CN1104200C - N－膦酰基甲基甘氨酸及其衍生物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及草甘膦或其衍生物用于提高作物的产率和/或质量的新的用途，其中所说的作物对选自制糖甜菜、饲用甜菜、玉米、油料种子油菜和棉花的草甘膦有耐受性。
Description
本发明涉及草甘膦、即N-(膦酰基甲基)甘氨酸及其衍生物(如其盐和酯)作为用于提高对草甘膦有耐受性的作物产量的试剂的新用途。
众所周知草甘膦为一种有效的系统的、叶活性的(出苗后)非选择性除草剂。已知草甘膦可以作用于各种酶系统，从而干扰所处理的植物中氨基酸及其它内源化学物质的形成。由于酸式草甘膦的水溶性相当低，因此草甘膦基本上呈固态盐的形式，比如单-异丙基铵盐、铵盐、钠盐或其它盐。
众所周知的按制剂制造的产品包括活性成分和表面活性剂或表面活性剂的混合物，并且可能还包括其它添加剂，比如防沫剂、防冻剂、染料和现有技术中已知的其它试剂。还可以参阅由E.Grossbard和D.Atkinson编辑的书籍“除草剂草甘膦”，Butterworth & Co，1985。
US-3 853 530描述了N-膦酰基甲基甘氨酸及其衍生物用于改变植物的自然生长或发育的用途，例如用于脱叶和阻滞植物生长。在某些植物中，据说这种阻滞会造成主干更加低矮并增加了侧枝的分枝。这种自然生长或发育的改变将生产出更为低矮、更加繁茂的植物，它们通常表现出对干旱和虫害侵染的抗性有所提高。假如是草皮草的话，对植物生长的阻滞也可能是非常合乎需要的，因而可以提高根的发育以便提供繁茂、更加结实的草皮并且可以延长草地、高尔夫球场及类似的长满草的地方割草的时间间隔。在多种植物中(如青储饲料作物、土豆、甘蔗、甜菜、葡萄、甜瓜和果树)，据说由草甘膦引起的对植物生长的阻滞将造成在收获时这些植物的糖类的含量的增加。显而易见，这些应用中需要亚致死剂量，否则会杀死处理过的植物。
US-3 988 142更为具体地涉及N-膦酰基甲基甘氨酸及其衍生物用于提高植物(如甘蔗)中糖类沉积的用途。而且，所用的比率为亚致死比率并且在收获之前不久即施加。
在上面提到的两个实例中，人们认为草甘膦除草剂的非致死剂量(即远远低于一般用来与庄稼地中的杂草群做斗争的剂量的剂量)造成减少或阻滞了植物生长并且活性物质遵循着它在植物中发挥其除草剂作用时所遵循的正常途径。在US-3 988 142的情况下，人们认为对植物生长的阻滞可以使植物中更多的可利用的糖类转化成淀粉或蔗糖，而不是用作用于继续生长的植物食物。
DE-3 200 486涉及通过用亚致死剂量的膦丝菌素(glufosinate)处理作物来提高作物的产量，其中的膦丝菌素也为一种有效的非选择性除草剂。同样，人们认为通过亚致死剂量的除草剂抑制植物的生长造成了植物或其果实中糖类的增加。DE-3 200 486在对比实施例(实施例II)中提到了草甘膦，该实施例的目的在于表明在同样的比率下膦丝菌素比草甘膦的效果要好。
EP-0 401 407涉及类似的主题内容。它公开了亚致死比率的非选择性除草剂(诸如特别是草甘膦和膦丝菌素)在从植物的物质生长阶段到成熟阶段过渡的过程中为了提高在除甘蔗以外的产糖或产淀粉的植物(如制糖甜菜、土豆或玉米)中糖类沉积的用途。
WO 95/05082描述了一种提高对谷氨酰胺合成酶抑制剂(如膦丝菌素)具有抗性的作物产量的方法，其中通过以如用于和庄稼地中的杂草斗争的一样比率的除草剂来处理所说的作物。该文献进一步指出具有不同作用方式的除草剂没有这一效果或者它们通常对作物的产量表现出负作用。
最近在基因技术方面的研究开发已经使得经过遗传转化植物、更为具体地讲为转化作物从而使它们可以耐受对草甘膦或其衍生物成为可能。例如，EP-0 218 571涉及一种包括编码EPSPS多肽的基因的克隆或表达载体，其中当在植物细胞中进行表达时，这种多肽赋予了由上述细胞再生的植物对草甘膦的耐受性。EP-0 293 358进一步涉及通过生产突变的EPSP合酶来提高能耐受受草甘膦的植物的效能，其中当该酶维持催化活性时它表现出对草甘膦更低的亲和力。WO92/00377公开了编码草甘膦氧化还原酶的基因。该基因在生产降解草甘膦除草剂并对草甘膦除草剂有耐受性的转化植物中是很有用的。WO92/04449公开了编码第II类EPSPS酶的基因，该基因在生产对草甘膦除草剂有耐受性的转化植物中是很有用的。在上述作物出苗后，通过施加草甘膦除草剂可以维持这些作物基本上不含杂草。《化学文摘》1996年第124卷第8期提到了由B.H.Wells发表于《杂草》(1995)中的命名为“开发能耐受草甘膦的作物投放市场”的文章。该作者证实已经使用了两种途径来赋予在几种作物中对商业水平的草甘膦具有耐受性。
