CN110433134B - 一种释放一氧化氮软膏及其制备方法与应用 - Google Patents

一种释放一氧化氮软膏及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种释放一氧化氮软膏及其制备方法与应用。包括以下步骤：(1)将聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中，加入甲醇钠，混合均匀，进行负载NO反应，得到聚乙烯亚胺NO供体材料；(2)将聚乙烯亚胺NO供体材料溶于聚乙烯醇水溶液中，得到聚乙烯亚胺NO供体材料溶液；(3)将液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，得到油相；将甘油、司盘80和吐温80加入水中混合均匀，得到水相；将水相加入到油相中，得到混合溶液；(4)将聚乙烯亚胺NO供体材料溶液加入到混合溶液中，得到释放一氧化氮软膏。制得的软膏对多种菌体具有好的抗菌性和缓慢释放效果，对于各种微生物疾病的治疗和人们健康水平的提高有重要的意义。

Description

一种释放一氧化氮软膏及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物材料和生物医用材料领域，具体涉及一种释放一氧化氮软膏及其制备方法与应用。
背景技术
目前细菌/真菌等微生物感染所引起的皮肤疾病是一个严重的全球性挑战，不仅威胁到公共卫生安全，同时又造成沉重的经济负担。致病菌在易受感染的皮肤表面或伤口中富集从而导致感染，进一步导致皮肤表面或伤口中毒素的急剧增加，这可能会显著延长或干扰皮肤伤口愈合过程，更有甚者可能会导致皮肤伤口进一步恶化，从而导致更加严重后果。此外，严重的细菌/真菌等微生物感染可导致外科手术医疗植入物和设备的失败，极大地增加了败血症的风险，甚至导致死亡。全球性抗生素耐药性危机的出现进一步加剧了这一问题，传统上用于抑制、预防或消除致病性微生物生长的抗生素制剂已完全失效。然而令人失望的问题是目前市场上用于治疗因细菌/真菌等微生物感染所引起的皮肤疾病所使用皮肤类软膏基本为抗生素类软膏，这类软膏不仅使皮肤变得干燥，极大地增加耐性药性问题产生降低机体免疫力，对于敏感体质的人而言，过敏反应的发生将会给自身带来更大的伤害。
近年来研究发现，一氧化氮(NO)已被证实可抑制非常广泛的致病微生物包括病毒、细菌、真菌及寄生虫等，并且因其高效抑菌及不易产生耐药性等特性，在抗菌领域显示出重要的应用前。Jin等发现外源性NO具有分散和直接杀灭细菌的能力，是一种很有吸引力的抗菌药物并且对一些列NO供体材料进行详细分析和比较，证明NO确实是一个良好的杀菌剂(JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 2018(140)14178-14184)。Hasan等发现NO已经成为一种伤口愈合促进剂和一种新的抗菌药物，可以有效规避抗生素的耐药性问题(International Journal of Nanomedicine 2015(10)3065–3080)。Kang等成功制备出一种可释放NO的聚合物软膏，同时详细探究该软膏对缺损伤口修复效果，实验结果发现与未负载NO的聚合物软膏相比较，该NO的聚合物软膏具有可促进伤口快速愈合并对伤口起到长久保湿功能(Journal of Controlled Release 2015(220)624–630)，但是该NO软膏中NO有效负载量较低，同时NO释放周期较短，从而使其在临床上进一步应用存在较大的困难。所以如何实现NO高效负载以及长时间释放是其NO软膏在医疗方面应用的主要技术难点。
目前市场上用于治疗因致病菌感染而引发的皮肤病所使用的软膏基本上为抗生素类软膏，该类软膏副作用较大，且很容易导致机体耐药性等问题产生。近年来研究发现，NO已被证实可抑制非常广泛的致病微生物包括病毒、细菌、真菌及寄生虫等，并且因其高效抑菌及不易产生耐药性等特性，在抗菌领域显示出重要的应用前景。所以开发并制备一种用于治疗因耐药性致病微生物引起皮肤感染性疾病的新型皮肤外用软膏已成为一个新的趋势。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种释放一氧化氮软膏的制备方法。将聚乙烯醇水溶液分散NO供体材料后加入到白凡士林等油性基质材料中，通过调控基质中不同组分比例，从而制备出一种可实现持续释放NO的新型皮肤外用软膏。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种释放一氧化氮软膏。
