  T   L  K  YTTCCGGGTAT GGACGTTCTG CCGTCTCACT GCTGGATCTC TGAAATGGTTV  P  G  M   D  V  L   P  S  H   C  W  I  S   E  M  VGTTCAGCTGT CTGACTCTCT GACTGACCTG CTGGACAAAT TCTCTAACATV  Q  L   S  D  S  L   T  D  L   L  D  K   F  S  N  ICTCTGAAGGT CTGTCTAACT ACTCTATCAT CGACAAACTG GTTAACATCGS  E  G   L  S  N   Y  S  I  I  D   K  L   V  N  ITTGACGACCT GGTTGAATGC GTTAAAGAAA ACTCTTCTAA AGACCTGAAAV D  D  L   V  E  C   V  K  E   N  S  S  K   D  L  KAAATCTTTCA AATCTCCGGA ACCGCGTCTG TTCACTCCGG AAGAATTCTTK  S  F    K  S P  E   P  R  L   F  T  P   E  E  F  FCCGTATCTTC AACCGTTCCA TCGACGCTTT CAAAGACTTC GTTGTTGCTTR  I  F   N  R  S   I  D  A  F   K  D  F   V  V  ACCGAAACCTC CGACTGCGTT GTTTCCTCCA CCCTGTCTCC GGAAAAAGACS  E  T  S   D  C   V  V  S  S   T  L  S  P  E   K  DTCCCGTGTTT  CGGTTACCAA ACCGTTCATG CTGCCGCCGG TTGCTGCTTAAS  R  V    S  V  T  K  P   F  M   L  P  P   V  A  A  *
                      制备制剂缓冲液
制剂缓冲液由浓缩贮液制备。缓冲液由琥珀酸钠、磷酸钾、谷氨酸或组氨酸组成，必要时用HCl或NaOH调到所需的pH值。
                      交换缓冲液
SCF保存于10mM乙酸钠，pH5.0，140mM NaCl中。通过透析将蛋白换到制剂缓冲液中，透析在4℃下进行，使用SpectraPor 7透析膜，其阻断分子量大约为3,500。每个样品用制剂缓冲液透析三次，每次所用缓冲液的体积至少为样品的100倍。透析之后，从浓缩贮液中加入PEG-8000。可选地，缓冲液的交换可以由渗滤(diafiltration)完成，用GPC柱或其他合适的方法脱盐。
改变缓冲液后，SCF浓度由280nm吸收值决定并通过稀释调到所需的值。SCF浓度的范围可以从0.25mg/mL或更低到12.5mg/mL或更高。(SCF浓度在下面各实施例中各不相同)。在一个层流通风橱(laminarflow hood)中，用0.22微米Gelman Acrodisc注射过滤器将样品过滤除菌并注入3毫升Type I玻璃瓶中。冻干塞于层流通风橱内置于瓶子的上方。
冻干，将样品装入VirTis Genesis 12 EL(VirTis，Gardiner，N.Y.12526)冷冻干燥器中，冷冻干燥器先预冷至样品室温度约4℃。样品快速冷冻(约1℃/分钟直到-50℃)并维持此温度至少2小时。在一个任选的使甘露醇结晶的步骤中，搁板温度升至-25℃2-3小时，然后以10℃/小时的速率冷却至-50℃。在另外又保持至少2小时之后，施加约100mTorr的真空。搁板温度升至-45℃到-10℃以进行首次干燥。(首次干燥的温度对下面各个实施例来说是特异的)。首次干燥持续24-48小时。随后，搁板温度升至+20℃到+25℃以进行第二次干燥，真空度尽可能地低(典型地为约25mTorr)。第二次干燥进行24-72小时。当第二次干燥完成时，在真空(＜/＝25mTorr)下，样品是塞上塞子的从冷冻干燥室中取走药瓶。为了进行加速稳定性研究，一些样品移至恒温箱中贮存。其他样品移到-70℃冰箱中，用来作为对照。大批的药瓶存放在4℃下。在进行分析时，样品用无菌的WFI重建至所需浓度。
SDS-PAGE。SDS-PAGE用标准方法完成(Laemmli，Nature227：680-685(1970))。用单一的15％浓度聚丙烯酰胺凝胶进行分离。上样时，每孔加入7.5μg样品。凝胶用考马斯蓝染色并用Molecular Dynamics Personal Densitometer扫描。扫描之后，凝胶或被干燥，或用银染料重染。