由I.Brants等人发表的称作“Roundup ReadyTM制糖甜菜”的文章表明在经遗传修饰的制糖甜菜植物中已经获得了商售的Roundup的耐受性水平，其中该文章于1996年早些时候在“关于杂草和作物对除草剂的抗性的国际专题讨论会记录汇编”中出版，该专题讨论会已于1995年4月3日-6日举行。
现在已经出乎意料地发现即使用正常致死比率的草甘膦除草剂或者用正常用于与杂草斗争的比率来处理种有已经能耐受草甘膦除草剂的作物(如甜菜作物、油料种子油菜或玉米)的庄稼地时，作物的产量仍有所提高。由于在没有耐受性的作物中作物会被杀死并且膦丝菌素除草剂具有完全不同于草甘膦除草剂的作用方式，因此从上述现有技术中无法预料到这一出乎意料的效果。
《化学文摘》1995年第123卷第21期出版了一篇由X.Delannay和其他人发表的文章的文摘(文摘号281158c)，该文摘涉及在用草甘膦处理能耐受草甘膦的大豆系后对该大豆系产量的评价。这篇文章的作者得出如下结论：数据的趋势通常暗示着不存在实际的差别，并且与标准的除草剂检验的比较强化了草甘膦处理的整体产量安全性的结论，而且人们了解到变化性是由于不利的天气和/或土壤条件造成的。
在上述提到的《杂草》(1995)中，B.H.Wells也指出在不同的作物阶段唯一一次或连续地撒播施加草甘膦之后，观察不到产量明显的降低。据说能耐受草甘膦的棉花的领导系(lead line)在施加草甘膦之后没有表现出产量的降低。就有关作物对有关除草剂具有的耐受性而论，得到上述评价证实了有关作物遗传修饰的效果。在该文章中不含数据，并且找不出在施加草甘膦后可能会提高作物产量的相应内容或暗示。
尽管以前提到的I.Brants等人的文章显示出在与标准相比的几种草甘膦处理下能耐受草甘膦的制糖甜菜的三种不同系的平均根重(％)的数据，其中所说的三种不同系的特征在于三种不同的转化过程，但是本领域的普通技术人员仍不能从所示的数据中得出甜菜产量的提高。上述数据已恰好表示为耐受性测试数据。所示的这些数据并未表明制糖甜菜的产量有任何的提高，这是因为在不含杂草的条件下不能进行对耐受性的评价并因而可以在标准的样地中允许杂草竞争。而且正如本领域普通技术人员将要认识到的那样，所示的数据是在小块样地中得到的非常早期的、没有重复性的、由于种子的可利用率仅在一个地方获得的数据。此外，这些早期的种子仍含有分离种子的物质，这就造成了与标准物相比为不规则的作物的植物群丛(stands)；结果，平均根重以每株植物来计算(而不是以每单位面积计算)并且将与在不同条件下生长的标准植物进行比较。本领域普通技术人员可以从上述文章中得出的唯一结论为已经发现这三种制糖甜菜的系显示出一定水平的耐受性，这就有潜力进行商业开发。
根据本发明，测试已经表明当与没有用草甘膦除草剂处理的同样的作物比较时，用草甘膦除草剂处理的能耐受草甘膦的作物(如制糖甜菜、油料种子油菜、玉米或棉花)的产量(该产量以每单位表面积表示)提高最高可达到大约50％。人们认为产量的提高并不是仅仅因为由于施加了草甘膦除草剂从而使杂草和作物之间的竞争减少所致，因为已经注意到对允许生长在基本不含杂草的条件下的作物的影响。此外，已经注意到没有如记录的现有技术中所了解的那种生长调节作用：已经注意到不存在对生长的短期阻滞或者任何其它对作物的自然生长或发育的短期改变。
因此，本发明涉及草甘膦或其衍生物用于提高能耐受草甘膦的作物的产量的用途。
优选以通常用于控制杂草群以便同时杀死杂草的致死剂量来施加草甘膦。草甘膦除草剂可以施加一次或者在几次连续的处理中施加。取决于气候条件、季节、杂草侵染、杂草植物的阶段以及现有技术中本领域普通技术人员所知的作物和其它参数，施加比率通常包括在0.2和6.0kg酸当量/ha之间的范围内。
草甘膦除草剂可以以其酸的形式或以其衍生物来施加，其中优选为其盐，如单异丙基铵盐、钠盐或铵盐或其混合物。也可以使用草甘膦的其它盐，该盐中的阳离子自身没有除草剂的活性或植物毒性。
已经注意到草甘膦除草剂的处理对能耐受草甘膦的作物带来的产量增加的作用，其中的作物选自甜菜(如制糖甜菜或饲用甜菜)、玉米、油料种子油菜、和棉花，而这种作用与用于造成对草甘膦有耐受性的技术无关。
上述作用对能耐受草甘膦的制糖甜菜和饲用甜菜特别显著。
草甘膦除草剂例如可以以其酸的形式或者以其衍生物的形式来施加，比如水溶性的或分散性的颗粒、在喷雾水中稀释的水溶性浓缩物，或者可以以其它制剂类型的形式来施加，比如乳状液、包有胶囊的活性成分及其它形式。
