CN110484533A - 一种用于dna大量提取的水稻叶片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，具体涉及水稻叶片DNA提取技术领域，制备方法流程如下：S1、水稻叶片装入2mL离心管；S2、将装有叶片的2mL离心管置于干燥箱中烘干；S3、从干燥箱中取出离心管，用塑料研磨棒进行研磨。本发明简化了操作程序，提高了工作效率，且避免受冻及易被冻伤事件的发生，适合长时间作业，可随时使用，避免了液氮法需购置液氮及其特殊保存等复杂环节，其在提取规模上具有较强的广泛性和实用性，既适合少量操作，也适用于大批量进行，另外避免了液氮法中液氮的使用费用高、操作繁琐等弊端，同时烘干法对叶片的干燥均匀充分，较液氮法更易于研磨粉细，更有利于DNA的浸出。
Description
技术领域
本发明涉及水稻叶片DNA提取技术领域，更具体地说，本发明涉及一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，其栽种面积约占粮食作物总面积的1/3，产量也约占粮食产量的一半，为中国60％以上的人口提供口粮，水稻的研究工作对我国的粮食生产及安全有着极为重要的意义，随着现代分子生物学的发展，分子技术早已成为水稻研究的重要手段，以DNA作为研究对象最为广泛，如基于DNA的基因定位、基因克隆及各种分子标记的开发与应用等，涉及水稻DNA的提取方法，数量颇多，较早的主要是传统的CTAB法和SDS法，随着专家学者的不断探索实践，以上两种又各自衍生出了一些新的提取方法，甚至脱离了传统CTAB及SDS方法的束缚，发展了全新的提取方法，如TE煮沸法、NaOH法、TPS法和PCR缓冲法等等，水稻的DNA提取方法不计其数，但是，无论哪种提取方法，从操作程序步骤上来论，都可简要地概括为两大部分，一是材料(如叶片、种子等)的制备，二是提取试剂的加入。
叶片是水稻最常用、最易于进行DNA的提取器官，叶片的磨细制备工艺，目前主要有液氮冷冻后研磨、无需冷冻直接研钵研磨及真空冷冻干燥后研磨等三种，其中，无需冷冻直接研钵研磨操作繁琐，费工费时，效率低下，少有使用，干燥冷冻法仪器昂贵，一些实验室根本不具备使用条件，且其干燥冷冻效果也不太令人满意，以上三种以液氮冷冻方法综合效果为佳，也较为实用和常用，利用液氨冷冻叶片，可使叶片受冻变脆利于研磨，同时在低温条件下也更利于组织细胞保护，然而，在实际工作中，使用液氮处理叶片，也表现出一些不便：(1)在液氮冷冻叶片之前，需将叶片的附着水进行擦干去除，以免叶片冷冻不充分，影响后续研磨效果，无疑这一操作步骤，也制约着工作效率的提高；(2)在常压下，液氮温度为-196℃，稍有不慎易被冻伤，且由于温度极低，不宜长时间接触；(3)为操作方便，使用过程基本置于无封闭的容器环境中，而液氮极易挥发，有效利用率低，在常规条件下也不易储存；(4)样品需浸没在液氮中受冻，使用量大，成本较高，甚至某些地方使用者附近无液氮销售，更是增加了使用困难，鉴于以上液氮使用存在的一些不足，故需要开发一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，通过避免使用液氮法还需将叶片附着水去除以便解决冷冻充分及后续良好研磨效果，简化了操作程序，提高了工作效率，且避免受冻及易被冻伤事件的发生，适合长时间作业，可随时使用，避免了液氮法需购置液氮及其特殊保存等复杂环节，其在提取规模上具有较强的广泛性和实用性，既适合少量操作，也适用于大批量进行，另外所需设备简单易得，避免了液氮法中液氮的使用费用高、操作繁琐等弊端，同时通过烘干法对叶片的干燥均匀充分，较液氮法更易于研磨粉细，更有利于DNA的浸出。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，具体制备方法流程如下：
S1、水稻叶片装入2mL离心管；
S2、装有叶片的2mL离心管置于干燥箱中烘干；
S3、从干燥箱中取出离心管，用塑料研磨棒进行研磨。
在一个优选的实施方式中，在步骤S1中的水稻叶片为新鲜叶片，用量为0.3-0.4g。
