CN110511949A - 一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法 - Google Patents

一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法。一种提高木糖利用率基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过扩增技术对该基因进行扩增，构建了含有该基因的重组载体，并通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中获得大肠杆菌工程菌，增强了大肠杆菌中木糖异构酶的表达水平，提高了大肠杆菌代谢木糖的能力，能够显著提高产物中赖氨酸的浓度，提高糖酸转化率。

Description

一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法。
背景技术
秸秆是现有农业中收获籽实后的剩余部分，其中含有大量的糖类和各种有益元素，如何对秸秆中的营养成分进行回收利用，获得可再生的生物资源是现在研究的重点。
现有技术中，秸秆营养成分的回收具体包括作为粗饲料作为牛羊等动物的食物，另一方面将秸秆通过一定的方式水解获得秸秆水解液，该秸秆水解液中含有较高的葡萄糖和木糖，可以作为碳源供微生物生长，并通过微生物的代谢过程，将秸秆水解液中的葡萄糖和木糖转化为附加值更高的产品，比如利用大肠杆菌的代谢过程生产相应的氨基酸，能够大大提高秸秆的利用价值。
但是，在利用大肠杆菌代谢过程代谢秸秆水解液获得赖氨酸的过程中，大肠杆菌利用木糖能力较弱，代谢效率低，无法达到转化要求。
发明内容
针对现有技术中存在的大肠杆菌利用木糖能力较弱，代谢效率低，无法达到转化要求的技术问题，本发明所提供的技术方案是：
一种提高木糖利用率基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含有所述的提高木糖利用率基因的重组载体、重组细胞。
所述提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用。
一种提高木糖利用率基因的制备方法，具体包括以下步骤：
获取枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌基因；并根据枯草芽孢杆菌168P43和大肠杆菌木糖异构酶基因序列设计扩增引物；
以枯草芽孢杆菌168基因为模板对P43基因进行扩增，获得P43启动子；
以大肠杆菌基因基因为模板，对大肠杆菌木糖异构酶基因进行扩增，获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段；
以所述P43启动子和大肠杆菌木糖异构酶基因片段为模板，采用重叠扩增法获得提高木糖利用率基因。
所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用，所述应用的步骤如下：
将所述提高木糖利用率基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得重组载体；
将所述重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌。
有益效果：
本申请首次提供了一种提高木糖利用率基因，并通过扩增技术对该基因进行扩增，构建了含有该基因的重组载体，并通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中获得大肠杆菌工程菌，增强了大肠杆菌中木糖异构酶的表达水平，提高了大肠杆菌代谢木糖的能力，能够显著提高产物中赖氨酸的浓度，提高糖酸转化率。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供了一种提高木糖利用率基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明实施例还提供了含有所述的提高木糖利用率基因的重组载体、重组细胞。
本发明实施例还提供了所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用。
本发明实施例提供了一种提高木糖利用率基因的制备方法，具体包括以下步骤：
获取枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌基因；并根据枯草芽孢杆菌168P43和大肠杆菌木糖异构酶基因序列设计扩增引物；
以枯草芽孢杆菌168基因为模板对P43基因进行扩增，获得P43启动子；
以大肠杆菌基因基因为模板，对大肠杆菌木糖异构酶基因进行扩增，获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段；
以所述P43启动子和大肠杆菌木糖异构酶基因片段为模板，采用重叠扩增法获得提高木糖利用率基因。
其中获得P43启动子的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，扩增条件优选为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min，复性：55℃，30s，延伸：72℃，30s，30循环；后延伸：72℃，10min。
其中获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，扩增条件优选为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：57℃，30s；延伸：72℃，1min；30循环；后延伸：72℃，10min。
其中所述重叠扩增法中扩增引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：56℃，30s；延伸：72℃，2min；30循环；后延伸：72℃，10min。
本发明实施例提供了所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用，所述应用的步骤如下：
将所述提高木糖利用率基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得重组载体；
将所述重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌。
其中所述酶切过程中的酶切体系为：限制性内切酶EcoRI和HindIII、内切酶缓冲溶液，双蒸水。
其中所述阳性筛选具体包括以下步骤：将所述感受细胞涂布在含有25μg/mL链霉素的平板培养基上进行培养，获得单菌落即为含有提高木糖利用率基因的大肠杆菌工程菌。
实施例1
采用上海生工生物细菌基因组提取试剂盒对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌进行特定基因的提取，具体操作如下：
各取过夜培养的枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌菌液1mL，分别加入至1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体；加入180μL消化缓冲液，再加入20μL蛋白酶K溶液，震荡混匀，并在56℃水浴1h至细胞完全裂解。
向离心管中加入BD(磷酸盐)缓冲液200μL，并充分颠倒混匀，再加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀获得悬浮液；
将吸附柱放入上述离心管中，用移液器将悬浮液中半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉离心管中的废液。
将吸附管放回离心管中，加入PW溶液(Tris缓冲盐溶液)500μL，10000rpm离心30s倒掉滤液；然后再加入清洗溶液500μL，10000rpm离心30s倒掉滤液。
取出吸附柱，放入新1.5mL离心管中，加入50μL无菌去离子水，静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。
以上述提取出来的DNA为模板，采用扩增技术对枯草芽孢杆菌168P43启动子和大肠杆菌木糖异构酶基因序列进行扩增，具体方法包括以下步骤：
扩增引物的设计：通过引物设计原则和多种计算机程序，设计枯草芽孢杆菌168P43启动子扩增引物，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，引物序列为：引物1P43-F，SEQ ID NO.2和引物2P43-R，EQ ID NO.3，见表1，并在该扩增引物的3’添加EcoRI酶切位点，5’端设计大肠杆菌木糖异构酶同源臂，长度为25bp；设计大肠杆菌木糖异构酶扩增引物，引物的核苷酸序列为引物3xylA-F，EQ ID NO.4和引物4lA-R，EQ ID NO.5，见表1，在其3’端设计P43启动子同源臂，长度25bp，5’端引物添加HindIII酶切位点。