草甘膦除草剂可以在不同的植物生长阶段施加一次或连续地施加。已经表明当在有关植物的生长阶段施加草甘膦除草剂进行处理时，这种处理对能耐受草甘膦的作物的影响最为显著。
在“McCutcheon’s乳化剂和洗涤剂”中可以找到上述制剂的佐剂，并且这些佐剂可以便利地选自下列物质：
-胺，诸如乙氧基化的烷基胺、具体为牛油胺、椰子烷基胺、以商品名Ethomeen出售的表面活性剂，氧化胺、诸如以商品名Empigen OB出售的表面活性剂；
-季铵盐，诸如乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐、更具体为以商品名Ethoquad，Emcol CC和Dodigen出售的表面活性剂；
-烷基聚糖苷、烷基糖苷、葡萄糖-酯和蔗糖-酯。
最优选的为季铵盐(例如在EP-0 441 764中限定的季铵盐)，也可能是与湿润剂形成的混合物，其中最优选为烷氧基化山梨聚糖酯alkoxylated sotbitan ester。这类表面活性剂或表面活性剂的混合物对作物没有明显的植物毒性的影响，并且由于其对环境友好的特性因此优先使用。
特别感兴趣的季铵盐为三甲基乙氧基聚氧化丙基(ethoxypolyoxypropyl)氯化铵。
实施例1
根据适当的农艺学的习惯作法在一排中以4.5cm的间作距离并用手使作物变稀疏以确保正常的作物的植物丛群(stand)并且根据随机的区组(block)设计来种植制糖甜菜植物，其中所说的制糖甜菜植物已根据EP-0 218 571中公开的技术进行了遗传修饰以使该植物对草甘膦具有耐受性；样地的大小为2.7×6m；每块样地中种6排植物并且排与排之间的距离为0.45m。对每项测试采用四次重复试验。
保持测试样地基本上不含杂草：这可以通过出苗前施加除草剂、如果是有要求和规定的情况下通过如下详述的在出苗后施加草甘膦进行处理或者通过标准的正式采纳的甜菜处理方法(出于进行比较的目的)来实现。应用了以下处理：N.1 标准量的制糖甜菜的除草剂N.2 标准量两倍的制糖甜菜的除草剂N.3 3×720g a.e/ha的配制的草甘膦N.4 3×1080g a.e/ha的配制的草甘膦N.5 3×1440g a.e/ha的配制的草甘膦N.6 2×2160g a.e/ha的配制的草甘膦
如果连续施加了三次草甘膦除草剂的话，那么第一次施加是在作物长出2-4片叶子的阶段中进行的；第二次施加是在作物长出6-8片叶子的阶段中进行的；第三次施加是在作物长出10-12片叶子的阶段中、但在株冠闭合之前进行的。
如果连续进行两次施加的话，那么第一次施加是在作物长出2-4片叶子的阶段中进行的，而第二次施加是在作物长出10-12片叶子的阶段中进行的。
草甘膦除草剂的制剂包括360g草甘膦a.e./l(以其异丙基铵盐的形式加入)以及180g/l由三甲基乙氧基聚氧化丙基(8)氯化铵和乙氧基化(20)山梨聚糖酯(80∶20)组成的表面活性剂。在2bar的压力下以200l/ha的水体积来施加草甘膦的制剂产品。
在收获时测量新鲜的根的重量。经过标准处理N.1之后的新鲜根重被视为产量为100％，并把测得的新鲜根重与标准处理N.1的结果相关联。表I.a Trt
％产量(每公顷的新鲜根重)1* 1002* 963 1084 1085 1106 113
*标准的处理包括如下的三次施加：
表I.b Trt
％产量(每公顷的新鲜根重)1* 1002* 1023 1104 1135 1176 113
| Herbasan | 1.0L/ha | 1.0L/ha | 1.0L/ha |
| Ethosan | 0.1L/ha | 0.2L/ha | 0.2L/ha |
| Goltix | 1.0Kg/ha | 1.0Kg/ha | 1.0Kg/ha |
| Renol S | 0.3L/ha | 0.3L/ha | 0.3L/ha |
*标准的处理包括如下的三次施加：
表I.c Trt
％产量(每公顷的新鲜根重)1* 1002* --3 1294 1565 1366 132
| Goltix | 1.7Kg/ha | 0.75Kg/ha | 1.0Kg/ha |
| Actipron | 1.7L/ha | ||
| Betanal E | 2.0L/ha | ||
| Venzar | 0.4L/ha | ||
| Goltix | |||
| Betanal prog. | 2.0L/ha |
*标准的处理包括一次出苗前施加和两次出苗后施加正式采纳的制糖甜菜的除草剂，具体如下：
| Goltix | 3Kg/ha | 0.5Kg/ha | 0.5Kg/ha |
| Pyramin DF | 2Kg/ha | ||
