SK283574B6

SK283574B6 - Použitie N-(fosfonometyl)glycínu a jeho derivátov

Info

Publication number: SK283574B6
Application number: SK1298-98A
Authority: SK
Inventors: Ivo Brants; William Grahan
Original assignee: Monsanto Europe S.A.
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2003-09-11
Also published as: TR199801934T2; AP927A; BG102804A; EP0889692A1; EA001150B1; CZ292220B6; IL126307A; IL126307A0; BR9708457A; HUP9902665A3; CZ287298A3; DK0889692T3; EE03588B1; DE69713496D1; EA199800874A1; JP2000507565A; AU712463B2; CA2249332A1; BG63796B1; CN1220579A

Abstract

Použitie N-(fosfonometyl)glycínu a jeho derivátov, ako sú soli a estery, ako látok na zvýšenie výťažku plodín, ktoré sú tolerantné ku glyfosátu a vybrané z cukrovej repy, kŕmnej repy, kukurice, repky olejnatej a bavlny.ŕ

Description

Vynález sa týka nového použitia N-(fosfonometyl)glycínu a jeho derivátov, napríklad soli a estery, ako látok na zvýšenie výťažku plodín, ktoré sú tolerantné ku glyfosátu.

Doterajší stav techniky

Glyfosát je dobre známy ako účinný systemický, aktívny na list (post-emergentný) neselektívny herbicíd. Je známe, že glyfosát pôsobí na rôzne systémy enzýmov a tak bráni vzniku aminokyselín a iných endogénnych chemických látok v ošetrených rastlinách. V dôsledku relatívne nízkej rozpustnosti vo vode v kyslej forme sa glyfosát väčšinou predáva vo forme solí, napríklad mono-izopropylamónnej, amónnej, sodnej alebo inej soli.

Veľmi dobre známe produkty zahŕňajú aktívnu zložku a povrchovo aktívnu látku alebo zmes povrchovo aktívnych látok a možné iné aditíva, napríklad protipenové činidlá, farbivá a iné činidlá známe v odbore. Odkazuje sa tiež na knihu „Herbicíde Glyfosate“ vydanú E. Grossbardom a D. Atkinsonom, Butterworth & Co., 1985.

USA patent č. 3853530 opisuje použitie N-(fosfonometyljglycínu a jeho derivátov na zmenu prirodzeného rastu alebo vývoja rastlín, ako na zbavenie listov a oneskorenie vegetatívneho rastu. Pri istých rastlinách toto oneskorenie vraj vedie ku kratšiemu hlavnému stvolu a zväčšenému bočnému rozvetvovaniu. Táto zmena prirodzeného rastu alebo vývoja rastlín by viedla k menším, kríkovitejším rastlinám, ktoré majú zvýšenú odolnosť k suchu a k zamoreniu škodcami. V prípade trávnikov môže byť tiež veľmi žiaduci oneskorený vegetatívny rast, tak podporujúci rozvoj koreňov, aby sa získala hustá a odolnejšia mačina a predĺžené intervaly medzi kosením trávnikov, golfových ihrísk a podobných zatrávnených plôch. Pri mnohých druhoch rastlín, napríklad silážnych plodinách, zemiakoch, cukrovej trstine, repách, melónoch a ovocných stromoch, oneskorený vegetatívny rast spôsobený glyfosátom vraj vedie k zvýšeniu obsahu sacharidov v rastlinách pri zbere. Tieto aplikácie zrejme vyžadujú subletálne dávky, pretože inak by boli ošetrené rastliny zničené.

US 3 988 142 sa bližšie týka použitia N-(fosfonometyljglycínu a jeho derivátov na zvýšenie ukladania sacharidov v rastlinách, napríklad v cukrovej trstine. Opäť sú použité subletálne dávky a sú aplikované krátko pred zberom.

V oboch uvedených prípadoch sa verí, že neletálna dávka glyfosátového herbicídu, napríklad dávka omnoho nižšia než dávky normálne používané k boju proti populácii burín v oblasti plodín, spôsobí redukciu alebo oneskorenie vegetatívneho rastu, a aktívny materiál sleduje normálnu cestu, ktorú sleduje aj pri herbicídnom pôsobení v rastlinách. V prípade USA patentu č. 3 988 142 sa verí, že dovoľuje, aby sa viac dostupného sacharidu v rastline premenilo na škrob alebo sacharózu, než aby sa využil ako výživa rastliny na pokračujúci rast.

DE 3200486 sa týka zlepšenia produktivity plodín ich ošetrením subletálnymi dávkami fosflnotricínom (glufosinát), ktorý je tiež účinným neselektívnym herbicídom. I tu má byť inhibícia vegetatívneho rastu subletálnymi dávkami herbicídu príčinou zvýšenia sacharidov v rastlinách alebo v ich plodoch. DE 3200486 zmieňuje glyfosát v porovnávacom príklade (príklad II), ktorý je plánovaný, aby ukázal, že glufosinát má lepší účinok než glyfosát v rovnakej dávke.

DE 0401407 sa týka podobného predmetu. Opisuje použitie subletálnych dávok neselektívnych herbicídov, na príklad medzi inými glyfosátu a fosfmotricínu, v priebehu prechodu od štádia tvorby hmoty k štádiu zrelosti rastliny, aby sa zvýšilo ukladanie sacharidov v rastlinách produkujúcich cukor alebo škrob, iných než cukrová trstina, napríklad cukrová repa, zemiaky alebo kukurica.