本发明的再一目的在于提供上述一种释放一氧化氮软膏在生物医学工程材料中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种释放一氧化氮软膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中，加入甲醇钠，混合均匀，在室温、80～120psiNO气体条件下进行负载NO反应3～7天，结束反应，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺NO供体材料(PEI/NONOate)；
(2)将聚乙烯亚胺NO供体材料溶于聚乙烯醇水溶液中，混合均匀，得到聚乙烯亚胺NO供体材料溶液；
(3)将液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂在50～60℃下混合均匀，得到油相；将甘油、司盘80和吐温80加入水中，70～80℃下混合均匀，得到水相；将70～80℃的水相加入到50～60℃的油相中，搅拌均匀后，得到混合溶液；
(4)在25～50℃下，将聚乙烯亚胺NO供体材料溶液加入到步骤(3)的混合溶液中，搅拌均匀，密封，得到释放一氧化氮软膏。
步骤(1)所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)为600～70000。所述聚乙烯亚胺为无水聚乙烯亚胺，由以下方法制得：称取一定量的聚乙烯亚胺PEI于真空干燥箱中，在真空干燥箱中放置一定量的无水氯化钙，然后升高温度至60～100℃真空干燥1～3天，得到无水聚乙烯亚胺PEI，所述无水氯化钙的使用量以每10g干燥0.5～1g PEI计。
步骤(1)所述有机溶剂为体积比为1:1～2的甲醇和四氢呋喃混合液。
所述甲醇为无水甲醇，由以下方法制备得到：将氢化钙加入到无水甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2克计；所述四氢呋喃为无水四氢呋喃，由以下方法制得：将氢化钙加入到无水四氢呋喃中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到干燥好的无水四氢呋喃，所述氢化钙的加入量以每500mL四氢呋喃中加入1～2克计。
步骤(1)所述甲醇钠为无水甲醇钠，由以下方法制得：称取一定量的甲醇钠置于真空干燥箱中，在真空干燥箱中放置一定量的无水氯化钙，然后升高温度至60～100℃真空干燥1～3天，得到无水甲醇钠，所述无水氯化钙的使用量以每10g干燥1～2g甲醇钠计。
步骤(1)所述有机溶剂的用量以每20～30mL溶解0.1～0.5g聚乙烯亚胺计。
步骤(1)所述聚乙烯亚胺和甲醇钠的质量比为1:10～100。
步骤(1)所述聚乙烯亚胺加入有机溶剂后，需搅拌溶解5～30min。所述混合均匀的时间为30～60min。所述负载NO反应前，先向反应器中通入10～20min压强为20～50psi的氮气，以排除反应器中的空气。所述反应结束后，向反应器中通入30～60min压强为20～50psi的氮气，以排除未反应的NO。
步骤(1)所述室温指5～35℃。
步骤(1)所述洗涤为用水乙醚沉降洗涤2～3次；所述干燥为15～35℃条件下真空干燥12～24h；所述乙醚为无水乙醚，由以下方法制得：将氢化钙加入到无水乙醚中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到干燥好的无水乙醚，所述氢化钙的加入量以每500mL乙醚中加入1～2克计。
步骤(2)所述聚乙烯亚胺NO供体材料与聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇的比例为0.1～1g：10mL；所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的质量浓度为1～5％。
步骤(2)所述混合均匀的时间为20～30min。所述混合均匀在室温下进行，所述室温指5～35℃。
步骤(3)所述液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80的质量比为1：(1～2)：(1～2)：(0.5～1)：(0.1～0.2)；所述甘油和吐温80的体积比为1：(0.1～0.5)；所述甘油和白凡士林的比例为10mL：5～20g。
步骤(3)所述水的用量以每10mL溶解1～2mL的甘油计。
步骤(4)所述聚乙烯亚胺NO供体材料溶液中的聚乙烯亚胺NO供体材料和步骤(3)混合溶液中的液体石蜡的质量比为1：100～200。
上述方法制得的一种释放一氧化氮软膏。
上述一种释放一氧化氮软膏在生物医学工程材料中的应用。
所述应用为：释放一氧化氮软膏在制备抗菌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明引入多功能NO抗菌制剂，该制剂软膏能够从多方面起到疗效，可治疗皮肤真菌感染、皮炎、湿疹以及细菌性感染，可以极大减轻多种药物联合使用的负担。