| Betanal P | 1.0Kg/ha | 1.0L/ha | |
| Stratos | 1.0L/ha |
实施例2
用能耐受草甘膦的饲用甜菜(该饲用甜菜根据同样的技术进行了遗传修饰)重复同样的测试。表II.a Trt
％产量(每公顷的新鲜根重)1* 1002* 1013 1084 1075 1106 111
*该测试的标准(*)包括如下的三次施加：
| Herbasan | 1.0L/ha | 1.0L/ha | 1.0L/ha |
| Ethosan | 0.1L/ha | 0.2L/ha | 0.2L/ha |
| Goltix | 1.0Kg/ha | 1.0L/ha | 1.0Kg/ha |
| Renol S | 0.3L/ha | 0.3L/ha | 0.3L/ha |
除了在出苗前在整个样地中已经施加了一次除草剂的处理之外，用与上面相同的系重复同样的测试，其中的出苗前的处理由1kg/ha的Goltix(商品名)和3l/ha的Betanal E(商品名)组成。表II.b Trt
％产量(每公顷的新鲜根
重)1* 1002* 1003 1084 1105 1136 110
*该测试的标准包括如下的一次施加：
| Goltix | 1Kg/ha |
| Betanal E | 3L/ha |
实施例3
对本实验而言，基本上遵循与实施例1和实施例2相同的实验方案。
根据适当的农艺学的习惯作法在1995年5月的早些时候种植能耐受草甘膦的制糖甜菜的植物。适当时通过用手工清除(未处理)或者通过施加草甘膦除草剂来基本上保持样地不含杂草。草甘膦是以含有360g/l酸当量的草甘膦的异丙基铵盐和180g/l的表面活性剂(三甲基乙氧基聚氧化丙基(8)氯化铵(80)与乙氧基化的(20)山梨聚糖的酯(20))的制剂来施加的。
T1＝长出2-4片叶子的阶段(约为30DAP，其中DAP为种植后的天数)
T2＝长出8-10片叶子的阶段(约为50DAP)
T3＝长出14-18片叶子的阶段(约为65DAP)
针对几种比率的如上详述的草甘膦制剂，下面的表III显示出在180DAP时测得的每株植物的根的平均鲜重(以g为单位)。
表III
| T1 | T2 | T3 | 180DAP g |
| 未处理 | 未处理 | 未处理 | 1420 |
| 2 | 2 | 21 | 1717 |
| 3 | 0 | 31 | 153a |
| 6 | 0 | 61 | 1885 |
| 4 | 0 | 41 | 1904 |
该实验清除地表明在施加几次草甘膦之后，收获时新鲜的根重有所增加。此外也存在产量的增加是所施加的草甘膦的比率的函数的趋势。
也可以把增加的产量转化成收获时相应的植物干重的增加。
实施例4
本实验的目的在于从甜菜质量的角度(根部糖、转化糖、钾、钠、氨基氮的含量；甜菜根和上部样品的养分，诸如％干物质、粗纤维和毒素的含量)，把已经用草甘膦除草剂的制剂喷洒的转基因制糖甜菜和没有用上述除草剂的制剂处理的转基因制糖甜菜进行比较。
制糖甜菜主要用于生产白糖、纸浆和糖蜜的制糖工业中。针对这一目的的甜菜的技术价值一般是通过分析甜菜的糖、钾、钠和氨基氮的含量来评价的。关于甜菜中的毒素，检测了皂苷。
制备样品
在收获后，保持根部在0℃与10℃之间，并且在低于-20℃的温度下冷冻上部样品。
通过半自动处理把甜菜制成糊状物，其中是在甜菜锯中把甜菜切成薄片以生产糊状物的。在对糊状物进行匀桨之后，提取后使用1份子样品来分析旋光(polarization)、转化糖、Na、K和氨基-N，干燥另一份子样品并用于分析养分。冷冻同一糊状物样品的第三部分以分析毒素。用加入了用于澄清的一小片硫酸铝的软化水提取甜菜糊，并将甜菜糊转移到自动的Venema消化和过滤设备中。将大甜菜的上部水平分成相等的子样品。
分析方法：
干物质-烘箱方法(EF 71/393/EφF；L279/7 p.858-6120/12-71)：
根：
在把根加工成糊状物后，将糊状物样品放置在95℃的烘箱中并干燥24小时(至恒重)。
上部：
把样品放置在95℃的烘箱中并干燥最高达72小时直至恒重，其中干燥时间取决于样品的大小。
对根和上部来说，确定重量损失的数量并以干物质的百分数计算。粗纤维-weende方法(EF L 344/36-37 26/11-92改进)：
用规定浓度的硫酸和氢氧化钾的沸腾溶液连续处理样品。通过在带有玻璃棉的Gosch坩埚上过滤来分离残余物，将残余物洗涤、干燥、称重并在3小时内在550℃的闭式烘箱中煅烧。通过重量分析法确定由煅烧引起的重量损失的数量并以样品粗纤维的百分数计算。毒素：皂苷-HPLC方法(Hilmer Sφrensen，KVL 1991，由DC改进)：
