CN103430936A - 一种用于鱼类基因组dna提取的鱼鳍组织的制备方法 - Google Patents

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李超
鲁翠云
程磊
郑先虎
徐鹏
孙效文
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Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
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Abstract

一种用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法，它涉及一种用于基因组DNA提取的动物组织的制备方法。它要解决目前鱼类鱼鳍组织样品的制备方法对保存条件要求高、不适于野外采样和不方便携带的问题。方法：一、采集新鲜鱼鳍组织；二、将鱼鳍组织平整置于滤纸上，用另一张滤纸覆盖；三、将用滤纸覆盖的鱼鳍组织放于阴凉通风处，直至样品完全干燥；四、将样品室温防潮保存。本发明中方法制备的鱼类鱼鳍组织样品可在常温下长时间保存，无需低温环境，减少了占用的空间，降低了保存的成本，操作过程简洁，样品便于携带，尤其在样品数量较大的情况下，即可减少工作量，体高工作效率，又同时保证了实验质量。

Description

一种用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于基因组DNA提取的动物组织的制备方法。
背景技术
鱼类鱼鳍组织中有上皮细胞、骨细胞等细胞组织，含有足够量的基因组DNA，可以用于鱼类基因组DNA的提取。
目前，对鱼类用于基因组DNA提取的鱼鳍组织样品在采集后，为了抑制内源核酸酶的活性，防止DNA被降解，一般选择用95%乙醇固定、在低温条件或直接在液氮中保存。由于液氮和高浓度乙醇都属禁运品，上述的保存方法，对保存的条件要求较高，不适合野外操作，使样品在采集后不便于携带。
发明内容
本发明是要解决目前鱼类鱼鳍组织样品的制备方法对保存条件要求高、不适于野外采样和不方便携带的问题，而提供一种用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法。
用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法，按以下步骤进行：
一、采集新鲜鱼鳍组织；
二、将鱼鳍组织平整置于滤纸上，用另一张滤纸覆盖；
三、将用滤纸覆盖的鱼鳍组织放于阴凉通风处，直至样品完全干燥；
四、将样品室温防潮保存，即完成用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备。
本发明中方法制备的鱼类鱼鳍组织样品可在常温下长时间保存，无需低温环境，减少了占用的空间，降低了保存的成本，操作过程简洁，样品便于携带，尤其在样品数量较大的情况下，即可减少工作量，体高工作效率，又同时保证了实验质量。
附图说明
图1是镜鲤、施氏鲟、虹鳟的基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果的电泳图，其中M为Marker DL2000，1-3为镜鲤，4-6为施氏鲟，7-9为虹鳟；
图2是利用引物HLJ360对镜鲤进行PCR扩增，得到的扩增图谱；
图3是利用引物HLJE222对镜鲤进行PCR扩增，得到的扩增图谱；
图4是利用引物HLJSX210对施氏鲟进行PCR扩增，得到的扩增图谱；
图5是利用引物HLJSX215对施氏鲟进行PCR扩增，得到的扩增图谱；
图6是利用引物AF346679对虹鳟进行PCR扩增，得到的扩增图谱；
图7是利用引物AY039634对虹鳟进行PCR扩增，得到的扩增图谱。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式见的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法，按以下步骤进行：
一、采集新鲜鱼鳍组织；
二、将鱼鳍组织平整置于滤纸上，用另一张滤纸覆盖；
三、将用滤纸覆盖的鱼鳍组织放于阴凉通风处，直至样品完全干燥；
四、将样品室温防潮保存，即完成用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备。
本实施方式中的方法对用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备具有操作过程简洁的特点，尤其在样品数量较大的情况下，即可减少工作量，体高工作效率，又同时保证了实验质量。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中还可采用硅胶干燥剂使鱼鳍组织的干燥脱水。其它与具体实施方式一相同。
为验证本发明的效果，进行以下实验：
1.样品制备：采集新鲜镜鲤、施氏鲟、虹鳟的鱼鳍组织，将鱼鳍组织平整置于滤纸上，用另一张滤纸覆盖，将用滤纸覆盖的鱼鳍组织放于阴凉通风处，直至样品完全干燥，将样品室温防潮保存三个月。
2.采用酚氯仿法提取基因组DNA，具体如下：
（1）剪取1.0cm×1.0cm完全干燥的样品，剪碎后，置于1.5mL离心管内，加入400μL的裂解液（200mg/L蛋白酶K，0.5%SDS，50mmol/L EDTA，20mg/L RNase），55℃消化2-3h；
（2）加入400L Tris饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液（25:24:1），充分混匀10分钟，然后12000rpm离心10min；
（3）取上层水相，加入等体积Tris饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液（25:24:1），充分混匀10分钟，然后12000rpm离心10min；
（4）取上层水相，加入等体积氯仿、异戊醇混合溶液（24:1），充分混匀10分钟，然后12000rpm离心10min；
（5）取上层水相，加入2倍体积的-20℃无水乙醇，颠倒混匀数次，然后12000rpm离心10min；
（6）所得沉淀即为基因组DNA，弃去管中液体，加入800L70%乙醇洗涤沉淀，然后12000rpm离心5min，弃去管中液体，使沉淀自然干燥；
（7）加入适量的1×TE（10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液，4℃保存备用。
3.基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.以提取的基因组DNA为模板，分别利用以下引物
HLJ360  上游引物：ATGATTTCACTGCTGCTTG
        下游引物：GTCTGTCGCTCTGTCTGG
HLJE222 上游引物：TTGCTGTCACTTCTGCTTCC
        下游引物：CAAAAGACGGCTGGGTAAGA
HLJSX210上游引物：GGGCTGTTGCATAAACGAAT
        下游引物：TTGGTGTGCTTTTGTTGTGA
HLJSX215上游引物：GAAGGTATCCAACTCAATGCAA
        下游引物：GTGGTCAGAGTCCGTCTGGT
AF346679上游引物：CTCCCCAGAGATCAGACAGG
        下游引物：CCTCAACATCGGTGAATAGTG
AY039634上游引物：CTGAGACCACAGCACAATGC
        下游引物：GTTGCCACATGGAAATGGTTGA
进行PCR扩增反应；
PCR扩增的反应体系为15μL的反应体系，由下列成分组成：
Figure BDA0000378634820000031
PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，50℃退火50s，72℃
PCR扩增反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。
5.PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯凝胶电泳检测。
结果如图1-7所示，采用本发明中的方法，提取获得的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果和作为模板用于PCR扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，获得的DNA条带具有长度准确，明亮清晰，在目的条带大小位置出现清晰条带，说明采用本发明方法制备的鱼鳍组织，完全能够用于鱼类基因组DNA提取和后续实验操作。
Figure IDA0000378634910000011
Figure IDA0000378634910000021
Figure IDA0000378634910000031
Figure IDA0000378634910000041

Claims (2)

1.一种用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法，其特征在于它按以下步骤进行：
一、采集新鲜鱼鳍组织；
二、将鱼鳍组织平整置于滤纸上，用另一张滤纸覆盖；
三、将用滤纸覆盖的鱼鳍组织放于阴凉通风处，直至样品完全干燥；
四、将样品室温防潮保存，即完成用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备。
2.根据权利要求1所述的一种用于鱼类基因组DNA提取的鱼鳍组织的制备方法，其特征在于步骤三中还可采用硅胶干燥剂使鱼鳍组织的干燥脱水。
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