(2)本发明以白凡士林、液体石蜡和羊毛脂等油脂性物质为软膏基质，极大地延长PEI/NONOate释放NO的时间，从而极大延长了给药时间间隔，且药物疗效长期明显，极大地减少经济负担。
(3)本发明软膏具有功效确切、局部针对性强、对皮肤无刺激的特点，同时对因致病菌感染所引发的伤口感染具有一定的杀菌促愈合效果。
附图说明
图1为实施例1所得软膏的外观图。
图2为对比例1所得软膏的外观图。
图3为对比例2所得软膏的外观图。
图4为对比例3所得软膏的外观图。
图5为实施例1所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate核磁氢谱图。
图6为实施例1所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate在水和PBS缓冲溶液中的紫外光谱图，其中曲线1为PEI/NONOate在水中的紫外光谱图，曲线2为PEI/NONOate在PBS缓冲溶液中的紫外光谱图。
图7为实施例1步骤(1)所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate、实施例1、对比例1、对比例2和对比例3所得软膏在磷酸盐缓冲液的释放效果图。
图8为实施例1和对比例3所得软膏以及甲氧西林钠对金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌杀菌效果图。
图9为实施例1所得软膏和市售的达克宁软膏对皮肤癣菌(絮状表皮癣菌)杀菌效果图。
图10为实施例1所得软膏和生理盐水处理对治疗因金黄色葡萄球菌伤口感染治疗和促愈合效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本申请实施例所述无水甲醇由以下方法制备得到：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌12小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1克计。
所述无水乙醚由以下方法制备得到：将氢化钙加入到乙醚中，搅拌12小时，然后常压蒸馏，得到无水乙醚，所述氢化钙的加入量以每500mL乙醚中加入1克计。
所述无水四氢呋喃由以下方法制备得到：将氢化钙加入到四氢呋喃中，搅拌12小时，然后常压蒸馏，得到无水四氢呋喃，所述氢化钙的加入量以每500mL四氢呋喃中加入1克计。
所述干燥的聚乙烯亚胺由以下方法制备得到：称取一定量的聚乙烯亚胺PEI于真空干燥箱中，在真空干燥箱中放置一定量的无水氯化钙，然后升高温度至80℃真空干燥2天，最终得到干燥好的聚乙烯亚胺PEI，所述无水氯化钙的使用量以每10g干燥1g PEI计。
所述干燥的甲醇钠由以下方法制备得到：称取一定量的甲醇钠置于真空干燥箱中，在真空干燥箱中放置一定量的无水氯化钙，然后升高温度至80℃真空干燥2天，最终得到干燥好的甲醇钠，所述无水氯化钙的使用量以每10g干燥1g甲醇钠计。
实施例1
(1)聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate的制备
室温35℃条件下，取一定质量干燥的聚乙烯亚胺(数均分子量为600)溶于无水甲醇和四氢呋喃的混合溶液(无水甲醇和四氢呋喃体积比为1:1)中，所述无水甲醇用量以每10mL溶解0.1g PEI计，溶解5min后加入干燥好的甲醇钠，其中聚乙烯亚胺PEI和甲醇钠的质量比为1:10，继续溶解稳定30min后，得到混合溶液，将混合溶剂加入到高压反应釜中，密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(20psi)20min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi)，室温35℃下反应7天。反应结束后，向反应釜中通入30min、50psi的高纯氮气排出未反应的NO后，打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤反应产物2次，25℃条件下真空干燥24h，得到聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate，-4℃低温保存于干燥器内。
(2)一种释放一氧化氮软膏的制备
a、室温25℃条件下取步骤(1)所得的PEI/NONOate溶于聚乙烯醇水溶液中，持续搅拌20min后得到PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液，静置备用；其中PEI/NONOate的用量为0.05g，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为5％，聚乙烯醇用量以每10mL溶解0.1g PEI/NONOate计。