该方法是以甜菜皂苷的酸解为基础的。用二氯甲烷提取游离的石竹素。在从样品中蒸发出水份后，将残余物溶解在甲醇中。通过反相HPLC测定石竹素，其中以乙腈/水为洗脱剂、并以UV-检测器在210nm下测定。甜菜提取物的糖含量-旋光(Pol)(ICUMSA，糖分析1979，Proc.1990)：
用PROPOL型旋光计测定用硫酸铝澄清的甜菜提取物，这是以测定旋光度的比值为基础的。在70mm长的试管中在546nm下测量旋光度并将其换算为°Z(Pol％)或g/100g根。甜菜提取物的氨基氮-SMAIIC分析仪(ICUMSA，糖分析1979年改进)：
在与水合茚三酮发生显色反应后，在570nm下用比色计测定用硫酸铝澄清的甜菜提取物。甜菜提取物的钾和钠-SMAIIC分析仪(Technicon，Tech.Publ.THO-0160-10)：
用火焰光度计IV测定用硫酸铝澄清的甜菜提取物，其中分别在589nm和768nm下测量由火焰中的钾和钠发出的光能的强度。用硫酸锂稀释样品，其中的锂用作内部的标准物以比较来自火焰光度计的信号。甜菜提取物的转化糖-SMAIIC分析仪(Technicon，Tech.Publ.THO-0160-10)：
在与硫酸铜新亚铜氢氯化物(neocuproin hydrochlorid)试剂反应后，在560nm下用比色计测定用硫酸铝澄清的甜菜提取物。
在6个不同的地点(意大利、西班牙、比利时、丹麦、法国、英国)培育能耐受草甘膦的制糖甜菜的植物，其中所说的植物根据EP-0 218 571中公开的技术进行遗传转化从而对草甘膦除草剂具有耐受性。
所培育的品种的类型取决于当地的需要。上述材料有许多不同的特性，其中一个重要的特性为由旋光(Pol)计算的糖的含量。可以把制糖甜菜分成下列亚组：E-型、N-型和Z-型。E-型的Pol低，Z-型的Pol高，而N-型的Pol介于E-型和Z-型之间。在北欧培育的品种可以称作E-N型、N型或N-Z型。在本实施例中使用的材料属于N组。
根据当地适宜的农艺学的习惯作法并用手工使作物变稀疏以确保正常的作物的植物丛群来种植制糖甜菜。对每项测试至少进行一次重复试验。
通过施加下列物质保持样地基本上不含杂草：
-在测试样地上的草甘膦除草剂；
-在对照样地上进行标准的甜菜的选择性除草剂的处理(根据地点)；除在丹麦和意大利以外，认为除草甘膦之外别的除草剂对保持不含杂草的条件都不是必须的。
该草甘膦除草剂的制剂与实施例1中所用的制剂相同。如下施加除草的草甘膦的制剂：-出苗前 2.5l/ha-甜菜长出2-4片真正的叶子的阶段 2l/ha-甜菜长出6-8片真正的叶子的阶段 2l/ha-长出12-14片真正的叶子的阶段(株冠闭合) 2l/ha
所施加的选择性除草剂的比率如下：
-西班牙：
3.55kg/ha Goltix WG(metamitron)出苗前
-比利时：
2l/ha Gramoxone
(对草快200)种值前
3l/ha Pyramin FL
(chloridazone 430)种植后1周
0.5/ha Betanal
(Phenmediphame 150)种植后3周
0.5l/ha Goltix
(metamitron 70％ WP)种植后3周
0.5l/ha Tramat
(Ethofumesate 200)种植后3周
0.75l/ha Goltix 种植后5周
0.75l/ha Vegelux
(矿物油40) 种植后5周
0.75l/ha Tramat 种植后5周
0.75l/ha Goltix 种植后6周
0.75l/ha Vegelux 种植后6周
0.17l/ha Fusilade 植后6周
0.75l/ha Betanal 种植后6周
0.75l/ha Tramat 种植后9周
0.75l/ha Betanal 种植后9周
0.75l/ha Goltix 种植后9周
0.75l/ha Vegelux 种植后9周
-法国：
0.75l/ha Goltix WP
(metamitron) 种植后1天
0.75l/ha Goltix WP 种植后2周
0.75l/ha Betanal
(Phenmediphame 150)种植后2周
0.75l/ha Tramat
(Ethofumesate 200) 种植后2周
-英国：
1.0l/ha Laser(cycloxydim)种植后5周
在下表中汇集了分析结果并且再现了平均值，在计算平均值时所有国家具有相当的重量。
| 植物的部分 | 分析的单位 | Trt/Unt | 制糖甜菜 |
