HU225460B1

HU225460B1 - New use of n-(phosphonomethyl)glycine and derivatives thereof

Info

Publication number: HU225460B1
Application number: HU9902665A
Authority: HU
Inventors: Ivo Brants; William Graham
Original assignee: Monsanto Europe Sa
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2006-12-28
Also published as: HUP9902665A2; BG63796B1; PT889692E; DE69713496T2; NZ331764A; JP2000507565A; AU2504997A; DE69713496D1; EE9800319A; HUP9902665A3; EA001150B1; SK129898A3; OA10888A; CZ287298A3; AU712463B2; BG102804A; AP927A; BR9708457A; SK283574B6; CA2249332A1

Description

A találmány tárgya glifozát, illetve az N-(foszfono-metil)-glicin és származékainak, így sóinak és észtereinek új felhasználása a glifozáttal szemben toleráns gabonanövények hozamának növelésére.

A glifozát jól ismert mint hatékony szisztémás levélzetaktív (postemergent) nem szelektív herbicid. A glifozátról ismeretes, hogy az különböző enzimrendszerekben működik, így az aminosavak képződésével és más endogén kemikáliákkal kezelt növényben interferál. A savforma viszonylag alacsony vízoldhatóságának betudhatóan a glifozát leginkább só formában került kereskedelmi forgalomba, ilyen sók a monoizopropil-ammónium-sók, az ammóniumsó, nátriumsó és más sók.

A jól ismert készítmények a hatóanyagot és valamely felületaktív szert vagy valamely felületaktívszer-keveréket és adott esetben más adalék anyagokat, így habzásgátló szereket, fagyásgátló szereket, színezékeket és más szereket, melyeket a szakirodalom ismertet, tartalmaznak. Referenciaként a „The Herbicide Glyphosate” szerkesztők E. Grossbard és D. Atkinson, Butterworth & Co. 1985 szolgál.

A 3 853 530 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás az N-foszfono-metil-glicint és származékait írja le a növények növekedések és fejlődésének befolyásolására a levélzet és a vegetatív növekedés retardálására. Bizonyos növényekben ez a retardáció rövidebb főszár és megnövekedett laterális elágazáshoz vezet. A természetes növekedés vagy fejlődés módosulása kisebb mezei növényeket produkál, melyek gyakran megnövekedett rezisztenciát mutatnak az aszállyal és a kártevők fertőzésével szemben. Pázsitfű esetében a vegetatív növekedés retardálása előtti esetben szintén figyelembe veendő, hogy a gyökér fejlődésének növekedése sűrű, erősebb gyepet eredményez és növeli a nyírott gyep kaszálások közötti intervallumot golfpályák és hasonló füves területek esetében. A növények számos típusa, így a silónövények, a burgonya, a cukorrépa, a répa, a szőlő, a dinnye és a gyümölcsfák, vegetatív növekedésének retardálása, melyet a glifozát vált ki az aratáskor a növényekben jelen lévő szénhidráttartalom növekedésének az eredménye. Nyilvánvaló, hogy ezek az alkalmazások szubletális dózisokat igényelnek, mert másképpen a kezelendő növényeket elpusztítjuk.

A 3 988 142 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás részletesen elemzi az N-(foszfono-metil)-glicin és származékainak felhasználását a növények szénhidráttartalmának növelésére, így említést tesz a cukornád kezelésére. A felhasznált mennyiségek a letálisnál kisebb szintek, és azokat közvetlenül az aratás előtt alkalmazzák.

Mindkét fent említett esetben úgy gondoljuk, hogy a glifozát herbicid nem letális dózisa, azaz az általánosan használt dózisnál jelentősen kisebb érték, melyet a gyompopuláció irtására használunk gabonamezőkön, a vegetatív növekedés retardálását vagy redukcióját okozva, és a normálkezelést követő aktívanyag-adagolás akkor történik, mikor a herbicid hatása a növényeken bekövetkezik. A 3 988 142 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a vegetatív növekedés retardálására feltételezi, hogy a növény hozzáférhető szénhidrátjainak többsége keményítővé vagy szacharózzá alakul, és nem a növénytest folyamatos növelésére fordítódik.

A 3 200 486 számú német szabadalmi leírás a gabonanövények növeléséről számol be oly módon, hogy azokat szubletális dózisú foszfinotricinnel (glufozinát) kezelik, mely szintén hatékony nem szelektív herbicid. Itt szintén a vegetatív növekedés gátlása történik a herbicid letálisnál kisebb dózisával, mely a növények vagy gyümölcsök szénhidráttartalmának növekedését okozza. A 3 200 486 számú német szabadalmi leírás a 2. összehasonlító példában a glifozátot említi és azt mutatja, hogy a glifozinátnak jobb hatása van, mint a glifozát ugyanolyan mennyiségének.

A 0 401 407 számú európai szabadalmi leírás hasonló adatokról számol be. Megemlíti, hogy a nem szelektív herbicidek letálisnál kisebb dózisát használják fel, így többek között glifozátot és foszfinotricint a tömegképző állapotból az érett növényi állapotba való átmenet során a szénhidrát mennyiségének növelése érdekében cukrot vagy keményítőt termelő növényekben, és ez a jelenség a cukornádtól eltérő növényeknél, így a cukorrépából, a burgonyából vagy gabonanövényekből azonosítható.