反相HPLC(RP-HPLC)。RP-HPLC用Waters 625 LC系统完成，使用来自Vydac的5微米C4柱，孔径300A。蛋白注入用45.6％的乙腈。0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的柱中，用45.6-64.6％乙腈线性梯度，0.1％TFA洗脱。蛋白峰用220nm吸收值检测。
筛析(SEC)-HPLC。SEC-HPLC用Waters 625 LC系统在室温下完成，使用TSK Progel 5P-5PW柱。样品用20mM乙酸钠，pH4.8缓冲液稀释6倍并加到用同一缓冲液平衡的柱上。SCF用0-0.5M的Na2SO4线性梯度洗脱。蛋白用230nm吸收值检测。
生物学活性。生物活性用生长因子依赖型人巨核细胞系UT-7检测。由于施用SCF，一部分细胞重新进入细胞周期并到达S相(DNA合成)。本试验基于这个反应，用3H-胸腺嘧啶的吸收来测定。UT-7细胞被冲洗以除去外源生长因子，在存在实施例3中所述各种不同SCF样品的条件下铺成平板。三天之后，施加3H-胸腺嘧啶六个小时。掺入DNA的量通过清洗，收获和计量附着在玻璃纤维滤器上的细胞的放射性来测量。活力以待测样品的质量单位，通过与标准曲线的比较来决定。
实施例1
本实施例表明，以氨基酸缓冲的制剂可以提高SCF的稳定性。它还表明，使用氨基酸的组合物可以进一步提高稳定性。在本实施例中，在两个不同的pH值下，不含氨基酸的制剂与使用了氨基酸的制剂进行了比较。
pH5.0S5M(10mM琥珀酸钠，pH5.0，5％甘露醇) pH6.0
G5M(10mM谷氨酸，pH5.0，5％甘露醇) H6M(10mM组氨酸，pH6.0，5％甘露醇
GH5M(10mM谷氨酸，8.35mM组氨酸，pH5.0，5％甘露醇) HG6M(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，5％甘露醇)
对所有的样品，SCF的浓度为6.0mg/mL。所有的制剂在同样的条件下冻干；本研究中首次干燥的温度是-25℃。用一个液体制剂(也含6.0mg/mL SCF)作为对照。该液体制剂(A5N)是10mM乙酸钠，pH5.0，140mM NaCl。
样品在高温(45℃)下温育至少4周。一些样品在45℃下保持12周。在此时程结束时，分析样品的稳定程度。
结果如图1、2、3所示，它们表明：(1)含有氨基酸的制剂比不用氨基酸缓冲的对时间更为稳定；(2)含氨基酸的制剂在pH6.0下比在pH5.0下表现更好；(3)含有组氨酸和谷氨酸组合物的制剂，在pH6.0下，表现最好，通过不同的分析手段可以看出，它们在SCF分子种类与起始材料之间差异(片段、聚合物等)的提高的比率是最低的。
图1是一个条形图，如前所述，通过SDS-PAGE的测定，表明在加速温度(45℃)下温育后的交联SCF产物(即SCF寡聚物，一种退化产物)的交联度。可以看出，含有氨基酸缓冲剂的冻干制剂比含有琥珀酸钠缓冲剂的制剂(S5M)包含更少的交联二聚体。一般来说，在pH6.0的制剂中(H6M和HG6M)可以比pH5.0的制剂中有更少的二聚体。
图2是一个条形图，如前所述，通过分子筛层析的测定，表明不同制剂中非共价聚合的程度。可以看出，含有琥珀酸pH5.0缓冲剂的制剂具有最高的聚合百分比(大于3％)，并且再一次地，与图一所示结果相一致，组氨酸和谷氨酸缓冲的SCF制剂在pH6.0下(HG6M)具有最低的聚合百分比(小于1％)。
图3是一个条形图，表明不同SCF制剂的纯度百分比(即前述反相HPLC测出的主峰的百分比)。此测量是在高温下温育12周后进行的。此图表明，含有组氨酸、谷氨酸和甘露醇，pH6.0的SCF制剂HG6M，具有最高的纯度百分比，达到受试样品的90％以上(由上述方法测定)。纯度第二高的也是一种氨基酸组合物缓冲的制剂，GH5M，纯度也达到了90％以上。注意液体对照(A5N)的纯度在60％和70％之间。RP-HPLC降解，一种导致溶液不稳定的主要因素，因本组合物和方法的运用而基本基上被减弱了。
实施例2
此实施例分两步表明蔗糖可以提高受试样品的稳定性。第一个研究表明蔗糖提高了含非氨基酸缓冲剂缓冲的SCF制剂的稳定性。此外，在含非氨基酸缓冲剂中包含的蔗糖、聚乙二醇也对稳定性有所贡献。本研究还表明，使用了组氨酸和谷氨酸缓冲剂的SCF制剂比非氨基酸缓冲的制剂更为稳定，即使后者含有其他的稳定剂。
第二个研究表明蔗糖也能提高氨基酸缓冲的制剂的稳定性。但是，聚乙二醇-8000对这些制剂的稳定性不起作用。
研究1。这里，所有制剂的pH值都是6.0。氨基酸缓冲的制剂与磷酸钾，+/-蔗糖和+/-聚乙二醇8000缓冲的制剂进行比较。
氨基酸缓冲的HG6M(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，5％甘露醇) 磷酸钾缓冲的K6M(10mM磷酸钾，pH6.0，5％甘露醇)