| 糊状物根上部 | 干物质(DM)g/100g根转化糖mmol/100g根钾mmol/100g根NH2Nmmol/100g根钠mmol/100g根Polg/100g根干物质g/100g上部 | TrtUntTrtUntTrtUntTrtUntTrtUntTrtUntTrtUnt | 21.30920.4441.0111.7555.1625.2862.4702.8781.1181.76915.61014.47814.72413.996 |
Trt：用草甘膦除草剂喷洒
Unt：没有用草甘膦除草剂喷洒
DM：干物质
上述数据表明用草甘膦除草剂处理的制糖甜菜显示出在根中糖的含量显著提高，而钠、钾、氨基氮和转化糖的含量有所下降。根和上部的干物质也有所增加。更详细的数据暗示着用草甘膦处理的制糖甜菜的叶子含有更高的纤维含量。
把本实施例的结果与前述实施例的结果联系在一起，似乎以前以每公顷的重量评价的产量的提高也反映出收获的物质中干物质、纤维和糖含量的增加。
实施例5
在不同的地点，根据适当的农艺学的习惯作法在一排中以4.5cm的间作距离并用手使作物变稀疏以确保正常的作物的植物丛群并且根据随机的区组设计来种植制糖甜菜和饲用甜菜的植物，其中所说的植物已根据EP-0 218 571中公开的技术进行了遗传修饰以使该植物对草甘膦具有耐受性；样地的大小为2.7×7m；每块样地中种6排植物并且排与排之间的距离为0.45m。对每项测试采用四次重复试验。
保持测试样地基本上不含杂草：这可以通过出苗前在整个区域施加标准的除草剂、要么通过手工除草并且如果合适的话通过如下详述的在出苗后施加草甘膦进行处理来实现。应用了以下处理：仅为手工除草3×720g a.e/ha的配制的草甘膦3×1080g a.e/ha的配制的草甘膦3×1440g a.e/ha的配制的草甘膦2×2160g a.e/ha的配制的草甘膦
如果连续施加了三次草甘膦除草剂的话，那么第一次施加是在作物长出2-4片叶子的阶段中进行的；第二次施加是在作物长出6-8片叶子的阶段中进行的；第三次施加是在作物长出10-12片叶子的阶段中、但在株冠闭合之前进行的。
如果连续进行两次施加的话，那么第一次施加是在作物长出2-4片叶子的阶段中进行的，而第二次施加是在作物长出10-12片叶子的阶段中进行的。
草甘膦除草剂的制剂包括360g草甘膦a.e./l(以其异丙基铵盐的形式加入)以及180g/l由三甲基乙氧基聚氧化丙基(8)氯化铵和乙氧基化(20)山梨聚糖酯(80∶20)组成的表面活性剂。在2bar的压力下以200l/ha的水体积来施加草甘膦的制剂产品。
在收获时测量新鲜的根的重量。仅进行了手工除草的样地的新鲜根重被视为产量为100％，并且把草甘膦处理后测得的新鲜根重与经手工除草的样地的结果相关联。表V ％产量(新鲜根重) Trt
制糖甜菜
饲用甜菜手工除草 100％ 100％3×720g a.e 101 1053×1080g a.e 98 1063×720g a.e 115 1082×2160g a.e 107 102
实施例6
对于本次田间试验而言，在1995年9月中旬根据适当的农艺学的习惯作法以对应于每平方米约有100株植物(正常的作物的植物丛群)的4kg种子/ha并根据随机的区组设计来种植已有遗传背景的冬季油料种子油菜植物，其中的植物已经经过遗传修饰从而呈现出对草甘膦除草剂的耐受性(根据EPSPS表达和草甘膦氧化还原酶表达的技术的结合)；样地大小为3×7m，排与排之间的距离为0.14m；对每项测试进行四次重复试验。
保持样地基本上不含杂草：通过在出苗前在整个区域施加标准的除草剂、即在条播后一天施加1.5l Butisan(metazachlor)，此外在标准样地中施加1l除草剂；并通过如下面详述的施加草甘膦的处理来实现：
在秋季、在植物生长的B4-B5阶段进行施加草甘膦的处理；施加的除草剂的制剂与实施例1中所用的制剂相同。
在8月上旬收获，并以吨谷物/ha(在9％的湿度下)来评价和表示产量。表VI显示出以标准样地产量的百分数表示的测得的产量。表VI：
产量标准 1001080g a.e./ha 104.5
实施例7
除在本实施例中播种春季油料种子油菜的植物以外(1996年4月中旬)，采用类似于前述实施例的测试方法进行田间测试。通过如实施例6中提及的结合技术使具有已知的遗传背景的上述植物对草甘膦除草剂具有耐受性。
通过在整个区域施加1.5l/ha Butisan、对标准样地进行手工除草而对其余样地施加草甘膦除草剂来保持样地不含杂草。在种植后大约1个月时、即植物生长的B3-B4阶段时施加同样的草甘膦的制剂。收获出现在8月中旬。