WO 95/05082 opisuje spôsob zvýšenia výťažku plodín, ktoré sú rezistentné k inhibítorom glutamin syntetázy, ako je fosfínotricín, ošetrením týchto plodín dávkami tohto herbicídu, ako sa používa k boju s burinami v plodinách. Tento dokument ďalej konštatuje, že herbicídy s iným režimom účinku nemajú tento účinok alebo často ukazujú záporný účinok na výnos plodín.

Najnovší vývoj génovej technológie umožnil geneticky meniť rastliny, predovšetkým pestovaných plodín, aby sa stali tolerantné ku glyfosátu a jeho derivátom. Napríklad EP-0218571 sa týka klonovaného génu alebo génu obsahujúceho vektor expresie, ktorý kóduje EPSPS polypeptid, ktorý keď je exprimovaný v rastlinnej bunke, prenáša tolerantnosť ku glyfosátu do rastlín regenerovaných z takej bunky. EP-0293358 sa ďalej týka zvýšenia účinnosti rastlín tolerantných ku glyfosátu produkciou mutantných enzýmov EPSP syntetázy, ktoré majú nižšiu afinitu ku glyfosátu, zatiaľ čo zachovávajú katalytickú aktivitu. WO 92/00377 opisuje gény kódujúce enzým glyfosát oxidoreduktázu. Gény sú užitočné na produkciu transformovaných rastlín, ktoré degradujú glyfosátový herbicíd a sú tolerantné ku glyfosátovému herbicídu. WO 92/04449 opisuje gény kódujúce triedu II EPSPS enzýmov, ktoré sú užitočné na produkciu transformovaných rastlín, ktoré sú tolerantné ku glyfosátovému herbicídu. Také plodiny je možno udržiavať podstatne bez burín aplikáciou glyfosátového herbicídu po potrebe plodín. Chemical Abstracts, zväzok 124, číslo 8, 1996 referujú o článku vo Weeds (1995) od B. H. Wellsa s názvom “Rozvoj plodín tolerantných ku glyfosátu na trhu“. Autor potvrdzuje, že sa používali dva prístupy, aby sa dodala tolerancia ku glyfosátu na komerčných úrovniach pri rade plodín. Článok nazvaný “Roundup Ready® cukrová repa“ od I. Brantsa a i., publikovaný začiatkom 1996 v „Proceedings of the Intemational Symposium on Weed and Crop Resistance to Herbicides“ sympózia, ktoré sa konalo 3. až 6. apríla 1995, ukazuje, že sa dosiahla tolerancia k Roundup® na komerčných úrovniach pri geneticky modifikovaných rastlinách cukrovej repy.

Teraz sa neočakávane zistilo, že keď sa ošetrí zemina nesúca plodiny, ako sú cukrová repa, repka olejnatá alebo kukurica, pri ktorých bola uskutočnená tolerancia ku glyfosátovému herbicídu, dokonca i s normálne letálnymi dávkami glyfosátového herbicídu alebo dávkami normálne používanými na boj proti burinám, výťažok plodín sa zvýši. Tento neočakávaný výťažok nebolo možné očakávať z uvedeného stavu techniky, pretože pri netolerantných plodinách by plodina bola zničená, a pretože fosfínotricínové herbicídy majú spôsob účinku úplne odlišný od glyfosátového herbicídu.

Chemical Abstracts, zväzok 123, číslo 21, 1995 publikuje v abstrakte (abstrakt číslo 281158c) o článku X. Delannay a i., ktorý sa týka výsledku hodnotenia línie podzemnice tolerantnej ku glyfosátu po ošetrení glyfosátom. Autori článku uzatvárajú, že trendy v údajoch všeobecne naznačovali, že neexistoval žiadny skutočný rozdiel vo výťažku ošetrenia glyfosátom, variabilita sa chápe ako spôsobená nepriaznivým počasím alebo pôdnymi podmienkami.

V skôr zmienenom Weeds, B. H. Wells tiež poznamenáva, že sa nepozorovali žiadne významné zníženia výťažku po jednotlivých alebo postupných široko siatych aplikáciách glyfosátu pri rôznych štádiách plodín. O najlepších líniách bavlny tolerantných ku glyfosátu sa tvrdí, že neuká žali žiadne zníženie výťažku ani po aplikáciách glyfosátu. Tieto hodnotenia boli ovplyvnené, aby sa potvrdil výsledok genetickej modifikácie tejto plodiny pokiaľ sa týka ich tolerancie k danému herbicídu. V tomto článku nie sú žiadne údaje a nie je možné nájsť žiadny opis alebo zmienku o možnom zvýšení výťažku po aplikácii glyfosátu.

Hoci skôr zmienený článok 1. Brantsa a kol. ukazuje údaje o priemernej hmotnosti koreňov (%) pre tri rôzne línie cukrovej repy tolerantné ku glyfosátu, pre rôzne ošetrenia glyfosátom v porovnaní so štandardom, odborník nemôže z ukázaných údajov odvodiť zvýšenie výťažku repy. Údaje boli správne prezentované ako údaje o testovaní tolerancie. Ukázané údaje nenaznačujú žiadne zvýšenie výťažku pri cukrovej repe, pretože testovanie tolerancie nie je ovplyvnené podmienkami bez burín a teda umožňuje konkurenciu s burinami na štandardných stanoviskách. Ďalej ako odborník pozná, uvedené údaje sú veľmi skoré údaje získané na veľmi malých stanoviskách, bez opakovania, na jednom mieste, vzhľadom na dostupnosť semien. Tiež takéto skoré semená ešte obsahovali štiepiaci sa semenný materiál, čo viedlo k nerovnomerným stanoviskám plodín v porovnaní so štandardom. V dôsledku toho sa priemerná hmotnosť koreňov počíta na rastlinu (nie na jednotku plochy) a porovnáva so štandardnými rastlinami za odlišných podmienok. Jediným záverom, ktorý odborník môže z uvedeného článku odvodiť je to, že tri línie cukrovej repy mali úroveň tolerantnosti, ktorá má potenciál na komerčný rozvoj.

