CN110483622A

CN110483622A - 酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用

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Publication number: CN110483622A
Application number: CN201910790806.8A
Authority: CN
Inventors: 罗珍; 夏祖猛; 陈媛媛; 罗琥捷; 李文治
Original assignee: Infinitus China Co Ltd
Current assignee: Infinitus China Co Ltd
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110483622B

Abstract

本发明涉及多肽领域，特别涉及酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用。本发明以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶和复合蛋白酶(胰蛋白酶和中性蛋白酶)酶解、灭酶、离心、调节等电点/醇沉除杂、干燥等工艺制备具有持钙活性强的酪蛋白磷酸肽。本发明所得特殊的簇磷酸丝氨酸结构具有螯合钙的能力，能够有效促进钙的吸收和利用。本发明制备的乳源性酪蛋白磷酸肽分子量主要在1000‑5000之间，有利于人体吸收。酪蛋白磷酸肽的含量在85％以上，其收率可达到25％。是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产。

Description

酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及多肽领域，特别涉及酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用。

背景技术

酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得，具有促进钙、铁、锌等二价金属离子吸收和利用的多肽，可用于各种营养、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰蛋白酶及中性蛋白酶水解的多肽，经过精制、纯化制成，其核心结构为：—Ser(P)－Ser(P)－Ser(P)－Glu－Glu－(Ser：丝氨酸，Glu：谷氨酸，P：磷酸基)。这一结构中的磷酸丝氨酸残基(－Ser(P)－)成簇存在，在肠道pH弱中性环境下带负电荷，可阻止消化酶的进一步作用，使酪蛋白磷酸肽不会被进一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小肠下端pH 7.0-8.0环境下与钙结合而抑制磷酸钙沉淀的形成，使游离钙保持较高的浓度，促进钙的被动吸收，现已作为功能因子添加到保健品及乳品等食品中。

目前多采用在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应，利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽，产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后获得。该方法操作简单，设备要求低，收率高，产品质量好，而且反应温度低，能实现产业化生产，但其采用单一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量较低(最高产品含量为16％左右)。

此外，本领域技术人员多采用一种利用胰蛋白酶酶解乳源性酪蛋白为原料制备酪蛋白磷酸肽的方法，主要通过胰蛋白酶水解、灭酶、超滤、冷冻干燥或喷雾干燥等工艺制备了天然、安全，无毒副作用、成本低的酪蛋白磷酸肽混合样品。但也未对酪蛋白磷酸肽含量进行测定，不能规范化产品质量，也无法准确评价其药效。

因此，提供一种酪蛋白磷酸肽及其制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用。本发明提供了高活性酪蛋白磷酸肽，用于补充钙的食品或药品中，以促进钙的吸收利用。本发明还提供了一种制备上述高活性酪蛋白磷酸肽的方法，该肽主要活性成分明确，促钙吸收效果好，工艺简洁，可实现量产，能规范化产品质量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种多肽，有且仅含有1个、2个或4个磷酸丝氨酰簇。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽的功能区结构选自β(48～63)1P、αS1(58～73)2P、αS1(119～134)1P、β(48-67)1P或β(17-40)4P。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1～5任一项所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1～5任一项所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。

本发明还提供了一种编码所述的多肽的DNA分子。

本发明还提供了一种重组载体，含有所述的DNA分子。

本发明还提供了一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；

取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

诱导所述转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；

所述的(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列；

所述的(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述原核系统宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了所述的多肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取部分配方量的酪蛋白与水混合，调节pH值，与胰蛋白酶混合经第一酶解，制得第一酶解液；

步骤2：取余量的酪蛋白与水混合，调节pH，与复合蛋白酶混合经第二酶解，制得第二酶解液；

步骤3：将所述第一酶解液与所述第二酶解液合并，调节pH值，灭酶，制得酶解液；

步骤4：取步骤3制得的酶解液过滤，得滤液；

步骤5：取步骤4所述过滤制得的滤液，调节pH值，与无水氯化钙混合，冷却，经乙醇醇沉后静置，过滤，收集滤渣，干燥制得酪蛋白磷酸肽；

在本发明一些具体实施方案中，步骤1中酪蛋白与步骤2中酪蛋白的质量比为(1～3):1；步骤1或步骤2中酪蛋白与水的质量比为1:(8～10)；步骤1或步骤2中所述混合的温度为40℃～50℃；所述pH值为7.5～8.5。