下面的表VII以标准样地的产量的百分数给出了产量数据(如实施例6进行测量和表示)。表VII：产量标准 100720g a.e./ha 1201080g a.e./ha 112
实施例8
在意大利进行另一田间试验以评价在施加草甘膦除草剂后能耐受草甘膦的玉米作物的产量的提高。根据适当的农艺学的习惯作法在3×9m的样地中(在每块样地中种有四排9m的植物)以大约62,000株植物/ha(约为4.7颗种子/m)并以每项测试重复试验四次的完全随机的区组设计来种植和培育已知的玉米作物，其中所说的玉米作物已根据EPSPS和草甘膦氧化还原酶表达的结合技术进行了遗传修饰从而对草甘膦具有耐受性，然后用手工使作物变稀疏以确保正常的作物的植物丛群并使所有样地中植物的数量相同。用出苗前的除草剂(Lasso Micromix)以6l/ha的比率(即2016g草不绿和864gterbuthylazine)处理包括标准样地和测试样地的整个区域。如果需要的话通过手工除草保持标准样地不含杂草，并且通过用与实施例1相同的草甘膦的制剂、在几种比率和植物生长阶段中处理测试样地以保持其不含杂草。在7m的中间长度上仅仅收获中央的两排。以在15％的湿度下表示的每公顷谷物的吨数来测量产量，并且在下表中将产量表示为标准的产量的百分数(STD)。
表XIIIa
％产量/在长出3-4片叶子的阶段用草甘膦处理
| 转化过程1 | 转化过程2 | |
| STD | 100 | 100 |
| 720g a.e./ha草甘膦 | 106 | 103 |
| 1800g a.e./ha | 107 | 107 |
表XIIIb
产量/在长出5-6片叶子的阶段用草甘膦处理
| 转化过程1 | 转化过程2 | |
| STD | 100 | 100 |
| 720g a.e./ha草甘膦 | 114 | 105 |
| 1080g a.e./ha | 109 | 108 |
| 1440g a.e./ha | 109 | 105 |
| 1800g a.e./ha | 111 | 102 |
实施例9
为了评价草甘膦除草剂的不同制剂对产量提高的影响，根据与实施例1相同的实验方案进行另一田间测试。转基因作物经受了分别为720g a.e./ha和1080g a.e./ha的三种草甘膦除草剂的处理。表IX ％产量-新鲜根重
3×720g a.e. 3×1080g a.e.Roundup 100 100颗粒制剂 101.4 100.2液体制剂 104.2 102
Roundup：
-360g a.e./l的草甘膦异丙基铵盐
-180g/1的乙氧基化的牛油胺表面活性剂
固体制剂：
-430g a.e./kg的草甘膦钠
-160g/kg的三甲基乙氧基聚氧化丙基(8)氯化铵
-330g/kg的硫酸铵
液体制剂：与实施例1所用的制剂相同。
本实施例显示出包含了所限定的对环境友好的表面活性剂的制剂效能提高的趋势。
实施例10
为了评价草甘膦除草剂的不同制剂的作用，在本实施例中采纳类似于实施例7(春季油料种子油菜)所述的步骤。在本试验中的测试样地为1.5×10m。
表X：在9％的湿度下以吨谷物/ha表示的产率
| ％产率 | ||||
| L/ha | 1 | 2 | 3 | 4 |
| Roundup | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 颗粒状 | 101 | 103 | 109 | -- |
| 液态 | 103 | 101 | 110 | 108 |
把经过Roundup处理后获得的产率视为100％。
本实施例还证实了实施例7中所用的制剂的优越性。
Claims (32)
1.草甘膦或其衍生物用于提高作物产量的用途，其特征在于所说的作物选自能耐受草甘膦的制糖甜菜、饲用甜菜、玉米、油料种子油菜和棉花，并且以通常致死剂量施加所说的草甘膦。
2.根据权利要求1的草甘膦或其衍生物的用途，其特征在于以介于0.2和6.0kg a.e./ha之间的通常致死剂量来施加所说的草甘膦或其衍生物。
3.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物的用途，其特征在于以一次处理或者连续处理来施加所说的草甘膦或其衍生物。
4.根据权利要求1或2的草甘膦衍生物的用途，其特征在于所说的草甘膦衍生物为草甘膦的盐。
5.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物的用途，其特征在于所说的草甘膦或其衍生物用于具有选自下列物质的佐剂的制剂中：
-胺，
-季铵盐，
-烷基聚糖苷或烷基糖苷，葡萄糖-酯和蔗糖-酯.