表1 扩增引物核苷酸序列
引物名称 引物序列(5’—3’)
SEQ ID NO.2 GAATTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCG
SEQ ID NO.3 GTCAAAATAGGCTTGCATGTGTACATTCCTCTCTT
SEQ ID NO.4 AAGAGAGGAATGTACACATGCAAGCCTATTTTGAC
SEQ ID NO.5 AAGCTTTTATTTGTCGAACAGA
枯草芽孢杆菌168P43启动子的扩增：以提取的枯草芽孢杆菌168DNA为模板，在扩增体系为：引物1P43-F 2μL，引物2P43-R 2μL，模板2μL，2xTaq PCR Master Mix(高保真DNA聚合酶，购自天根生化)25μL，ddH2O补齐至50μL；并在扩增条件为：预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min，复性：55℃，30s，延伸：72℃，30s，30循环；后延伸：72℃，10min的条件下进行PCR扩增，获得168P43启动子扩增产物，-20℃保存。
大肠杆菌木糖异构酶基因片段的扩增：以提取的大肠杆菌DNA为模板，扩增体系为：引物3xylA-F 2μL，引物4lA-R 2μL，模板2μL，2xTaq PCR Master Mix(高保真DNA聚合酶，购自天根生化)25μL，ddH2O补齐至50μL；并在扩增条件为：预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：57℃，30s；延伸：72℃，1min；30循环；后延伸：72℃，10min的条件下进行PCR扩增，获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段(xylA)扩增产物，-20℃保存。
目的基因提高木糖利用率基因(P43-xylA)片段构建：利用重叠PCR法进行融合片段构建，以扩增得到的P43、xylA基因为模板，扩增体系为：引物1P43-F 2μL，引物4lA-R2μL，模板2μL，2xTaq PCR Master Mix(高保真DNA聚合酶，购自天根生化)25μL，ddH2O补齐至50μL；并在扩增条件为：预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：56℃，30s；延伸：72℃，2min；30循环；后延伸：72℃，10min的条件下进行PCR扩增，获得提高木糖利用率P43-xylA基因，获得的基因序列为SEQ ID NO.1。
实施例2
对上述获得的提高木糖利用率P43-xylA基因进行纯化回收扩增，具体包括以下步骤：
提高木糖利用率P43-xylA基因纯化：
在获得提高木糖利用率P43-xylA基因的PCR反应液中加入5倍体积的B3缓冲液充分混匀，8000rpm离心30s，倒掉废液，加入500μLWash溶液，9000rpm离心30s，倒掉废液，重复上一步，空柱9000rpm离心1min，将吸附柱放入1.5mL离心管中，加入40μL无菌去离子水，室温静置1min，离心1min，-20℃保存DNA溶液。
重组载体的构建：
将上述提纯后的提高木糖利用率P43-xylA基因片段利用EcoRI和HindIII限制性内切酶进行双酶切，酶切体系为：10x酶切buffer1μL，限制性内切酶各1μL，DNA片段4μL，ddH2O 3μL，37℃水浴加热反应30min，酶切片段切胶回收：使用生工生物胶回收试剂盒回收酶切产物，操作步骤按照试剂盒说明书进行；回收产物-20℃保存。
表达载体pCDFDuet1(大肠双表达质粒载体质粒)以同样的酶切体系进行双酶切，并进行胶回收-20℃保存。
将上述酶切胶回收后的43-xylA基因片段和表达载体pCDFDuet1使用T4DNA连接酶进行表达载体与目的片段连接，连接体系为10μL：T4DNA Ligase(DNA连接酶)1μL，10xT4DNALigase Buffer(DNA连接缓冲液)1μL，P43-xylA 1μL，pCDFDuet1 1μL，在室温条件下链接反应10min，获得重组载体pCDFDuet1-P43-xylA。
将上述重组载体pCDFDuet1-P43-xylA通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体操作为：将大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中处理后时菌细胞膨胀成球形，并将重组载体pCDFDuet1-P43-xylA制备成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物，使得该复合物粘附在洗标表皮，在42℃条件下进行热冲击处理，使得重组载体pCDFDuet1-P43-xylA进入大肠杆菌感受态细胞。
将上述过程获得细胞进行阳性克隆筛选，将细胞涂布在含有25μg/mL链霉素的平板培养基上进行培养，挑取出平板上长出的单菌落，即为含有提高木糖利用率基因的大肠杆菌工程菌。
实施例3
结构表征：
挑取抗性平板上长出单菌落，接种至含25μg/mL链霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，利用Taq PCR Master Mix聚合酶进行菌落PCR验证，扩增体系为50μL：2xTaqPCRMaster Mix 25μL，引物P43-F 2μL，引物xylA-R 2μL，模板2μL，ddH2O补齐至50μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃1min，57℃30s，72℃1min，30循环；72℃延伸10min，-20℃保存。
实施例4
含有目的基因提高木糖利用率P43-xylA基因大肠杆菌工程菌发酵验证：
培养基的配置比例为：秸秆水解液(还原糖40g/L，含木糖25g/L)、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、生物素5mg/L、维生素B1 2mg/L。流加秸秆水解液，流加硫酸铵浓度40g/dL。
发酵过程控制：罐初始条件：PH控制在6.7，初始转速300rpm，风量0.5L/min、罐压0.10Mpa、溶氧接种前校准80％；溶氧的控制：整个发酵过程溶氧控制范围在15～25％。罐压保持不变，先调节风量，最大风量1.0L/min，450rpm以上调风量到0.75L/min，600rpm提风量到1.0L/min，转速则根据溶氧情况进行调整；补糖控制：控制停糖时间在1-2min左右；硫酸铵控制：整个发酵培养过程硫酸铵浓度控制在0.12～0.18g/dl左右，尽量不要低于0.12g/dl，也不要高于0.18g/dl；硫酸铵的消耗趋势与糖消耗趋势基本一致。
以不含目标基因的大肠杆菌(常规菌株)作为对照，在上述发酵控制的条件下发酵36h，测定赖氨酸和木糖的含量，并计算其转化率，结果如表2所示：
表2 发酵结果对比
菌株 赖氨酸浓度(g/dL) 木糖消耗(g) 转化率(％)
常规菌株 10.8 366.85 55.2
大肠杆菌工程菌 11.1 380.93 60.1
由表2可知，含有目的基因的大肠杆菌工程菌对木糖代谢显著提高，赖氨酸的浓度和转化率相应的提高，说明通过利用枯草芽孢杆菌168的强表达启动子P43，与木糖代谢关键酶木糖异构酶进行融合，增强木糖异构酶基因的表达水平，使木糖代谢能力提高，提高了产物浓度及糖酸转化率，发酵成本低，提高了秸秆的利用价值。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 山东寿光巨能金玉米开发有限公司、寿光金远东变性淀粉有限公司、寿光金玉米生物科技有限公司、临清德能金玉米生物有限公司
<120> 一种提高木糖利用率基因、重组载体、重组细胞及应用方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
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acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagagaggaa tgtacacatg caagcctatt ttgac 35
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagcttttat ttgtcgaaca ga 22