在本发明一些具体实施方案中，步骤1中酪蛋白与步骤2中酪蛋白的质量比为3:1，步骤1或步骤2中酪蛋白与水的质量比为1:10；步骤1或步骤2中所述混合的温度为50℃；所述pH值为8.0。

在本发明一些具体实施方案中，步骤1中所述胰蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.1％～0.4％；所述酶解的温度为40℃～50℃；所述酶解的时间为2.0h～3.0h。

在本发明一些具体实施方案中，步骤1中所述胰蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.3％；所述酶解的温度为50℃；所述酶解的时间为2.0h；所述酶解的pH值为8.0。

在本发明一些具体实施方案中，步骤2中所述复合蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.1％～0.3％；所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶与中性蛋白酶，所述胰蛋白酶与所述中性蛋白酶的质量比为(8～10):1；所述酶解的温度为40℃～50℃；所述酶解的时间为0.5h～1.5h。

在本发明一些具体实施方案中，步骤2中所述复合蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.25％；所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶与中性蛋白酶，所述胰蛋白酶与所述中性蛋白酶的质量比为9:1；所述酶解的温度为50℃；所述酶解的时间为1.0h；所述酶解的pH值为8.0。

在本发明一些具体实施方案中，步骤3中所述调节pH值至4.0～6.0。

在本发明一些具体实施方案中，步骤5中所述pH值为4.0～6.0；无水氯化钙的添加量为滤液体积的0.3％～1.0％；所述乙醇的体积浓度为95％，使得酒精的终浓度为50.0％～60.0％。

在本发明一些具体实施方案中，步骤5中所述pH值为5.5；无水氯化钙的添加量为滤液体积的0.6％；所述乙醇的体积浓度为95％，使得酒精的终浓度为60.0％。

在本发明一些具体实施方案中，步骤5中所述冷却的温度为10℃～20℃。

本发明还提供了所述的多肽或所述的制备方法制得的多肽在制备促进钙的吸收和/或利用的药物和/或食品中的应用。

本发明还提供了一种促进钙的吸收和/或利用的药物，由所述的多肽或所述的制备方法制得的多肽及药学上可接受的辅料组成。

在本发明一些具体实施方案中，所述多肽占所述药物的质量百分含量为1％～20％。

在本发明一些具体实施方案中，所述药物的剂型为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。

本发明还提供了一种促进钙的吸收和/或利用的食品，由所述的多肽或所述的制备方法制得的多肽及食品中可接受的助剂组成。

在本发明一些具体实施方案中，所述多肽占所述食品的质量百分含量为1％～20％。

本发明以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶和复合蛋白酶(胰蛋白酶和中性蛋白酶)酶解、灭酶、离心、调节等电点/醇沉除杂、干燥等工艺制备具有持钙活性强的酪蛋白磷酸肽。

本发明所得特殊的簇磷酸丝氨酸结构具有螯合钙的能力，能够有效促进钙的吸收和利用。本发明制备的乳源性酪蛋白磷酸肽分子量主要在1000-5000之间，有利于人体吸收。酪蛋白磷酸肽的含量在85％以上，其收率可达到25％。是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产。

具体实施方式

本发明公开了酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了乳源高活性酪蛋白磷酸肽含有5个特定序列单体，其一级结构分别为：P1：FQpSEEQQQTEDELQDK，属于β-酪蛋白48-63的片段(β-CN(48-63))，分子量为2043.6D；P2：DIGpSEpSTEDQAMEDIK，分子量为1927.5D，属于αS1酪蛋白58-73的片段(αs1(58-73))；P3：YKVPQLEIVPNpSAEER，分子量为1951.8D，属于αS1酪蛋白119-134的片段(αs1(119-134))；P4：FQpSEEQQQTEDELQDKIHPF，分子量为2555.9D，属于β-酪蛋白48-67的片段(β-CN(48-67))；P5：ELEELNVPGEIVEpSLpSpSpSEESITR，分子量为2966.1D，属于β酪蛋白17-40的片段β(17-40)。5个单体P1、P2、P3、P4、P5分别含有1个、2个、1个、1个、4个成簇的磷酸丝氨酰基。

本发明还提供了上述牛乳高活性酪蛋白磷酸肽及其制备方法，包括以下步骤：

分别称取酪蛋白原料，投入罐1与罐2中，加水搅拌溶解，加入10％氢氧化钠溶解；

(1)罐1中待PH稳定后，加入胰蛋白酶，酶解；

(2)罐2中待PH稳定后，加入胰蛋白酶与中性蛋白酶的复合蛋白酶酶解；

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得酶解液合并，调节PH4.0-6.0，将温度调节至80℃-90℃，保温20min-30min，进行灭酶杀菌；冷却至50℃以内，得混悬酶解液。