b、将一定比例的液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，加热至50℃成油相备用；将甘油、司盘80和吐温80溶于去离子水，加热至70℃成水相备用；将60℃的水相溶液加入到50℃油相中，边加边搅拌至完全混匀后冷却至室温25℃，得到混合溶液备用；其中液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80质量比为1：1：1：0.5：0.1，甘油和吐温80体积比为1：0.1，去离子水用量以每10mL溶解1mL的甘油计，将油相和水相混合后溶液中以每10mL甘油溶解5g的白凡士林计。
c、在50℃条件下，将步骤a中PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液缓慢滴加到步骤b所得的混合溶液中，快速搅拌至完全均匀后冷却至室温并密封储存，最终得一种释放一氧化氮软膏；PEI/NONOate与步骤b溶液中液体石蜡的质量比为1：100。
对比例1
(1)聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate的制备方法方法同实施例1中的步骤(1)。
(2)一种释放一氧化氮软膏的制备
a、室温25℃条件下取步骤(1)所得的PEI/NONOate溶于去离子水中，持续搅拌20min后得到PEI/NONOate的水溶液，静置备用；其中PEI/NONOate的用量为0.05g，去离子水用量以每10mL溶解0.1g PEI/NONOate计。
b、将一定比例的液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，加热至50℃成油相备用；将甘油、司盘80和吐温80溶于去离子水，加热至70℃成水相备用；将60℃的水相溶液加入到50℃油相中，边加边搅拌至完全混匀后冷却至室温25℃，得到混合溶液备用；其中液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80质量比为1：1：1：0.5：0.1，甘油和吐温80体积比为1：0.1，去离子水用量以每10mL溶解1mL的甘油计，将油相和水相混合后溶液中以每10mL甘油溶解5g的白凡士林计。
c、在50℃条件下，将步骤a中PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液缓慢滴加到步骤b所得的混合溶液中，快速搅拌至完全均匀后冷却至室温并密封储存，最终得一种释放一氧化氮软膏；PEI/NONOate与步骤b溶液中液体石蜡的质量比为1：100。
取1g对比例1制得的软膏于样品瓶中冷却5h至室温后对其状态进行观察，结果如图2所示，可以清楚看到该溶液有明显的分层现象，软膏粘度低，凝胶状态不明显，这样极大地影响其释药和应用效果，所以聚乙烯醇的加入对该软膏油相和水相的充分混合，实现软膏均一化具有明显的调控效果。
对比例2
(1)聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate的制备方法方法同实施例1中的步骤(1)。
(2)一种释放一氧化氮软膏的制备
a、室温25℃条件下取步骤(1)所得的PEI/NONOate溶于聚乙烯醇水溶液中，持续搅拌20min后得到PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液，静置备用；其中PEI/NONOate的用量为0.05g，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为5％，聚乙烯醇用量以每10mL溶解0.1g PEI/NONOate计。
b、将一定比例的液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，加热至50℃成油相备用；将甘油、司盘80和吐温80溶于去离子水，加热至70℃成水相备用；将60℃的水相溶液加入到50℃油相中，边加边搅拌至完全混匀后冷却至室温25℃，得到混合溶液备用；其中液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80质量比为1：1：0.1：0.05：0.05，甘油和吐温80体积比为1：0.1，去离子水用量以每10mL溶解1mL的甘油计，将油相和水相混合后溶液中以每10mL甘油溶解5g的白凡士林计。