Claims (10)

1.一种提高木糖利用率基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述的提高木糖利用率基因的重组载体、重组细胞。
3.权利要求1所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用。
4.一种提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
获取枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌基因；并根据枯草芽孢杆菌168 P43和大肠杆菌木糖异构酶基因序列设计扩增引物；
以枯草芽孢杆菌168基因为模板对P43基因进行扩增，获得P43启动子；
以大肠杆菌基因基因为模板，对大肠杆菌木糖异构酶基因进行扩增，获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段；
以所述P43启动子和大肠杆菌木糖异构酶基因片段为模板，采用重叠扩增法获得提高木糖利用率基因。
5.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述获得P43启动子的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min，复性：55℃，30s，延伸：72℃，30s，30循环；后延伸：72℃， 10min。
6.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：57℃，30s；延伸：72℃，1min；30循环；后延伸：72℃， 10min。
7.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述重叠扩增法中扩增引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：56℃，30s；延伸：72℃，2min；30循环；后延伸：72℃，10min。
8.根据权利要求3所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
将所述提高木糖利用率基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得重组载体；
将所述重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌。
9.根据权利要求8所述的应用步骤，其特征在于，所述酶切过程中的酶切体系为：
限制性内切酶EcoRI和HindIII、内切酶缓冲溶液，双蒸水。
10.根据权利要求8所述的应用步骤，其特征在于，所述阳性筛选具体包括以下步骤：
将所述感受细胞涂布在含有25μg/mL链霉素的平板培养基上进行培养，获得单菌落记为含有提高木糖利用率基因的大肠杆菌工程菌。
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