(4)将(3)所得的混悬酶解液采用离心机或板框过滤机过滤，得滤液。

(5)分离纯化：将(4)所得滤液，调节PH，将酶解液转移至醇沉罐，记录酶解液体积，加入无水氯化钙，搅拌10min-20min，静置冷却至10℃-20℃，再加入95％乙醇醇沉，搅拌充分后静置6-8h。

(6)过滤：将(5)所得混悬液过滤，收集沉淀。沉淀采用60-70℃烘箱或真空干燥得酪蛋白磷酸肽。

(7)粉碎过筛：粉碎后过80目筛网，得牛乳高活性酪蛋白磷酸肽。

作为优选，罐1和罐2酪蛋白的比例为1:1-3:1，溶解时料水比为1:8-10，溶解温度40℃-50℃，控制pH为pH7.5-8.5。

作为优选，罐1和罐2酪蛋白的比例为3:1，溶解时料水比为1:10，反应温度为50℃，控制pH为pH8.0。

作为优选，步骤(1)中，加酶量为酪蛋白质量的0.1％-0.4％，加入10％氢氧化钠溶解，控制pH7.5-8.5，控制温度40℃-50℃，酶解时间为2.0h-3.0h。

作为优选，步骤(1)中，加酶量为酪蛋白质量的0.3％，控制pH 8.0，反应温度为50℃，酶解时间为2.0h。

作为优选，步骤(2)中，加酶量为酪蛋白质量的0.1％-0.3％，胰蛋白酶与中性蛋白酶的比例为8:1-10:1。加入10％氢氧化钠溶解，控制pH7.5-8.5，控制温度40℃-50℃，酶解时间为0.5h-1.5h。

作为优选，步骤(2)中，加酶量为酪蛋白质量的0.25％，胰蛋白酶与中性蛋白酶的比例为9:1，控制pH8.0，控制温度50℃，酶解时间为1.0h。

作为优选，步骤(5)中，调节PH4.0-6.0，无水氯化钙添加量为酶解液体积的0.3％-1.0％，加入95％乙醇，使醇沉酒精浓度为50.0-60.0％。

作为优选，步骤(5)中，调节PH 5.5，无水氯化钙添加量为酶解液体积的0.6％，加入95％乙醇使醇沉酒精浓度为60.0％。

本发明还提供了所述的乳源高活性酪蛋白磷酸肽在制备具有补充钙作用的食品或药物中的应用。

本发明提供的多肽及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

分别称取酪蛋白原料，投入罐1与罐2中，加水搅拌溶解，加入10％氢氧化钠溶解；其中，罐1和罐2酪蛋白的比例为3:1，溶解时料水比为1:10，反应温度为50℃，控制pH为pH8.0。

(1)罐1中待PH稳定后，加入胰蛋白酶，酶解；

其中，加酶量为酪蛋白质量的0.3％，控制pH 8.0，反应温度为50℃，酶解时间为2.0h。

(2)罐2中待PH稳定后，加入胰蛋白酶与中性蛋白酶的复合蛋白酶酶解；其中，加酶量为酪蛋白质量的0.25％，胰蛋白酶与中性蛋白酶的比例为9:1，控制pH8.0，控制温度50℃，酶解时间为1.0h。

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得酶解液合并，调节PH5.0，将温度调节至85℃，保温25min，进行灭酶杀菌；冷却至50℃以内，得混悬酶解液。

(5)分离纯化：将(4)所得滤液，调节PH，将酶解液转移至醇沉罐，记录酶解液体积，加入无水氯化钙，搅拌15min，静置冷却至15℃，再加入95％乙醇醇沉，搅拌充分后静置7h。