Podľa vynálezu testy ukázali zvýšenie výťažku (vyjadrené na jednotku plochy) plodín tolerantných ku glyfosátu, napríklad plodiny repa, repka olejnatá, kukurica alebo bavlna, ošetrených glyfosátovým herbicídom až o 50 % v porovnaní s rovnakou plodinou, ktorá nebola ošetrená glyfosátovým herbicídom. Zvýšenie výťažku sa nepokladá jednoducho za výsledok menšej konkurencie medzi plodinou a burinami ako dôsledok aplikácii glyfosátového herbicídu, pretože účinok sa pozoroval pri plodinách, ktoré sa nechali rásť za podmienok podstatne bez burín. Tiež sa pozoroval účinok regulácie bez rastu, ako sa chápal v predošlom stave techniky. Nepozorovalo sa žiadne dočasné oneskorenie rastu alebo iná dočasná zmena prirodzeného rastu alebo rozvoja plodiny.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa teda týka použitia glyfosátu alebo jeho derivátov na zvýšenie výťažku plodín, ktoré sú tolerantné ku glyfosátu.

Výhodne sa glyfosát aplikuje v obvykle letálnych dávkach na kontrolu populácie burín, aby sa súčasne zničili buriny. Glyfosátový herbicíd sa aplikuje v jednom ošetrení alebo vo viacerých postupných ošetreniach.

Použité dávky sú všeobecne v rozsahu od 0,2 a 6,0 kg kyslých ekvivalentov (a. e.)/ha, v závislosti od klimatických podmienok, zamorenia burinami, štádia rastu burinných rastlín a v závislosti od plodín a iných parametrov známych odborníkovi.

Glyfosátový herbicíd je možné aplikovať v jeho kyslej forme alebo ako jeho derivát, výhodne soľ, ako mono-izopropylamónna soľ, sodná soľ alebo amónna soľ, alebo ich zmesi. Iné soli glyfosátu, kde samotný katión nie je herbicídne aktívny alebo fytotoxický, sa tiež môžu použiť.

Účinok ošetrenia glyfosátovým herbicídom zvyšujúci výnos bol pozorovaný pri plodinách, ktoré sú tolerantné ku glyfosátu, vybraných z riep, ako sú cukrová repa alebo kŕmna repa, kukurica, repky olejnatej a bavlny, nezávisle od technike vyvolávajúcej toleranciu ku glyfosátovému herbicídu.

Účinok je obzvlášť zreteľný pri cukrovej repe a kŕmnej repe odolnej ku glyfosátu.

Glyfosátový herbicíd je možné napríklad aplikovať v kyslej forme alebo vo forme jeho derivátov, ako sú vo vode rozpustné alebo dispergovateľné granuly, ako vo vode rozpustný koncentrát zriedený v rozprašovanej vode, alebo vo forme iných typov formulácií, napríklad emulzie, zapuzdrenej aktívnej zložky a iné.

Glyfosátový herbicíd je možné aplikovať v jednej aplikačnej dávke alebo v postupných aplikáciách v rôznych štádiách rastu rastliny. Účinok ošetrenia glyfosátovým herbicídom pri plodinách tolerantných ku glyfosátu sa ukázal najvýznamnejší, keď sa ošetrenie použije v štádiu rastu daných rastlín.

Takéto formulácie adjuvans je možné nájsť v “McCutcheon's Emulsifiers and Detergents“ a je možné ich výhodne vybrať z

- amínov, ako sú etoxylované alkylamíny, najmä lojové amíny, kokosové amíny, povrchovo aktívne látky predávané pod obchodným názvom Ethomeen, aminoxidy, ako sú povrchovo aktívne látky predávané pod obchodným názvom Empigen OB,

- kvartémych amóniových solí, ako sú etoxylované a/alebo propoxylované kvartéme amóniové soli, podrobnejšie povrchovo aktívne látky predávané pod obchodným názvom Ethoquad, Emcol CC a Dodigen,

- alkylpolyglykozidov, alkylglykozidov, esterov glukózy a sacharózy.

Najvýhodnejšie sú kvartéme amóniové soli, ako sú definované v EP-0 441 764, prípadne v zmesi s namáčacím prostriedkom, najvýhodnejšie s alkoxylovaným esterom sorbitanu. Tento typ povrchovo aktívnej látky alebo zmes povrchovo aktívnych látok nemá významné fototoxické účinky na kultúrne rastliny a dáva sa im prednosť vzhľadom na ich charakteristiky, ktoré sú prijateľné pre životné prostredie.

Kvartéme amóniové soli zvláštneho záujmu sú trimetyletoxypolyoxypropyl amónium chloridy.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Rastliny cukrovej repy geneticky modifikované podľa technológie opísanej v EP 0218571, aby sa previedli na toleranciu ku glyfosátovému herbicídu, siali sa podľa spoľahlivej agronomickej praxe so vzdialenosťou medzi rastlinami 4,5 cm v riadku a ručne sa jednotili, aby sa zabezpečil normálny porast plodiny v randomizovanom blokovom pokuse. Veľkosť dielu 2,7 x 6 m; 6 riadkov na diel so vzdialenosťou medzi riadkami 0,45 m. Použili sa štyri opakovania pre každý test.