在一个优选的实施方式中，在步骤S2中设置5个烘干温度，分别是50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。
在一个优选的实施方式中，在步骤S2中的烘干时间为24h。
在一个优选的实施方式中，在步骤S2中每个温度设置三次重复。
在一个优选的实施方式中，从干燥箱中取出离心管，放在离心管架上，达到固定离心管的目的，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎叶片成粉状。
在一个优选的实施方式中，以水稻新鲜叶片直接液氮冷冻研磨为对照。
在一个优选的实施方式中，叶片制备好后，加入DNA提取液对水稻DNA进行提取，然后将提取到的DNA进行PCR扩增，对DNA提取质量进行分析。
在一个优选的实施方式中，以烘干法对叶片进行制备，其DNA提取质量最佳的烘干温度为50℃
本发明的技术效果和优点：
1、本发明提供的烘干法是将新鲜叶片直接装入离心管内，避免使用液氮法还需将叶片附着水去除以便解决冷冻充分及后续良好研磨效果，简化了操作程序，提高了工作效率；
2、本发明提供的烘干法不涉及液氮的利用，避免受冻及易被冻伤事件的发生，适合长时间作业；
3、本发明提供的烘干法可随时使用，避免了液氮法需购置液氮及其特殊保存等复杂环节；
4、本发明提供的烘干法在提取规模上具有较强的广泛性和实用性，既适合少量操作，也适用于大批量进行；
5、本发明提供的烘干法利用干燥箱直接加热干燥，所需设备简单易得，为实验室常规仪器，且避免了液氮法中液氮的使用费用高、操作繁琐等弊端；
6、本发明提供的烘干法对叶片的干燥均匀充分，较液氮法更易于研磨粉细，更有利于DNA的浸出。
附图说明
图1为本发明的水稻叶片制备的流程图；
图2为本发明的50℃烘干法和液氮冷冻法提取的DNA扩增效果图；
图中：M，marker(100-600bp)；1-3,液氮冷冻法提取的DNA；4-6，50℃烘干法提取的DNA。
图3本发明的不同温度烘干叶片提取的DNA扩增效果图；
图中：M，marker(100-600bp)；1-3,50℃烘干法提取的DNA；4-6,60℃烘干法提取的DNA；7-9,70℃烘干法提取的DNA；10-12,80℃烘干法提取的DNA；13-15,90℃烘干法提取的DNA。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
针对液氮冷冻叶片法存在的不足，本发明提供了一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，具体制备方法步骤包括如下：
S1、水稻叶片装入2mL离心管；
S2、装有叶片的2mL离心管置于干燥箱中烘干；
S3、从干燥箱中取出离心管，用塑料研磨棒进行研磨；
进一步，在步骤S1中的水稻叶片为新鲜叶片，用量为0.3-0.4g。
进一步，在步骤S2中设置5个烘干温度，分别是50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。
进一步，在步骤S2中的烘干时间为24h。
进一步，在步骤S2中每个温度设置三次重复。
进一步，从干燥箱中取出离心管，放在离心管架上，固定，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎叶片成粉状。
进一步，以水稻新鲜叶片直接液氮冷冻研磨为对照。
进一步，叶片制备好后，加入DNA提取液对水稻DNA进行提取；然后将提取到的DNA进行PCR扩增，对DNA提取质量进行分析。
进一步，以烘干法对叶片进行制备，DNA提取质量最佳的烘干温度为50℃。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
1材料与方法
1.1供试水稻材料
水稻材料：纳雍五里香、毕粳43。
主要工具材料：干燥箱、离心管、塑料研磨棒、离心管架等。
分子标记：采用陆艳婷等开发香味基因Badh2的四引物标记对本文所介绍的方法提取的DNA质量情况进行鉴定，四引物序列如下：
ESP：5'-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3'；