其中，调节PH 5.5，无水氯化钙添加量为酶解液体积的0.6％，加入95％乙醇使醇沉酒精浓度为60.0％。

(6)过滤：将(5)所得混悬液过滤，收集沉淀。沉淀采用65℃烘箱或真空干燥得酪蛋白磷酸肽。

(7)粉碎过筛：粉碎过80目筛网，得牛乳高活性酪蛋白磷酸肽。

实施例2

其中，罐1和罐2酪蛋白的比例为1:1，溶解时料水比为1:8，溶解温度40℃，控制pH为pH7.5。

(1)罐1中待PH稳定后，加入胰蛋白酶，酶解；

其中，加酶量为酪蛋白质量的0.1％，加入10％氢氧化钠溶解，控制pH8.5，控制温度40℃，酶解时间为2.5h。

其中，加酶量为酪蛋白质量的0.1％-，胰蛋白酶与中性蛋白酶的比例为8:1。加入10％氢氧化钠溶解，控制pH8.5，控制温度40℃，酶解时间为1.5h。

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得酶解液合并，调节PH4.0，将温度调节至90℃，保温20min，进行灭酶杀菌；冷却至50℃以内，得混悬酶解液。

(5)分离纯化：将(4)所得滤液，调节PH，将酶解液转移至醇沉罐，记录酶解液体积，加入无水氯化钙，搅拌10min，静置冷却至20℃，再加入95％乙醇醇沉，搅拌充分后静置6h。

其中，调节PH4.0，无水氯化钙添加量为酶解液体积的0.3％，加入95％乙醇，使醇沉酒精浓度为50.0％。

(6)过滤：将(5)所得混悬液过滤，收集沉淀。沉淀采用60℃烘箱或真空干燥得酪蛋白磷酸肽。

实施例3

其中，罐1和罐2酪蛋白的比例为2:1，溶解时料水比为1:9，溶解温度45℃，控制pH为pH8.5。

(1)罐1中待PH稳定后，加入胰蛋白酶，酶解；

其中，加酶量为酪蛋白质量的0.4％，加入10％氢氧化钠溶解，控制pH7.5，控制温度45℃，酶解时间为3.0h。

其中，加酶量为酪蛋白质量的0.3％，胰蛋白酶与中性蛋白酶的比例为10:1。加入10％氢氧化钠溶解，控制pH7.5，控制温度45℃，酶解时间为0.5h。

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得酶解液合并，调节PH6.0，将温度调节至80℃，保温30min，进行灭酶杀菌；冷却至50℃以内，得混悬酶解液。

(5)分离纯化：将(4)所得滤液，调节PH，将酶解液转移至醇沉罐，记录酶解液体积，加入无水氯化钙，搅拌20min，静置冷却至10℃，再加入95％乙醇醇沉，搅拌充分后静置8h。

其中，调节PH6.0，无水氯化钙添加量为酶解液体积的1.0％，加入95％乙醇，使醇沉酒精浓度为55.0％。

(6)过滤：将(5)所得混悬液过滤，收集沉淀。沉淀采用70℃烘箱或真空干燥得酪蛋白磷酸肽。

(7)粉碎过筛：粉碎混合过80目筛网，得牛乳高活性酪蛋白磷酸肽。

对比例1

采用申请公布号为CN107557418A的实施例1作为对比例1.包括如下步骤：

(1)将100公斤水加入到酶解罐中，在42℃和50r/min条件下搅拌，再将33.5公斤酪蛋白磷酸钠加入到酶解罐中，得到酪蛋白磷酸钠悬浮液。

(2)加入复合蛋白酶进行酶解，得到酪蛋白磷酸肽溶液。复合蛋白酶的质量配比为凝乳蛋白酶：风味蛋白酶：木瓜蛋白酶＝1.5:3:2.酶解条件为：加入复合蛋白酶的量为酪蛋白磷酸钠质量的0.5％、PH值为6.8、反应温度为42℃、搅拌速度为50r/min、反应时间为6h；

(3)酪蛋白磷酸肽溶液依次经过高速离心分离和喷雾干燥，得到粉末状的酪蛋白磷酸肽。

对比例2：

采用申请公布号为CN103571905A的实施例1作为对比例2。包括如下步骤：

向反应釜中加纯水150L，开搅拌200rpm，加热至50℃，向反应釜中缓慢投入酪蛋白25公斤，将PH调至7.8；投入胰蛋白酶：中性蛋白酶：碱性蛋白酶：凝乳蛋白酶＝4:3:2:1(质量比)混合制成的复合蛋白酶12.5克。酶解1h后，将料液降温到37℃，将PH调至4.0，加入12.5克胃蛋白酶，继续酶解，1H后酶解结束。调PH4.5灭酶，将温度调节至90℃，保温20min。使用735阳离子交换树脂吸收纯化1H，过滤，滤液调整纯化液PH为7.0，使用717阴离子交换树脂进行纯化1H，先用水洗，弃去水洗液后，再用1％盐酸洗脱。洗脱液调PH值6.8，采用5000D的超滤膜超滤，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的纳滤膜脱盐。对滤液进行喷雾干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.52克。