Skúšobné diely sa udržiavali v podstate bez burín: pokiaľ to bolo potrebné pre-emergentnou aplikáciou herbicídu, a špecifikované post-emergentným ošetrením glyfosátom ako je uvedené alebo štandardnými oficiálne prijatými ošetreniami repy (na účely porovnania).

Použili sa nasledujúce ošetrenia: Číslo 1 Štandardný herbicíd pre repu Číslo 2 Štandardný herbicíd pre repu v dvojitej dávke Číslo 3 3 x 720 g a.e./ha formulovaného glyfosátu Číslo 4 3 x 1080 g a.e./ha formulovaného glyfosátu Číslo 5 3 x 1440 g a.e./ha formulovaného glyfosátu Číslo 6 2 x 2160 g a.e./ha formulovaného glyfosátu.

Pokiaľ sa aplikujú tri postupné aplikácie glyfosátového herbicídu, prvé sa uskutočňuje v štádiu 2-4 listov plodiny, druhé sa uskutočňuje v štádiu 6 - 8 listov plodiny a tretie sa uskutočňuje v štádiu 10-12 listov plodiny, ale pred uzatváraním klenby listov.

Pokiaľ sa uskutočňujú dve postupné aplikácie, potom sa prvá uskutočňuje v štádiu 2 - 4 listov a druhá sa uskutočňuje v štádiu 10-12 listov plodín.

Formulácia glyfosátového herbicídu obsahovala 360 g glyfosátu na liter ako izopropylamónna soľ a 180 g na liter povrchovo aktívnej látky zloženej z trimetyl etoxypolyoxypropyl(8)amónium chloridu a etoxylovaného (20) esteru sorbitanu (80:20). Formulácia glyfosátu sa aplikovala v objeme vody 200 1/ha pri tlaku 2 bary.

Čerstvá hmotnosť koreňov sa merala pri zbere. Čerstvá hmotnosť koreňov po štandardnom ošetrení N.l sa považovala za 100 % výťažok a meraná čerstvá hmotnosť koreňov sa vzťahovala k výsledku štandardného ošetrenia N. 1.

Tabuľka I.A

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov na hektár) 1* 100

2* 96

3108

4108

5110

6113 * Štandardné ošetrenie zahŕňalo tri aplikácie

Herbasan	1,01/ha	1,01/ha	1,01/ha
Ethosan	0,11/ha	0,21/ha	0,21/ha
Goltix	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha
Renol S	0,3 1/ha	0,3 1/ha	0,3 1/ha

Tabuľka I.b

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov na hektár) 1* 100

2* 102

3110

4113

5117

6, * Štandardné ošetrenie zahŕňalo tri aplikácie

Goltix	1,7 kg/ha	0,75 kg/ha	1,0 kg/ha
Actiproton	1,7 kg/ha
Benatal P		2,01/ha
Venzar		0,41/ha
Goltix
Benatal Prog.			2,01/ha

Tabuľka I.c

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov na hektár) 1* 100

2* -

3129

4156

5136 ⁶ * Štandardné ošetrenie zahŕňalo pre-emergentnú aplikáciu a dve post-emergentné aplikácie oficiálne prijatých herbicídov pre cukrovú repu, ako nasleduje:

Goltix	3 kg/ha	0,5 kg/ha	0,5 kg/ha
Pyramín DF	2 kg/ha
Benatal P		1,0 kg/ha	1,0 1/ha
Stratos			1,0 1/ha

Príklad 2

Rovnaké testy sa opakovali s kŕmnou repou tolerantnou ku glyfosátu (geneticky transformovanou rovnakou technológiou).

Tabuľka II.A

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov na hektár) 1* 100

2* 101

3108

4107

5110 ⁶, * Štandardné ošetrenie tohto testu zahŕňalo tri aplikácie

Herbasan	1,0 1/ha	1,0 1/ha	1,0 1/ha
Ethosan	0,1 1/ha	0,2 1/ha	0,2 1/ha
Goltix	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha
Renol S	0,3 1/ha	0,3 1/ha	0,3 1/ha

Rovnaký test sa opakoval v rovnakej línii ako je uvedené, iba herbicíd sa aplikoval pre-emergentne na všetkých dieloch. Skladal sa z 1,0 1/ha Goltixu (obchodný názov) a 3,0 1/ha Benatalu E (obchodný názov).

Tabuľka Il.b

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov na hektár) 1* 100

2* 100

3108

4110

5113 ⁶.

* Štandard tohto testu zahŕňajednu aplikáciu:

Goltix	1,0 kg/ha
Benatal E	3 1/ha

Príklad 3

Na tento pokus sa použil v podstate rovnaký protokol ako v príkladoch 1 a 2.

Rastliny cukrovej repy sa siali začiatkom mája 1995 podľa spoľahlivej agronomickej praxe. Skúšobné diely sa udržiavali podstatne bez burín ručným pletím (neošetrené) alebo aplikáciou glyfosátového herbicídu, podľa vhodnosti. Glyfosát sa aplikoval ako zmes (formulácia) izopropylamónnej soli glyfosátu obsahujúca 360 g/1 kyslého ekvivalentu a 180 g/1 povrchovo aktívnej látky (trimetyl etoxypolyoxypropyl(8)amónium chlorid (80) s etoxylovaným (20) esterom sorbitanu (20).

TI = štádium 2-4 listov (približne 30 dní po siatí) T2 = štádium 8-10 listov (približne 50 dní po siati) T3 = štádium 14-18 listov (približne 65 dní po siatí)

Tabuľka III ukazuje meranú čerstvú hmotnosť koreňov (v g) na rastlinu 180 dní po siatí pre rad dávok formulácie glyfosátu, ako sú uvedené.