K6SuM(10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，4.5％甘露醇)
K6SuPM(10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，0.5％PEG-8000，4.5％甘露醇)
所有制剂使用1.5mg/mL的SCFmet1-165。所有制剂在前述条件下冻干，首次干燥的温度为-25℃。用一个液体制剂(也为1.5mg/mLSCFmet1-165)作为对照，它含有10mM乙酸钠，pH5.0，140mMNaCl。
图4显示一块45℃下温育4周后的样品的银染SDS凝胶。在磷酸钾缓冲的制剂中，K6SuPM显示最小的高分子量带，说明SCF的交联(即共价二聚)程度最低。这表明对于磷酸盐缓冲的制剂，蔗糖和聚乙二醇对其稳定性有贡献。同时，图4也显示，含有氨基酸缓冲剂的制剂具有最少的高分子量物质，说明组氨酸/谷氨酸制剂比磷酸钾/蔗糖/聚乙二醇制剂更为稳定。
图5显示上述样品(HG6M、K6SuM、K6SuPM、和液体对照A5N)的筛析HPLC结果。样品在45℃下温育6周。可以看出，HG6M显示出一个大峰，和一个小峰(含聚合物)。基本相反，磷酸钾缓冲的制剂有若干个峰。
研究2。在本研究中，在氨基酸缓冲的制剂中加入蔗糖和聚乙二醇，以磷酸钾缓冲的制剂作为对照。
氨基酸缓冲的HG6M(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，5％甘露醇) 磷酸钾缓冲的K6M(10mM磷酸钾，pH6.0，5％甘露醇)
HG6PM(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，0.5％PEG-8000，5％甘露醇) K6PM(10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％PEG-8000，5％甘露醇)
HG6SuM(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH 6.0，0.5％蔗糖，4.5％甘露醇) K6SuM(10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，4.5％甘露醇)
H6SuPM(10mM组氨酸，5mM谷氨酸，pH6.0，0.5％蔗糖，0.5％PEG-8000，4.5％甘露醇) K6SuPM(10mM磷酸钾，pH6.0，0.5％蔗糖，0.5％PEG-8000，4.5％甘露醇)
类似于本实施例的研究1，所有制剂都使用1.5mg/mL的SCFmet1-165。所有制剂按上面所述条件冻干，首次干燥的温度是-35℃。用一个液体制剂(也含1.5mg/mL  SCFmet1-165)作对照，它含有10mM乙酸钠，pH5.0，140mM NaCl。
图6显示在45℃高温下温育5周后的样品的银染SDS凝胶。在特定的pH值(pH6.0)下，与相应的磷酸钾缓冲的制剂相比，组氨酸和谷氨酸组合物缓冲的制剂显示非常少的交联。加入0.5％的蔗糖可以显著地提高组/谷氨酸缓冲的以及磷酸盐缓冲的制剂的稳定性。加入聚乙二醇8000对所见的交联度没有影响；这可能是由于首次干燥的温度较低的缘故(这里为-35℃，研究1中的样品为-25℃)。
图7显示用离子交换层析对同样制剂所作的对比。在加速的温育条件下，组/谷氨酸缓冲的制剂再一次显示出比相应的磷酸盐缓冲的制剂有更高的稳定性。加入蔗糖(0.5％)可以同时提高氨基酸和磷酸盐缓冲的制剂的稳定性。
实施例3
生物学活性。所有含氨基酸缓冲剂中的样品表现出与溶液中的SCF相似的生物学活性。上述来自实施例1中的样品在4周(2-8℃下)和一年(2-8℃)后测试其生物学活性，如上所述，使用UT-7生物试验法。下表显示不同样品中生物活性材料的浓度。
可以看出，所有样品中的生物学活性都是与起始材料中的可比的。
样品 浓度(mg/ml)4周 浓度(mg/ml)1年
起始材料，贮存于-80℃     6.2     4.3
    A5N     6.5     3.9
    S5M     6.5     3.9
    G5M     5.7     4.4
    GH5M     6.5     4.6
    H6M     5.7     6.2
    HG6M     6.0     5.7
本发明是依照优选方案描述的，但应理解本领域的技术人员会对其改变或修改。因此，这意味着所附的权利要求书涉及全部的所要求的发明范围内的等同变化。
                      序列表(1)一般信息
(i)申请人：AMGEN INC.