效果例

N含量测定用凯氏定氮法，可测出CPPs中的总氮和非蛋白氮。

食品中总磷测定用GB5009.87中的钒钼黄分光光度法测定。

N/P比，则为两者相除。

持钙能力检测：

1原理

在有CaCl₂和NaH₂PO₄存在的溶液中，Ca₃(PO₄)₂即磷酸钙的自发生成涉及下列反应：

(1)Ca(H₂PO₄)₂→CaHPO₄+H₂PO₄ ^－+H⁺；

(2)3CaHPO₄→Ca₃(PO₄)₂+HPO₄ ^2－+2H⁺。

以上的两步反应都有H⁺(氢离子)释放出来。如果加入NaOH即氢氧化钠，可以中和溶液中的氢离子，从而促进磷酸钙沉淀的生成、降低钙的吸收利用率。当反应体系的pH值保持在一指定值(pH值7.2)、且加入氢氧化钠的速度(氢氧化钠的加入量随时间而增加)可以反应样品阻止磷酸钙沉淀的效果，可以据此通过测定中和这部分氢离子NaOH消耗突然上升的时间来表征酪蛋白磷酸肽阻止磷酸钙沉淀的效果。

2实验仪器与试剂

2.1实验试剂

除非另有规定，本方法中试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。

磷酸二氢钠溶液(0.016mol/L)；氯化钙溶液(0.016mol/L)；氢氧化钠溶液(0.1mol/L)。

2.2实验仪器

精密pH计(相对pH精度±0.01)；恒温水浴磁力搅拌器

3样品处理及测试方法

准确称取高含量酪蛋白磷酸肽(CPP)样品0.0400g(以干物质计)低含量样品0.1000g(以干物质计)于500ml烧杯中，加100ml 0.016mol/L的NaH₂PO₄将CPPs溶解，将反应器置于25℃水浴，加入浓度为0.016mol/L的CaCl₂ 100ml，立即用0.1mol/LNaOH将反应体系调至pH7.20，并不断滴加0.1mol/LNaOH，使反应液pH保持在7.20，从调节pH开始计时，在2min内将反应体系调至pH7.20，从2min开始连续记录0.1mol/LNaOH的消耗量。以时间为横坐标，0.1mol/L NaOH的消耗量为纵坐标，得到持钙能力曲线。

同时，对每个样品通过三次重复测定，得到其持钙能力的时间。

分子量段：高效液相色谱法检测多肽分布情况

1液相条件为

(1)色谱柱：Diamosil C18(2)5u，250×4.6mm；

(2)流动相A：0.1％三氟乙酸重蒸水溶液，流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液。

(3)流速：1mL/min；

(4)梯度洗脱程序：0-20min 10％B-50％B；20-30min 50％B-90％B；30-40min10％B。

(5)柱温：常温；

(6)进样量：20μL；

(7)波长：215nm

(8)进样浓度：5mg/mL，样品用纯水溶解，过0.45nm膜。

检测结果见表1。

表1

	颜色及风味	N％	P％	N/P	分子量段	持钙能力
							实施例1	奶白、略带淡淡奶香	13.52	1.11	12.18	1224	47.67
实施例2	奶白、略待淡淡奶香	13.55	1.29	10.5	1567	46.67
							实施例3	奶白、略带淡淡奶香	12.55	1.12	11.2	1381.	48.23
对比例1	黄色、略有不愉快气味	12.38	1.08	11.46	3880	23.33
							对比例2	白色、略有苦味	12.97	0.65	19.95	2050	29.67

在食品中应用，选择CPP原料会综合考虑颜色、风味、促钙吸收能力以及成本。首先，对比例1、2颜色为黄色或略有不愉快风味，这是工艺脱苦、脱色不成熟的表现，在乳制品、片剂等产品中应用时，也会极大影响消费者体验感；而实施例颜色偏高、且淡淡奶香，便于产品应用。其次，CPP在食品行业广泛作为促钙吸收肽，促进钙元素在体内的吸收和利用。故通过N/P比、分子量分布、持钙吸收能力检测，评估各样品促钙吸收能力。1)不同的CPPs中N/P比越小，CPPs中Ser结合Pi相对越多，对Ca2+等离子的亲和力越强，在小肠内越不容易释放和被肠粘膜细胞吸收，体外CPPs持钙能力越强，阻止Ca形成沉淀的时间越长。实施例1-3及对比例1N/P比相对更小，持钙能力相对更好。2)实施例1-3分子量相对对比例1-3更小，相对而言有利于吸收。3)通过促钙吸收肽体外持钙能力测定方法——pH滴定法，进行CPP持钙能力检测，从数据可以看出，实施例1-3持钙时间相对更久，意味着钙元素保持钙离子的时间更长，与小肠粘膜细胞接触的时间更长，相对而言，有更多比例可以跨膜吸收，也就是说促进钙吸收。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 无限极（中国）有限公司