Tabuľka III

TI	T2	T3	180 dní po siatí g
neošetrené	neošetrené	neošetrené	1420
2	2	21	1717
3	0	3 1	1538
6	0	61	1885
4	0	41	1904

Tento experiment jasne ukazuje zvýšenie čerstvej hmotnosti koreňov pri zbere po rade aplikácii glyfosátu. Je tu tiež trend na zvýšenie výťažku ako funkcie aplikovaných dávok glyfosátu.

Zvýšený výťažok suchej hmotnosti rastlín sa tiež premieta do zodpovedajúceho zvýšenia suchej hmotnosti rastlín pri zbere.

Príklad 4

Účelom tohto pokusu bolo porovnanie transgénových cukrových riep, ktoré boli postriekané formuláciou glyfosátového herbicídu, z hľadiska kvality repy (obsah cukru, polarizovaného cukru, draslíka, sodíka, amino-dusíka v koreňoch, živiny vo vzorkách koreňov a vňate, suchá hmota, obsah surovej vlákniny a toxínov).

Cukrová repa sa hlavne používa v cukrovarníckom priemysle na produkciu bieleho cukru, rezkov a melasy. Technologická hodnota repy na tieto účely je všeobecne hodnotená analýzou obsahu cukru, draslíka, sodíka a amino-dusíka. Pokiaľ sa týka jedovatých látok v repe, monitorujú sa saponíny.

Príprava vzoriek

Po zbere sa repa udržiavala medzi 0 °C a 10 °Ca vňať sa zmrazila na menej než -20 °C.

Príprava repy na kašu sa uskutočňuje poloautomatickým spracovaním, kedy sa repa rozreže na repnej píle, čím vznikne kaša. Potom sa kaša homogenizuje, 1 vzorka sa použije po extrakcii na analýzu polarizácie, polarizovaného cukru, Na, K a amino-dusíka, a iná podvzorka sa suší a použije sa na analýzu živín. Tretia časť rovnakej vzorky sa zmrazila na analýzu jedovatej látky. Extrakcia repnej kaše sa uskutočňovala s demineralizovanou vodou, ku ktorej sa pridala tabletka síranu hlinitého na Čerenie, a preniesla sa do automatického vylúhovacieho a filtračného zariadenia Venema. Spracovania objemnej repnej vňate sa uskutočňovali jej vodorovným delením do rovnakých podvzoriek.

Analytické metódy:

Suchá hmotnosť - metóda sušiarne (EF 71/393/E0F, L279/7 strany 858-61 20/12-71):

Koreň:

Keď sa koreň spracuje na kašu, vzorka kaše sa dá do sušiarne pri 95 °C a suší sa 24 hodín (do konštantnej hmotnosti).

Vňať:

Vzorka sa dá do sušiarne pri 95 °C a suší sa až 72 hodín v závislosti od veľkosti vzorky (do konštantnej hmotnosti).

Tak pre koreň ako aj pre vňať sa strata hmotnosti kvantifíkuje a vypočíta sa ako percentá suchej hmotnosti.

Surová vláknina - metóda Weende (EF L 344/36-37 26/11-92, modifikovaná):

Vzorka sa spracuje postupne vo vriacich roztokoch kyseliny sírovej a hydroxidu draselného so špecifikovanými koncentráciami. Zvyšok sa oddelí filtráciou na Goschovom tégliku so sklenenou vlnou, premyje sa, suší, zváži a spáli sa v muflovej peci pri 550 °C v priebehu 3 hodín. Strata hmotnosti spaľovaním sa kvantifikuje gravimetrický a vypočíta sa ako percentá surovej vlákniny vo vzorke.

Toxíny: Saponíny - metóda HPLC (Hilmer S0rensen, KVL 1991, modifikovaná DC):

Metóda sa zakladá na kyslej hydrolýze saponínov repy. Uvoľnená oleanolová kyselina sa extrahuje s dichlórmetánom. Po odparení vody zo vzorky sa zvyšok rozpustí v metanole. Oleanolová kyselina sa odhadne HPLC v reverznej fáze s acetonitrilom/vodou a stanoví sa pri 210 nm na U V detektore.

Obsah cukru v extrakte repy - polarizácia (Pol) (ICUMSA, Sugar Analysis 1979, Proc. 1990).

Extrakt repy, vyčistený síranom hlinitým sa stanoví na polarimetri typu PROPOL, ktorý je založený na stanovenie pomeru optickej rotácie. Optická rotácia sa meria pri 546 nm v 70 mm dlhej trubici a konvertuje sa na °Z (Pol %) alebog/lOOgrepy.

Obsah amino-dusíka v extrakte repy - SMA11C analyzátor (ICUMSA, Sugar Analysis 1979, modifikované):

Extrakt repy, vyčistený síranom hlinitým sa stanoví na kolorimetri pri 570 nm po farebnej reakcii s ninhydrínom.

Draslík a sodík v extrakte repy - SMAI1C analyzátor (Technicon, Tech. Publ. THO-0160-10):

Extrakt repy, vyčistený síranom hlinitým sa stanoví na plamennom fotometri IV, kde sa intenzita svetelnej energie emitovanej draslíkom a sodíkom v plameni meria pri 586 a 768 nm. Vzorka sa zriedi síranom lítnym, kde sa lítium používa ako vnútorný štandard na vyrovnanie signálu z plamenného fotometra.

Invertný v extrakte repy - SMAIIC analyzátor (Technicon, Tech. Publ. THO-0160-10):

Extrakt repy, vyčistený síranom hlinitým sa stanoví na kolorimetri pri 560 nm po reakcii s reagentom síranom meďnatým - neokuproín hydrochloridom.