c、在50℃条件下，将步骤a中PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液缓慢滴加到步骤b所得的混合溶液中，快速搅拌至完全均匀后冷却至室温并密封储存，最终得一种释放一氧化氮软膏；PEI/NONOate与步骤b溶液中液体石蜡的质量比为1：100。
取1g对比例2制得的软膏于样品瓶中冷却5h至室温后对其状态进行观察，结果如图3所示，软膏状态均一，长时间状态下未发生分层现象，这说明凡士林、羊毛脂和司盘80比例的改变从而导致冷却后凝胶状态较弱，极大的影响其应用效果，所以软膏基质比例是实现NO软膏进一步临床应用的主要条件。
对比例3
(1)聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate的制备
室温35℃条件下，取一定质量干燥的聚乙烯亚胺(数均分子量为600)溶于无水甲醇和四氢呋喃的混合溶液(无水甲醇和四氢呋喃体积比为1:1)中，所述无水甲醇用量以每10mL溶解0.1g PEI计，溶解5min后加入干燥好的甲醇钠，其中聚乙烯亚胺PEI和甲醇钠的质量比为1:10，继续溶解稳定30min后，得到混合溶液，将混合溶剂加入到高压反应釜中，密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(20psi)20min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(80psi)，室温35℃下反应7天。反应结束后，向反应釜中通入30min、50psi的高纯氮气排出未反应的NO后，打开反应釜，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤反应产物2次，25℃条件下真空干燥24h，得到聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate，-4℃低温保存于干燥器内。
(2)一种释放一氧化氮软膏的制备
a、室温25℃条件下取步骤(1)所得的PEI/NONOate溶于聚乙烯醇水溶液中，持续搅拌20min后得到PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液，静置备用；其中PEI/NONOate的用量为0.05g，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为5％，聚乙烯醇用量以每10mL溶解0.1g PEI/NONOate计。
b、将一定比例的液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，加热至50℃成油相备用；将甘油、司盘80和吐温80溶于去离子水，加热至70℃成水相备用；将60℃的水相溶液加入到50℃油相中，边加边搅拌至完全混匀后冷却至室温25℃，得到混合溶液备用；其中液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80质量比为1：3：5：5：0.05，甘油和吐温80体积比为1：1，去离子水用量以每10mL溶解1mL的甘油计，将油相和水相混合后溶液中以每10mL甘油溶解5g的白凡士林计。
c、在50℃条件下，将步骤a中PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液缓慢滴加到步骤b所得的混合溶液中，快速搅拌至完全均匀后冷却至室温并密封储存，最终得一种释放一氧化氮软膏；PEI/NONOate与步骤b溶液中液体石蜡的质量比为1：100。
取1g对比例3制得的软膏于样品瓶中冷却至5h至室温后对其状态进行观察，结果如图4所示，我们可以清楚看到该软膏状态均一，长时间下状态始终稳定，但是该软膏粘度过大，说明凡士林、羊毛脂和司盘80比例的改变从而导致冷却后凝胶状态较强，对其NO释放和抗菌效果进行深入探究是实现NO软膏进一步临床应用的主要依据。
实施例2
聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate制备
室温25℃条件下，取一定质量干燥的聚乙烯亚胺(数均分子量为70000)溶于无水甲醇和四氢呋喃的混合溶液(无水甲醇和四氢呋喃体积比为1:2)中，所述无水甲醇用量以每10mL溶解0.5g PEI计，溶解30min后加入干燥好的甲醇钠，其中聚乙烯亚胺PEI和甲醇钠的质量比为1:100，继续溶解稳定60min后，得到混合溶液，将混合溶剂加入到高压反应釜中，密封并检测气密性。高纯氮气维持反应釜(50psi)10min排除反应釜内的空气，然后通入NO气体(120psi)室温25℃下反应3天。反应结束后，向反应釜中通入30min、50psi的高纯氮气排出未反应的NO后，取出反应产物。用无水乙醚沉降洗涤反应产物3次，35℃条件下真空干燥12h，得到聚乙烯亚胺(PEI)NO供体材料PEI/NONOate，-20℃低温保存于干燥器内。