(ii)发明名称：新的干细胞因子制剂和方法
(iii)序列个数：2
(iv)相关地址：
  (A)地址：Amgen Inc.
  (B)街道：1840 Dehavilland Drive
  (C)城市：Thousand Oaks
  (D)州：California
  (E)国家：美国
  (F)ZIP：91320
(v)计算机可读方式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patent In Release #1.0，Version#1.25
(vi)当前申请日期：
  (A)申请号：
  (B)提交日期：
  (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
  (A)姓名：Pessin，Karol M.
  (C)参考/案卷号：A-276(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：501碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描还：SEQ ID NO：1：ATGGAAGGTA TCTGCCGTAA CCGTGTTACT AACAACGTTA AAGACGTTAC TAAACTGGTT   60GCTAACCTGC CGAAAGACTA CATGATCACC CTGAAATACG TTCCGGGTAT GGACGTTCTG  120CCGTCTCACT GCTGGATCTC TGAAATGGTT GTTCAGCTGT CTGACTCTCT GACTGACCTG  180CTGGACAAAT TCTCTAACAT CTCTGAAGGT CTGTCTAACT ACTCTATCAT CGACAAACTG  240GTTAACATCG TTGACGACCT GGTTGAATGC GTTAAAGAAA ACTCTTCTAA AGACCTGAAA  300AAATCTTTCA AATCTCCGGA ACCGCGTCTG TTCACTCCGG AAGAATTCTT CCGTATCTTC  360AACCGTTCCA TCGACGCTTT CAAAGACTTC GTTGTTGCTT CCGAAACCTC CGACTGCGTT  420GTTTCCTCCA CCCTGTCTCC GGAAAAAGAC TCCCGTGTTT CGGTTACCAA ACCGTTCATG  480CTGCCGCCGG TTGCTGCTTA A                                            501(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：166氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val
1                 5                  10                  15
Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys
             20                  25                  30
Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu
         35                  40                  45
Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe
     50                  55                  60
Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Ash Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu
65                   70                  75                  80
Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser
                 85                  90                  95
Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr
            100                 105                 110
Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys
        115                 120                 125Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr
130                 135                 140Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met14S                 150                 155                 160Leu Pro Pro Val Ala Ala
            165

Claims (12)

1.含有10mM组氨酸的冻干的SCF制剂，其中所述制剂的pH值为5.0-6.0。
2.含有5mM谷氨酸的冻干的SCF制剂，其中所述制剂的pH值为5.0-6.0。
3.权利要求1或2中的冻干的SCF制剂，其还含有蔗糖。
4.权利要求1或2中的冻干的SCF制剂，其还含有甘露醇。
5.含有10mM组氨酸和5mM谷氨酸的冻干的SCF制剂，其中所述制剂的pH值为5.0-6.0。
6.权利要求5中的冻干的SCF制剂，其还含有蔗糖。
7.权利要求5中的冻干的SCF制剂，其还含有甘露醇。
8.冻干的SCF制剂，其含有10mM组氨酸、5mM谷氨酸和任选的0.5％蔗糖以及4.5％甘露醇。
9.制备冻干的SCF制剂的方法，包括以下步骤：
(a)将所述SCF在缓冲剂中混合，该缓冲剂含有选自组氨酸和谷氨酸的一种或几种氨基酸，所述缓冲剂的pH值为5.0-6.0；并且
(b)冻干所述混合物。
10.权利要求9中的方法，进一步包括在冻干之前在所述制剂中加入蔗糖。
11.权利要求10中的方法，进一步包括在冻干之前在所述制剂中加入选自填充剂和渗透性调节剂的至少一种试剂。
12.权利要求11中的方法，其中所述试剂为甘露醇。
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