Rastliny cukrovej repy tolerantné ku glyfosátu geneticky premenené podľa technológie opísanej v EP 0 218 571 na toleranciu ku glyfosátovému herbicídu sa pestovali na 6 rôznych lokalitách (Taliansko, Španielsko, Belgicko, Dánsko, Francúzsko a Spojené kráľovstvo).

Typy pestovaných variet závisia od miestnych požiadaviek. Materiál sa líši v rade charakteristík, jednou dôležitou charakteristikou je obsah cukru stanovený polarizáciou (Pol). Cukrové repy sa môžu rozdeliť do podskupín: E-typ, N-typ a Z-typ. E-typ má nízku polarizáciu, Z-typ má vysokú polarizáciu a N-typ je medzi E a Z. Variácie pestované v severnej Európe je možné charakterizovať ako E-N, N alebo N-Z typy. Materiál použitý v tomto príklade spadá do N skupiny.

Cukrové repy sa siali podľa miestnych spoľahlivých agronomických postupov, ručne sa jednotili, aby sa zabezpečilo normálne stanovisko plodiny. Použilo sa aspoň jedno opakovanie na test.

Diely sa udržiavali podstatne bez burín aplikáciou:

• glyfosátového herbicídu na testovaných dieloch, • štandardným ošetrením herbicídom selektívnym pre repu (podľa polohy) na kontrolných dieloch, s výnimkou Dánska a Talianska, kde sa nepovažoval iný herbicíd než glyfosát za potrebný na udržiavanie podmienok bez burín.

• Zmes glyfosátového herbicídu je rovnaká ako v príklade L Zmes glyfosátového her-

bicídu sa aplikovala nasledovne:
• pre-emergentne	2,5 1/ha
• štádium 2-4 pravých listov repy	21/ha
• štádium 6-8 pravých listov repy	2 1/ha
• štádium 12-14 pravých listov (uzatváranie klenby)	2 1/ha
• Dávky selektívneho herbicídu sa aplikovali nasledovne: • Španielsko: • Goltix WG 3,55 kg/ha (metamitron) pre-emergentne • Belgicko • 2 1/ha Gramoxon (paraquat 200)	pred siatím

• 2 1/ha Pyramin FL (chloridazon 430) • 0,5 1/ha Benatal (Phenmedipham 150) • 0,5 1/ha Goltix (metamitron 70 % WP) • 0,5 1/ha Tramat (etofumesát 200) • 0,75 1/ha Goltix • 0,75 1/ha Vegelux (minerálny olej 40) • 0,75 1/ha Tramat • 0,75 1/ha Goltix • 0,75 1/ha Vegelux • 0,17 1/ha Fusilade • 0,75 1/ha Benatal • 0,75 1/ha Tramat • 0,75 1/ha Benatal týždeň po siatí týždne po siatí týždne po siatí týždne po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí týždňov po siatí • 0,75 1/ha Goltix • 0,75 1/ha Vegelux

Francúzsko:

• 0,75 1/ha Goltix (metamitron) • 0,75 1/ha Goltix WP • 0,75 1/ha Benatal (phenmedipham 150) • 0,75 1/ha Tramat (etofumesát 200) Spojené kráľovstvo:

týždňov po siatí týždňov po siatí deň po siatí týždne po siatí týždne po siatí týždne po siatí • 1,0 1/ha Laser (cycloxidym) 5 týždňov po siatí

Analytické výsledky sa zhrnuli a priemery sú reprodukované v tabuľke, všetky štáty majú rovnaké váhy pri počítaní priemerov.

Časť rastliny	\| Analyzovaná jednotka \|	Ošetrené/Neošetrené \|	Cukrová repa
kaša	suchá hmota	ošetrené	21,309
	g/100 g koreňa	neošetrené	20,444
koreň	inverzný cukor	ošetrené	1,011
	mmol/100 g koreňa	neošetrené	1,755
	draslík	ošetrené	5,162
	mmol/100 g koreňa	neošetrené	5,286
	NH2N	ošetrené	2,470
	mmol/100 g koreňa	neošetrené	2,878
	sodík	ošetrené	1,118
	mmol/100 g koreňa	neošetrené	1,769
	Pol	ošetrené	15,610
	mmol/100 g koreňa	neošetrené	14,478
vňať	suchá hmota	ošetrené	14,724
	g/100 g vňate	neošetrené	13,996

Ošetrené: postriekané glyfosátovým herbicídom Neošetrené: nepostriekané glyfosátovým herbicídom

Dáta ukazujú, že cukrová repa ošetrená glyfosátovým herbicídom má významne vyšší obsah cukru so zníženým sodíkom, draslíkom, amino-dusíkom a polarizovaného cukru v koreňoch. Suchá hmota koreňa a vňate je tiež zvýšená. Podrobnejšie údaje naznačujú, že listy cukrovej repy ošetrené glyfosátom majú vyšší obsah vláknin. Pri korelácii výsledkov tohto príkladu s výsledkami predchádzajúcich príkladov sa ukazuje, že zvýšenie výťažku vyhodnotené skôr v hmotnosti na hektár sa tiež prejavuje ako zvýšenie suchej hmoty, vlákniny a obsahu cukru v zozbieranom materiáli.