EAP：5'-AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-3'；
IFAP：5'-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3'；
INSP：5'-CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3'；
以上四引物在同一PCR管里进行扩增，纯合非香稻可获得长度为585和355bp的两条带，纯合香稻可获得长度为577和257bp的两条带。
1.2试验方法
1.2.1水稻叶片制备
水稻新鲜叶片约0.4g，放入2mL的离心管中，然后将该离心管置于干燥箱中进行烘干，干燥箱温度设置5个处理，即50℃、60℃、70℃、80℃和90℃；烘干时间为24h，取出离心管，放在离心管架上(固定)，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎叶片成粉状。每个处理设置3个重复。以水稻新鲜叶片直接液氮冷冻研磨为对照。
1.2.2水稻DNA大量提取
(1)将上述已制备完成的水稻叶片粉状物，加入1.5mL的CTAB溶液(CTAB-2％(W/V)，NaCl-1.4Mol/L，EDTA-0.02Mol/L，Tris Basic-0.1Mol/L，pH＝8.0)，在65℃下水浴1h，期间摇晃数次；(2)12000rpm/min离心10min，取上清液1mL移至2mL的EP离心管，弃去沉淀；(3)加入苯酚：氯仿：异戊醇溶液(25:24:1)1mL，摇床水平摇动15min；(4)12000rpm/min离心10min，小心吸取上清0.7mL至2mL的EP离心管；(5)加入氯仿：异戊醇溶液(24:1)0.7mL，摇床水平摇动15min；(6)12000rpm/min离心10min，取上清液0.4mL至已灭菌1.5mL的EP离心管中，加40μL的3Mol/L NaAC(PH＝5.2)，再加入0.8mL的-20℃无水乙醇，在-20℃静置1h；(7)在-10℃下，12000rpm/min离心10min，弃上清液，加入0.5mL的75％乙醇洗涤两次；(8)将离心管放到超净工作台风干，加入0.3mL超纯水溶解备用。
1.2.3PCR扩增及电泳检测
PCR扩增体系为20μL，包括DNA 2μL(10～100ng/L)，四引物Primer各0.5μL(2μM/L)，10×Taq Buffer 2μL,Mg2+1.2μL，dNTP Mixture0.4μL(2.5mM/L)，Taq DNA聚合酶0.4μL(2.5U/μL)，dd H2O 12μL。以上引物和其它PCR组分试剂由生工生物工程(上海)股份有限公司生产。反应程序为：先95℃下预变性5min；然后95℃下变性30s，60℃下退火复性30s，72℃下延伸30s，循环31次；在72℃下再延伸10min，10℃下2min，产物取出备用。
电泳检测：将扩增产物用1.5-2％的琼脂糖凝胶(TBE缓冲液)于120V电压下电泳30-40min，越华洋的gillgreen核酸染料染色；用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的DNA分子量Marker B(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)作分子量对照，电泳结束后将凝胶置于伯乐凝胶成像系统GEL DOC XR下观察并拍照。
2结果与分析
2.1烘干法与液氮冷冻法对叶片磨样情况分析
通过烘干，水稻叶片变脆，用塑料研磨棒伸入试管里，上下敲击，很容易就把叶片击碎成粉状，简单快速。而用液氮冷冻的叶片，亦可磨成粉状，但需研磨时间稍长，且要在利用液氮冷冻处理前把附着在叶片的水擦干去除，否则叶片冷冻不充分，难以磨细；其次，在叶片被液氮冷冻取出后，应迅速研磨，一旦液氮蒸发完毕，叶片变软，将导致磨碎困难，操作连续紧凑，工作强度大；再者，液氮极冷，稍有不慎易被液氮冻伤，也不宜长时间接触。可见，就操作性而言，上述两种不同的水稻叶片制备方法，以烘干法最为简便，效率高，可操作性强。
2.2叶片在50℃烘干磨碎与液氮冷冻研磨的DNA提取扩增效果