6.根据权利要求4的草甘膦或其衍生物的用途，其特征在于所说的草甘膦或其衍生物用于具有选自下列物质的佐剂的制剂中：
-胺，
-季铵盐，
-烷基聚糖苷或烷基糖苷，葡萄糖-酯和蔗糖-酯。
7.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物用于提高已对草甘膦除草剂具有耐受性的甜菜、油料种子油菜、棉花或玉米作物的产量的用途。
8.根据权利要求6的草甘膦或其衍生物用于提高已对草甘膦除草剂具有耐受性的甜菜、油料种子油菜、棉花或玉米作物的产量的用途。
9.根据权利要求7的草甘膦或其衍生物用于提高制糖甜菜或饲用甜菜作物的产量和/或质量的用途。
10.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码EPSPS多肽的基因。
11.根据权利要求6的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码EPSPS多肽的基因。
12.根据权利要求7的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码EPSPS多肽的基因。
13.根据权利要求8的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码EPSPS多肽的基因。
14.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码草甘膦氧化还原酶的基因。
15.根据权利要求6的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码草甘膦氧化还原酶的基因。
16.根据权利要求7的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码草甘膦氧化还原酶的基因。
17.根据权利要求8的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的作物含有编码草甘膦氧化还原酶的基因。
18.根据权利要求1或2的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的植物含有编码第II类EPSPS酶的基因。
19.根据权利要求6的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的植物含有编码第II类EPSPS酶的基因。
20.根据权利要求7的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的植物含有编码第II类EPSPS酶的基因。
21.根据权利要求8的草甘膦或其衍生物的用途，其中所说的植物含有编码第II类EPSPS酶的基因。
22.权利要求6，8，11，13，15，17，19，21，之一的用途，其中，胺为乙氧基化的烷基胺，氧化胺；季铵盐为乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐。
23.权利要求22的用途，其中
-乙氧基化的烷基胺为牛油胺、椰子烷基胺、以商品名Ethomeen出售的表面活性剂，
-氧化胺为以商品名Empigen OB出售的表面活性剂；乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐为以商品名Ethoquad，Emcol CC和Dodigen出售的表面活性剂。
24.权利要求6，22，23之一的用途，其中乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐为乙氧基化的聚丙氧基化的季铵表面活性剂。
25.权利要求5的用途，其中，胺为乙氧基化的烷基胺，氧化胺；季铵盐为乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐。
26.权利要求25的用途，其中
-乙氧基化的烷基胺为牛油胺、椰子烷基胺、以商品名Ethomeen出售的表面活性剂，氧化胺为以商品名Empigen OB出售的表面活性剂；
-乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐为以商品名Ethoquad，EmcolCC和Dodigen出售的表面活性剂。
27.权利要求5，25，26之一的用途，其中乙氧基化的和/或丙氧基化的季铵盐为优选乙氧基化的聚丙氧基化的季铵表面活性剂。
28.权利要求4的用途，其中，所说的草甘膦的盐为单-异丙基铵盐、铵盐或钠盐或其混合物。
29.权利要求6，8，11，13，15，17，19，21，之一的用途，其中，所说的草甘膦的盐为单-异丙基铵盐、铵盐或钠盐或其混合物。
30.权利要求23的用途，其中，所说的草甘膦的盐为单-异丙基铵盐、铵盐或钠盐或其混合物。
31.权利要求24的用途，其中，所说的草甘膦的盐为单-异丙基铵盐、铵盐或钠盐或其混合物。
32.权利要求25的用途，其中，所说的草甘膦的盐为单-异丙基铵盐、铵盐或钠盐或其混合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20030402 |
|
| CX01 | Expiry of patent term |