Príklad 5

Rastliny cukrovej repy a kŕmnej repy geneticky modifikované podľa technológie opísanej v EP 0 218 571, aby sa stali tolerantné ku glyfosátovému herbicídu, sa siali na rôznych stanoviskách podľa spoľahlivej agronomickej praxe so vzdialenosťou medzi rastlinami 4,5 cm riadka a ručne sa jednotili, aby sa zabezpečilo normálne stanovisko plodiny v randomizovanom blokovom pokuse. Veľkosť dielu

2,7 x 6 m 6 riadkov na diel so vzdialenosťou medzi riadkami 0,45 m. Použili sa štyri opakovania na test.

Skúšobné diely sa udržiavali podstatne bez burín: štandardnou aplikáciou herbicídu na celú plochu a potom ručným pletím, a pokiaľ to bolo potrebné ošetrením glyfosátom, použitým ako je špecifikované.

Použili sa nasledujúce ošetrenia:

Iba ručné pletie x 720 g a.e./ha pripraveného glyfosátu x 1080 g a.e./ha pripraveného glyfosátu x 1440 g a.e./ha pripraveného glyfosátu x 2160 g a.e./ha pripraveného glyfosátu

Pokiaľ sa aplikujú tri postupné aplikácie glyfosátového herbicídu, prvá sa uskutočňuje v štádiu 2-4 pravých listov plodiny, druhá sa uskutočňuje v štádiu 6-8 pravých listov plodiny a tretia sa uskutočňuje v štádiu 10 - 12 pravých listov plodiny, ale pred uzatváraním klenby.

Pokiaľ sa uskutočňujú dve postupné aplikácie, potom sa prvá uskutočňuje v štádiu 2-4 listov a druhá sa uskutočňuje v štádiu 10 - 12 listov plodín.

Zmes glyfosátového herbicídu obsahovala 360 g glyfosátu na liter ako izopropylamónna soľ a 180 g na liter povrchovo aktívnej látky zloženej z trimetyl etoxypolyoxypropyl(8)amónium chloridu a etoxylovaného (20) esteru sorbitanu (80:20). Formulácia glyfosátu sa aplikovala v objeme vody 2001/ha pri tlaku 2 bary.

Čerstvá hmotnosť koreňov sa merala pri zbere. Čerstvá hmotnosť koreňov len ručne pletých dielov sa považovala za 100 % výťažok a meraná čerstvá hmotnosť koreňov po ošetrení glyfosátom sa vzťahovala k výsledku ručne pletých dielov.

Tabuľka V % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov)
	Ošetrenie	Cukrová repa	Kŕmna repa
ručne pleté	100%	100%
3 x 720 g a. e.	101	105
3 x 1080 g a. e.	98	106
3 x 1140 g a. e.	115	108
3 x 2160 g a. e.	107	102

Príklad 6

Na tento poľný pokus sa geneticky modifikované rastliny zimnej repky olejnatej s existujúcim genetickým základom na vykazovanie tolerantnosti ku glyfosátovému herbicídu (podľa kombinovanej techniky expresie EPSPS a expresie glyfosát oxidoreduktázy sa siali v polovici septembra 1995 podľa spoľahlivých agronomických postupov pri 4 kg semien/ha, zodpovedajúcich približne 100 rastlinám na m² (normálne stanovisko plodiny), podľa randomi zovaného blokového pokusu, veľkosť diela 3 x 7 m, vzdialenosť medzi riadkami 0,14 m, štyri opakovania na test.

Diely sa udržiavali podstatne bez burín: štandardnou pre-emergentnou aplikáciou herbicídu na celú plochu, napríklad 1,5 1 Butizanu (metazachlór) jeden deň po siatí a 1 1 navyše pri štandardných dieloch a ošetrením glyfosátom použitým ako je špecifikované.

Ošetrenia glyfosátom sa použili na jeseň v štádiu rastu rastlín B4 - B5; použila sa rovnaká formulácia ako sa použila v príklade 1.

K zberu došlo začiatkom augusta a výnos sa meral a vyjadril v tonách zrna na hektár (pri 9 % vlhkosti). Tabuľka VT ukazuje merané výťažky v % výťažku štandardného dielu.

Tabuľka VI: Výťažok

Štandard	100
1080 g a.e./ha	104,5

Príklad Ί

Tento poľný pokus sa uskutočnil podobne ako test v predchádzajúcom príklade, len sa v tomto príklade siala jarná repka olejnatá (v polovici apríla 1996). Také rastliny so známym genetickým základom sa previedli na tolerantné ku glyfosátovému herbicídu (podľa kombinovanej techniky zmienenej v príklade 6).

Diely sa udržiavali podstatne bez burín aplikáciou 1,5 1 Butizanu na celú plochu a ručným pletím pre štandardné diely a glyfosátový herbicíd na ostatných dieloch. Rovnaká formulácia glyfosátového herbicídu sa aplikovala asi 1 mesiac po siatí, to znamená v štádiu rastu B3 - B4. Zber prebehol v polovici augusta.

Tabuľka VII ukazuje údaje o výťažku (merané a vyjadrené ako v príklade 6) v hmotnostných % na štandardných dieloch.