在水稻，叶片是提取DNA的最佳器官，一般地，对用于水稻DNA大量提取的叶片制备，需要把叶片磨碎变细，主要采用的方法有三种，即新鲜叶片于研钵中直接研磨、叶片液氮冷冻后研磨及冷冻干燥机冷冻后研磨，由于直接研磨效率低和冷冻干燥机昂贵等原因，以液氮冷冻后研磨最为普遍。利用液氮冷冻之目的，一方面让叶片冻脆便于研磨，另一方面则是保护组织细胞减少降解。干燥箱对叶片进行烘干处理，也可达到叶片变脆利于研磨的效果，操作上更便捷高效，是否也能提取出合格的DNA呢？笔者进行了试验探索，基于能烘干和低温保护组织考虑，设置烘干温度为较低的50℃，同时以液氮冷冻研磨法为对照。
利用以上两种方法研磨叶片组织提取DNA，为了更好地对比扩增效果，本实验使用了对DNA质量要求较高的四引物扩增受阻突变体系PCR法，采用标记为陆艳婷等的香味基因badh2四引物标记，纯合非香稻可获得长度为585和355bp的两条带，纯合香稻可获得长度为577和257bp的两条带。
本次使用水稻材料为纳雍五里香，在PCR扩增后的电泳检测图谱上(见图2)，泳道1-3和4-6分别为液氮研磨法和烘干法的DNA。从图2中可看出，泳道1-6均能有效扩增出577和257bp的两条带，且扩增效果相当，表明在50℃烘干磨碎与液氮冷冻研磨提取的DNA在PCR扩增效果上无明显差异，此温度下烘干提取DNA方法切实可行。
2.3不同烘干温度提取的DNA扩增效果
在干燥箱50℃环境下烘干水稻叶片提取的DNA，经PCR扩增后发现，其提取的DNA扩增效果与液氮冷冻磨样提取法所扩增的效果无明显差异。随着烘干温度的增加，烘干叶片的时间相对减少，然而，温度提高很可能会影响DNA的提取质量。为探讨烘干较高温度对DNA提取质量的影响，笔者又设置了60℃、70℃、80℃、90℃四个不同温度，并以50℃为对照。
扩增电泳检测发现，见图3所示，60℃提取的泳道4-6(毕粳43的DNA)，70℃提取的泳道7-9(纳雍五里香的DNA)，均能进行有效扩增，但条带亮度不及50℃提取的泳道1-3，稍有差异，扩增效率相对减弱，可能是由于温度高导致DNA降解的缘故，而80℃提取的泳道10-12，90℃提取的泳道13-15，未能进行有效扩增。试验结果表明，在温度不高于70℃的条件下对水稻叶片进行烘干磨碎提取DNA，可用于常规PCR扩增，但以50℃为最佳。
自从PCR技术诞生以来，分子标记在基因定位、遗传多样性分析、种质鉴定、转基因检测及分子标记辅助育种等方面得到了广泛的应用，而DNA提取是进行以上分子生物学研究的基础和前提条件。提取基因组DNA的质量直接关键到后期分子生物学实验的成败，水稻中，关于DNA的提取方法颇多，特别是近年来，各种快速提取DNA的方法更是层出不穷，但是，公开的文献资料来看，大都还是更加倾向于使用传统的CTAB法、SDS法及其衍生的一些新方法等DNA大量提取法；该法满足了质量和数量兼顾需求，可信度无可替代，奉为经典，教科书上有着其不可磨灭的印迹，知晓率高，应用率高。可知，DNA大量提取法在水稻分子生物学研究中具有重要的地位，其主要涉及两大部分，一是水稻叶片的制备，二是制备之后的加入相关试剂进行DNA提取，不少专家学者对DNA提取方法进行了改进，但主要关注于提取试剂变化上，对前期的工作即水稻叶片制备环节上极少提及。水稻叶片制备也是影响DNA提取效率和成败的关键因素，对于DNA的大量提取，需要对叶片进行研磨粉碎变细，以细为佳。液氮冷冻后研磨是最为常用的叶片制备处理方法，但其在实际应用中也存在费用较高、储存不便等一些不足，特别是无法购置到液氮的实验室，更是无法感受到液氮带来的恩惠，实用性受限，新的替代方法渴求开发。经过探索实践，本发明发展了一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其PCR扩增效果与液氮法相当，但可操作性和实用性更强。其主要操作是将叶片放入2mL的离心管，于干燥箱内烘干变脆，然后用塑料研磨棒伸入离心管内把叶片捣碎。针对烘干法，从防高温导致叶片DNA降解方面考虑，首先设置为较低温度即50℃，试验结果表明，在此温度下所提取的DNA扩增效果与液氮研磨提取无明显差异；进而又设置了60℃、70℃、80℃及90℃等四个不同温度进行烘干试验，从结果来看，60℃、70℃提取的DNA均能进行有效扩增，且两者差异不明显，但均不及50℃的效果佳，可能是高温导致DNA降解的缘故；80℃和90℃下提取的DNA没有检测到扩增条带，不宜进行使用。还值得注意的是，本试验烘干处理时间统一设置为24h，其实，在以上提及的温度中，烘干时间绰绰有余；温度高，烘干所需时间将减少，较高烘干温度烘干后及时取出，可能会提高DNA的提取质量。