(2)一种可持续释放NO的新型皮肤外用软膏制备
a、室温35℃条件下取步骤(1)所得的PEI/NONOate溶于聚乙烯醇水溶液中，持续搅拌30min后得到PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液，静置备用；其中PEI/NONOate的用量为0.1g，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为5％，聚乙烯醇用量以每10mL溶解1g PEI/NONOate计。
b、将一定比例的液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂混合均匀，加热至60℃成油相备用；将甘油、司盘80和吐温80溶于去离子水，加热至80℃成水相备用；将70℃的水相溶液加入到60℃油相中，边加边搅拌至完全混匀后冷却至室温35℃，得到混合溶液备用；其中液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80质量比为1：2：2：1：0.2，甘油和吐温80体积比为1：0.5，去离子水用量以每10mL溶解2mL的甘油计，将油相和水相混合后溶液中以每10mL甘油溶解20g的白凡士林计。
c、在40℃条件下，将步骤a中PEI/NONOate的聚乙烯醇水溶液缓慢滴加到步骤b所得的混合溶液中，快速搅拌至完全均匀后冷却至室温并密封储存，最终得一种释放一氧化氮软膏；PEI/NONOate与步骤b溶液中液体石蜡的质量比为1：200。
实施例3
取1mg实施例1步骤(1)得到的聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate溶解于1mL氘代重水(D2O)中，溶液澄清、透明、无悬浮物或杂志，用干净的核磁共振专用样品管于核磁共振仪(NMR-Bruker-300)上检测。引用氘代溶剂残留峰：(重水4.70ppm)。实验结果如图5所示，NO供体材料PEI/NONOate的核磁峰表述如下，(D2O,300MHz)δ-1.25(t,6H,J＝10Hz),1.85(t,2H,J＝10Hz),2.57(s,1H),2.72(s,1H),3.15(s,1H),3.40(s,1H),3.56(q,6H,J＝25Hz),3.76(t,2H,J＝10Hz)。与干燥的原料PEI核磁峰相比较，我们发现由于NO特征基团NONOate的出现，PEI上仲胺基团临位的亚甲基(图中b位置)特征峰由原来2.7ppm向3.15ppm发生了转移，所以可以判定NO供体材料PEI/NONOate的成功制备。
实施例4
将实施例1步骤(1)所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate溶解于蒸馏水中配制成浓度为0.1mg/ml的水溶液，进行紫外光谱测定，结果如图6所示，PEI/NONOate相比于没有负载NO的PEI在252nm处为NONOate特征基团吸收峰，如图6中的曲线1所示。将实施例1步骤(1)所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate溶解于PBS缓冲液(pH值为7.4)中配制成0.1mg/ml PEI/NONOate的PBS缓冲溶液，一段时间后，由于PEI/NONOate释放出NO后会转化为NO2 -,然后加入格里斯试剂(购自于上海碧云天生物科技有限公司，并根据试剂盒要求进行检测)，通过进行紫外光谱测定，在540nm处出现明显偶氮类染料吸收峰，这是由于NO2 -与格里斯试剂反应后所生成的偶氮类化合物，如图6中的曲线2所示。实验结果证明，NO供体材料PEI/NONOate成功制备。
实施例5
称取实施例1步骤(1)所得聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate、实施例1、对比例1、对比例2和对比例3所得软膏各5mg，在37℃下分别分散于5ml的磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.4)中，每隔一段时间经5000rpm离心5min，取50μL离心后的上清液再与50μL PBS缓冲液(pH值为7.4)混合，然后加入100μL格里斯试剂(购自于上海碧云天生物科技有限公司)，避光保存15min，然后在540nm波长下使用酶标仪测定其吸光度，绘制释药曲线。