<120> 酪蛋白磷酸肽及其制备方法、应用

<130> MP1722785

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> β（48~63）1P

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(16)

<223> Xaa(3)=Ser(P);

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 1

Phe Gln Xaa Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> αS1（58~73）2P

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(16)

<223> Xaa(4)=Ser(P);Xaa(6)=Ser(P);

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(4)

<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)..(6)

<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 2

Asp Ile Gly Xaa Glu Xaa Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> αS1（119~134）1P

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(16)

<223> Xaa(12)=Ser(P);

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 3

Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Xaa Ala Glu Glu Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> β（48-67）1P

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(20)

<223> Xaa(3)=Ser(P);

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 4

Phe Gln Xaa Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Pro Phe

20

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> β（17-40）4P

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(24)

<223> Xaa(14)=Ser(P);Xaa(16)=Ser(P);Xaa(17)=Ser(P);Xaa(18)=Ser(P);

<220>

<221> UNSURE

<222> (14)..(14)

<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (16)..(16)

<223> The 'Xaa' at location 16 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (17)..(17)

<223> The 'Xaa' at location 17 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (18)..(18)

<223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 5

Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Xaa Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Glu Glu Ser Ile Thr Arg

20

Claims

1.酪蛋白磷酸肽，其特征在于，有且仅含有1个、2个或4个磷酸丝氨酰簇。

2.根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，其功能区结构选自β(48～63)1P、αS1(58～73)2P、αS1(119～134)1P、β(48-67)1P或β(17-40)4P。

3.根据权利要求1或2所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1～5任一项所示的氨基酸序列；

4.根据权利要求1至3任一项所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

5.根据权利要求1至4任一项所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，所述取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

6.根据权利要求1至5任一项所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

7.根据权利要求1至6任一项所述的酪蛋白磷酸肽，其特征在于，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。

8.根据权利要求1至7任一项所述的酪蛋白磷酸肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤4：取步骤3制得的酶解液过滤，得滤液；

步骤5：取步骤4所述过滤制得的滤液，调节pH值，与无水氯化钙混合，冷却，经乙醇醇沉后静置，过滤，收集滤渣，干燥制得酪蛋白磷酸肽。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1中酪蛋白与步骤2中酪蛋白的质量比为(1～3):1；步骤1或步骤2中酪蛋白与水的质量比为1:(8～10)；步骤1或步骤2中所述混合的温度为40℃～50℃；所述pH值为7.5～8.5。

10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述胰蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.1％～0.4％；所述酶解的温度为40℃～50℃；所述酶解的时间为2.0h～3.0h。

11.根据权利要求8至10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述复合蛋白酶的加入量为酪蛋白质量的0.1％～0.3％；所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶与中性蛋白酶，所述胰蛋白酶与所述中性蛋白酶的质量比为(8～10):1；所述酶解的温度为40℃～50℃；所述酶解的时间为0.5h～1.5h。

12.根据权利要求8至10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述pH值为4.0～6.0；无水氯化钙的添加量为滤液体积的0.3％～1.0％；所述乙醇的体积浓度为95％，使得酒精的终浓度为50.0％～60.0％。

13.根据权利要求1至7任一项所述的多肽或如权利要求8至12任一项所述的制备方法制得的多肽在制备促进钙的吸收和/或利用的药物和/或食品中的应用。

14.一种促进钙的吸收和/或利用的药物，其特征在于，由如权利要求1至7任一项所述的多肽或如权利要求8至12任一项所述的制备方法制得的多肽及药学上可接受的辅料组成。

15.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，所述多肽占所述药物的质量百分含量为1％～20％。

16.一种促进钙的吸收和/或利用的食品，其特征在于，由如权利要求1至7任一项所述的多肽或如权利要求8至12任一项所述的制备方法制得的多肽及食品中可接受的助剂组成。

17.根据权利要求16所述的食品，其特征在于，所述多肽占所述食品的质量百分含量为1％～20％。