Tabuľka VII: Výťažok

Štandard	100
720 g a.e./ha	120
1080 g a.e./ha	112

Príklad 8

Aby sa vyhodnotilo zvýšenie výťažku kukurice tolerantnej ku glyfosátu po aplikácii(ách) glyfosátového herbicídu uskutočňovali sa ďalšie poľné pokusy v Taliansku. Známe rastliny kukurice geneticky modifikovanej na tolerantnosť ku glyfosátu podľa kombinovanej techniky expresie EPSPS a glyfosát oxidoreduktázy sa siali a pestovali podľa spoľahlivých agronomických postupov približne 62000 rastlín/ha (približne 4,7 semena/m) v dieloch 3 x 9 m so štyrmi 9 m radmi rastlín v každom, v celkom randomizovanom blokovom pokuse so štyrmi opakovaniami, a ručne sa jednotili, aby sa zabezpečilo normálne stanovisko plodiny a rovnaký počet rastlín vo všetkých dieloch. Celá plocha zahrnujúca štandardné diely a testované diely sa ošetrila pre-emergentným herbicídom (Lasso Micromix) v dávke 6 1/ha (napríklad 2016 g alachlóru a 864 g terbutylazínu). Štandardné diely sa udržiavali bez burín ručným pletím, pokiaľ to bolo treba, a testované diely rovnakou zmesou glyfosátového herbicídu ako v príklade 1 vo viacerých dávkach a štádiách rastu daných rastlín. Iba obidva stredné rady sa zberali na strednej dĺžke 7 m. Výnos sa meral v tonách zrna na hektár vyjadrený pri 15 % vlhkosti a je ukázaný v tabuľkách ako % výťažku štandardu (STD).

Tabuľka XHIa % výťažku (ošetrenie glyfosátom v štádiu 3 - 4 listov)

	Transformácia Prípad 1	Transformácia Prípad 2
STD	100	100
720 g a.e./ha glyfosátu	106	103
1800 g a.e./ha	107	107

Tabuľka XHIb % výťažku (ošetrenie glyfosátom v štádiu 5 - 6 listov)

	Transformácia Prípad 1	Transformácia Prípad 2
STD	100	100
720 g a.e./ha glyfosátu	114	105
1080 g a.e./ha	109	108
1140 g a.e./ha	109	105
1800 g a.e./ha	111	102

Príklad 9

Aby sa vyhodnotil účinok rôznych formulácií glyfosátového herbicídu na zvýšenie výťažku, uskutočnil sa ďalší poľný pokus podľa rovnakého postupu ako v príklade 1. Transgénové rastliny trikrát ošetrili glyfosátovým herbicídom pri 720 g a.e./ha a 1080 g a.e./ha.

Tabuľka IX

Ošetrenie % výťažku (čerstvá hmotnosť koreňov) x 1080 g a. e.

100 x 720 g a. e.

100

Roundup®

Granulovaná zmes

Kvapalná zmes Roundup®

101,4 100,2

104,2 102

- izopropylamónna soľ glyfosátu 430 g a.e./kg

- povrchovo aktívna látka etoxylovaný lojový amín 180 g/1

Tuhá zmes:

- glyfosát sodný 430 g a.e./kg

- trimetyl etoxypolyoxypropyl(8)amónium chlorid 160 g/kg

- síran amónny 330 g/ha

Kvapalná formulácia: rovnaká ako v príklade 1.

Tento príklad ukazuje tendenciu k zlepšeniu výkonu formulácie obsahujúcej povrchovo aktívnu látku nepoškodzujúcu životné prostredie, ako bolo definované.

Príklad 10

Podobný postup ako bol opísaný v príklade 7 (jarnej repky olejnatej) sa sledoval v tomto príklade, aby sa vyhodnotil účinok odlišných formulácií glyfosátového herbicídu. Skúšobné diely v tomto teste boli 1,5 x 10 m.

Tabuľka X

Výťažok v tonách/ha zrna pri 9 % vlhkosti

	% výťažku
1/ha	1	2	3	4
Roundup®	100	100	100	100
Granulovaná zmes	101	103	109	-
Kvapalná zmes	103	101	110	108

Výťažok, ktorý sa získal po ošetrení Roundupom® sa považoval za 100 %

Tento príklad ďalej potvrdzuje prevahu zmesi použitej v príklade 7.

Claims

1. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu na zvýšenie výťažku plodín, ktoré sú tolerantné ku glyfosátu, vybratých z cukrovej repy, kŕmnej repy, kukurice, repky olejnatej a bavlny.

2. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že sa aplikuje v obvykle letálnej dávke 0,2 a 6,0 kg a.e./ha.

3. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že sa glyfosát alebo jeho derivát aplikuje v jednom ošetrení alebo v postupných ošetreniach.

4. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž3, vyznačujúce sa tým, že je to glyfosátová soľ, mono-izopropylamónna soľ, amónna soľ alebo sodná soľ, alebo ich zmesi.

5. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž4, vyznačujúce sa tým, že sa použije vo formulácii s adjuvans vybratej z

- amínov, ako sú etoxylované alkylamíny, najmä lojové amíny, kokosové amíny, povrchovo aktívne látky, amínoxidy ako povrchovo aktívne látky, - kvartémych amóniových solí, ako sú etoxylované a/alebo propoxylované kvartéme amóniové soli, najmä povrchovo aktívne látky, - alkylpolyglykozid alebo alkylglykozid, estery glukózy a sacharózy, výhodne s etoxylovanou propoxylovanou kvartérnou amóniovou povrchovo aktívnou látkou.

6. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na zvýšenie výťažku repy, repky olejnatej, bavlny alebo kukurice, ktoré sa stali tolerantné ku glyfosátu.

7. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa nároku 6, na zvýšenie výťažku a/alebo kvality plodín cukrovej repy alebo kŕmnej repy.

8. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž6, vyznačujúce sa tým, že plodina obsahuje gén, ktorý kóduje EPSPS polypeptid.

9. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž6, vyznačujúce sa tým, že plodina obsahuje gén, ktorý kóduje enzým glyfosát oxidoreduktázu.

10. Použitie glyfosátu alebo jeho derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov Íaž6, vyznačujúce sa tým, že plodina obsahuje gén, ktorý kóduje enzýmy triedy II EPSPS.