如图7所示，相比较于实施例1步骤(1)中的聚乙烯亚胺NO供体材料PEI/NONOate而言，对比例1和实施例1所得的软膏，释放周期有着明显的延长，这说明白凡士林等基质的加入，对离子型聚乙烯亚胺NO供体PEI/NONOate有着明显的保护缓慢释放效果，但是相比较于实施例1的半衰期延长到10h左右，释放周期可达到4天左右实验结果而言，白凡士林等油脂基质各个组分比例的控制是实现NO软膏缓慢释放重要条件，实施例1所提供的NO白凡士林的基质比例，能够极大的增加了NO释放周期，达到长时间延迟释放NO的效果，同时考虑人体涂药及更换涂药频率问题，发现该比例下的软膏满足人体治疗频率及周期要求，而发现对比例1所得的软膏释放半衰期较短，与离子型聚乙烯亚胺NO供体PEI/NONOate相似，这是由于PEI/NONOate材料未添加聚乙烯醇材料作为NO离子型供体水相保护剂，导致NO在后期释放速率较快，这说明聚乙烯醇的加入能够增加油相基质白凡士林等材料和水相NO供体材料的相互作用，从而实现油相基质材料对水相NO供体类材料的充分包裹效果，实现更长时间的NO释放效果。对比例2所得的软膏释放半衰期与对比例1相似，虽然释放周期有所延长至48h左右，但是由于其释药周期较快，所以很难满足皮肤类软膏要求，所以该对比例2进一步说明，白凡士林等油脂基质各个组分比例的控制是实现NO软膏缓慢释放重要条件。对比例3所得的软膏，由于白凡士林等油脂基质各个组分比例的变化，导致该软膏5天后的释药量仅为20％左右，虽然该软膏能够实现长久释药的目的，但是在该比例下得到的软膏，不仅粘度较大，质地较硬，一定时间内释药量较少，可能过会导致抗菌效果不明显。
实施例6
取实施例1和实施例2所得软膏，经离心(3000r/min，离心30min)无分层，膏体细腻，黏度适中，涂布性好。取实施例1和实施例2所得软膏，分别按照中国药典2015年版二部方法测定动力黏度，采用NDJ-1型旋转式粘度计，结果表明，本发明所制备的软膏的黏度适宜，结果如表1所示。适合应用于皮肤外涂敷制剂。
表1
样品 动力黏度(Pa·s)
实施例1 39
实施例2 40
实施例7
分别取1mg实施例1所得软膏、甲氧西林钠和对比例3所得的软膏，在37℃条件下分别加入到含相同浓度和处在相同生长对数期的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌(购自于广东省微生物菌种保藏中心，GIM1.771)的培养液中(细菌浓度为1.0*108CFU/mL)培养6h后，离心去除软膏和甲氧西林钠)，将含金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌的培养基进行铺板并置于培养箱中12h后(培养温度为37℃，湿度为45％)，计算琼脂板上细菌数量，结果如图8所示，相较于空白组(加入生理盐水)，添加了甲氧西林钠的细菌板明显依然有大量的金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌存在，这样的结果说明，该金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌确实为具有耐药性，且为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌，说明了实验的准确性与严谨性。对比例3样品组依然存在大量的金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌，抗菌效果较弱，这是由于对比例3所得的软膏黏度较大，质地较硬，NO释放周期较长，在6h后NO未能达到有效的杀菌浓度，所以该比例下所得到的软膏，未能满足要求。相比较于其他组而言，实施例1所得软膏处理的细菌板上的细菌明显减少很多，说明NO软膏对耐药性金黄色葡萄球菌亚种黄色葡萄球菌具有明显的杀菌效果，而且所表现出来的在抗菌效果上也是很明显的，该实验结果说明NO软膏在一定的时间内确实对耐药性细菌具有良好的杀菌效果，所以该NO软膏为治疗因耐药性致病微生物引起皮肤感染性疾病提供可能。
实施例8
分别取相同质量实施例1所得软膏和市售的达克宁软膏，然后分别加入到处于生长活跃期的絮状表皮癣菌(购自于广东省微生物菌种保藏中心，GIM3.599)培养基(真菌浓度为1.0*105CFU/mL)中培养48h后(培养温度为26℃，湿度为65％)，离心去除材料(软膏和达克宁软膏)，将含絮状表皮癣菌的培养基进行铺板并置于培养箱中24h后(培养温度为30℃，湿度为55％)，计算琼脂板上真菌数量，结果如图9所示，我们发现相较于空白组(生理盐水)而言，市售的达克宁软膏具有一定明显的杀死足癣真菌(絮状表皮癣菌)效果，然而经NO软膏处理后的真菌数量明显减少最为明显。该实验结果说明本发明NO软膏抗真菌效果已到达市售的软膏效果且效果更为突出，所以该NO软膏为治疗因真菌等引起皮肤感染性疾病提供可能。
实施例9