基于PCR扩增目的进行DNA的大量提取，可利用烘干法替代液氮冷冻对水稻叶片进行制备，依本发明的试验验证，建议使用烘干温度为50℃；从干燥箱取出，不宜长时间置放以免叶片吸水变软，影响研磨。本发明的烘干法所需设备易得，且具有操作简单、费用低廉及实用性强等诸多优点，既可少量操作，亦可批量进行，同时也弥补了液氮冷冻法操作复杂和费用较高等缺点，更是给因条件较差难以购到液氮的人们带来了福音，在DNA大量提取中具有较高的推广应用价值。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 毕节市农业科学研究所
贵州省水稻研究所
<120> 一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtttggag cttgctgatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgctttac aaagtcccgc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cataggagca gctgaaatat atacc 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtaaaaa gattatggct tca 23
Claims (9)
1.一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，具体制备方法流程如下：
S1、水稻叶片装入2mL离心管；
S2、装有叶片的2mL离心管置于干燥箱中烘干；
S3、从干燥箱中取出离心管，用塑料研磨棒进行研磨。
2.根据权利要求1所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，在步骤S1中的水稻叶片为新鲜叶片，用量为0.3-0.4g。
3.根据权利要求1所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，在步骤S2中设置5个烘干温度，分别是50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。
4.根据权利要求1所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，在步骤S2中的烘干时间为24h。
5.根据权利要求1所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，在步骤S2中每个温度设置三次重复。
6.根据权利要求1所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，从干燥箱中取出离心管，放在离心管架上，达到固定离心管的目的，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎叶片成粉状。
7.根据权利要求1-6所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，以水稻新鲜叶片直接液氮冷冻研磨为对照。
8.根据权利要求1-7所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，叶片制备好后，加入DNA提取液对水稻DNA进行提取，然后将提取到的DNA进行PCR扩增，对DNA提取质量进行分析。
9.根据权利要求1-8所述的一种用于DNA大量提取的水稻叶片的制备方法，其特征在于，以烘干法对叶片进行制备，其DNA提取质量最佳的烘干温度为50℃。
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