构建大鼠皮肤伤口感染模型(金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213创伤感染模型)，利用实施例1所得的NO软膏直接对大鼠伤口进行处理，每天处理一次，共处理10天，10天后对经NO软膏处理的大鼠皮肤伤口进行苏木精-伊红(H&E)和Masson染色病理分析，分析本发明NO软膏对伤口的抗菌愈合性能。相同条件下，以生理盐水处理的大鼠伤口愈合速率作为空白对照组，实验结果如图10所示，在对各个伤口持续给药10天后，观察伤口恢复的整个过程，与空白对照组伤口相比较发现，通过苏木精-伊红(H&E)切片中可以看到伤口已经有大量的肉芽组织组织，毛囊组织明显，皮肤已基本恢复正常功能，并通过Masson染色发现，经本发明NO软膏处理后的伤口相较于空白组而言，缺损皮肤中发现大量的胶原蛋白生成，伤口愈合率达到90％左右，该结果本发明的NO软膏具有明显的促愈合效果。最终实验结果证明本发明的可释放一氧化氮软膏材料具有高效的体内外抗耐药菌和显著的伤口愈合效果，有望成为一种新型的体外抗菌软膏。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中，加入甲醇钠，混合均匀，在室温、80～120psi NO气体条件下进行负载NO反应3～7天，结束反应，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺NO供体材料；
（2）将聚乙烯亚胺NO供体材料溶于聚乙烯醇水溶液中，混合均匀，得到聚乙烯亚胺NO供体材料溶液；
（3）将液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林和羊毛脂在50～60℃下混合均匀，得到油相；将甘油、司盘80和吐温80加入水中，70～80℃下混合均匀，得到水相；将70～80℃的水相加入到50～60℃的油相中，搅拌均匀后，得到混合溶液；
（4）在25～50℃下，将聚乙烯亚胺NO供体材料溶液加入到步骤（3）的混合溶液中，搅拌均匀，密封，得到释放一氧化氮软膏；
步骤（3）所述液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂和司盘80的质量比为1：（1～2）：（1～2）：（0.5～1）：（0.1～0.2）；所述甘油和吐温80的体积比为1：（0.1～0.5）；所述甘油和白凡士林的比例为10mL：5～20g。
2.根据权利要求1所述一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙烯亚胺和甲醇钠的质量比为1:10～100；步骤（1）所述有机溶剂的用量以每20～30mL溶解0.1～0.5g聚乙烯亚胺计。
3.根据权利要求2所述一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述聚乙烯亚胺NO供体材料溶液中的聚乙烯亚胺NO供体材料和步骤（3）混合溶液中的液体石蜡的质量比为1：100～200。
4.根据权利要求2所述一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述聚乙烯亚胺NO供体材料与聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇的比例为0.1～1g：10mL；所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的质量浓度为1～5%。
5.根据权利要求2所述一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述聚乙烯亚胺的数均分子量为600～70000；步骤（3）所述水的用量以每10mL溶解1～2mL的甘油计。
6.根据权利要求2所述一种释放一氧化氮软膏的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述有机溶剂为体积比为1:1～2的甲醇和四氢呋喃混合液；所述聚乙烯亚胺加入有机溶剂后，需搅拌溶解5～30min；所述混合均匀的时间为30～60min；
步骤（1）所述负载NO反应前，先向反应器中通入10～20min压强为20～50psi的氮气，以排除反应器中的空气；所述反应结束后，向反应器中通入30～60min压强为20～50psi的氮气，以排除未反应的NO；
步骤（1）所述洗涤为用水乙醚沉降洗涤2～3次；所述干燥为15～35℃条件下真空干燥12～24h；步骤（2）所述混合均匀的时间为20～30min。
7.权利要求1～6任一项所述方法制得的一种释放一氧化氮软膏。
8.权利要求7所述一种释放一氧化氮软膏在制备抗菌药物中的应用。
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