A WO 95/05082 szabadalmi leírás módszert ismertet a gabonanövények hozamának növelésére, mely gabonanövények a glutaminszintetáz-inhibitorokkal rezisztensek, így a foszfinotricinekkel szemben oly módon, hogy a terméknövényeket olyan mennyiségű herbiciddel kezelik, amely a gabonamezőn a gyomokat irtja. Ez a leírás továbbá megállapítja, hogy a különböző módon és műveletekkel végzett herbicidkezelés nem mutat ilyen hatást, és gyakran negatív hatást fejt ki a gabonamezőkön.

A géntechnológia napokban történő fejlődése lehetővé tette a növények genetikai transzformálását, közelebbről a gabonanövények transzformálását abból a célból, hogy a glifozáttal vagy annak származékaival szemben toleránssá tegyék azokat. Például a 0 218 571 számú európai szabadalmi leírás olyan klónozásra vagy kifejezővektorra vonatkozik, amely olyan gént tartalmaz, mely az EPSPS polipeptidet kódolja, mely a növényi sejtben kifejeződve glifozáttoleranciát biztosít a növénynek az ilyen sejtekből származtatva. A 0 293 358 számú európai szabadalmi leírás további glifozáttoleráns növények aktivitásának növelését írja le, mely növekedést mutáns EPSP szintázenzim termelésével váltanak ki, mely enzim alacsonyabb glifozátaffinitást mutat, míg a katalitikus aktivitása marad.

A WO 92/00377 számú szabadalmi leírás olyan génről számol be, mely a glifozát oxidoreduktáz-enzimet kódolja. Ezeket a géneket a transzformált növények termelésére használják, melyek degradálják a glifozát herbicidet, és toleránssá teszik a glifozát herbicideket. A WO 92/04449 szabadalmi leírás olyan géneket ismertet, mely az EPSPS II osztályú enzimeket kódolják, melyek a transzformált növények termelésére használhatók, mely növények toleránsak a glifozát her2

HU 225 460 Β1 bicidekkel. Ilyen terménynövények lényegében a gyommentes terménynövények, mely eredményt a glifozát herbicidek alkalmazásával értük el a termény emergenciája után. A Chemical Abstracts, vol. 124, N. 8, 1996 referenciahely a „Weeds” (1995) Β. H. Wells, „Development of Glyphosate Tolerant Crops intő the Markét publikációról számol be. A szerzők azt bizonyítják, hogy két megközelítés használható a glifozáttolerancia-szint bemutatására a különböző növényekben.

A Roundup Ready™ Sugár Beet I. Brants et al., melyet 1996-ban publikáltak a „Proceedings of The International Symposium On Weed and Crop Resistance to Herbicides” irodalmi helyen, mely szimpóziumot 1995. április 3-6. között tartottak meg, arról számol be, hogy a kereskedelmi Roundup® toleranciaszintje a genetikusán modifikált cukorrépanövények esetén kerül beállításra.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ha a gabonaföldet, így a répaterményt, az olajos magú repcét vagy a gabonát magát kezeljük, a glifozát herbicidek toleránssá válnak még normális glifozát herbicid letális szinten vagy általában használt gyomirtó adagokban is a gabonahozam megnövekszik. Ez a nem várt hatás nem vezethető le a szakirodalomban megismertekből, mivel a nem toleráns termékenyek elpusztulnának, mivel a foszfinotricin herbicid hatásmódja teljes mértékben különbözik a glifozát herbicidtől.

A Chemical Abstracts, vol. 123, no. 21, 1995 (Abstract N. 281158c) irodalmi hely az X. Delannay és mások által ismertetett publikációban a glifozáttoleráns szójababvonal értékeléséről számol be glifozáttal történő kezelés után. A cikk szerzői azt a következtetést vonják le, hogy az adatok trendje nem mutat valós különbséget a standard herbicid ellenőrzéssel összehasonlítva és azt a következtetést, hogy a teljes glifozátkezeléssel nyert hozam biztonsága változó, mely változás a kedvezőtlen időjárásnak és/vagy a talajviszonyoknak tudható be.

A Weeds 1995 előbb említett Β. H. Wells irodalmi hely arról számol be, hogy nincs szignifikáns hozamcsökkenés az egyszeri vagy egymás utáni szórva vetett glifozátalkalmazás között a különböző növényi állapotokban. A glifozát vezetővonalával toleráns gyapot kezelése azt az eredményt hozta, hogy nem volt tapasztalható hozamcsökkenés a glifozátkezelés után. Ezek az értékelések azt mutatják, hogy a genetikai modifikációk a különböző terménynövényekben toleranciát biztosítanak a releváns herbicidnek. Nincs olyan adat, amely azt bizonyítaná az említett cikkben, hogy lehetséges a termény növekedése glifozátkezelés után.

Bár a fent említett Brants és munkatársai által közölt cikk nem mutat átlagos gyökértömeg%-adatokat három különböző glifozáttoleranciával rendelkező cukorrépa esetében, jellemezve azokat három különböző transzformációs művelettel, a különböző glifozátkezeléseket összehasonlítva a standardokkal, a szakember számára nem nyilvánvaló, hogy a répahozam-növekedés ezekből az adatokból kikövetkeztethető. Az adatokat mint toleranciateszt-adatokat adták meg. Az adatok azt mutatják, hogy nincs indikatív cukorrépahozam-növekedés, mivel a tolerancia értékeit nem terjesztették ki a gyommentes körülményekre, így a gyom növekedése a standardparcellákban lehetővé válik. Továbbá felismerhető a szakember számára, hogy a korai kísérleti adatok, melyek kis parcellákból származnak, nem replikálódnak adott helyen a mag jellemzőinek következtében. Továbbá az ilyen korai magvak mindig tartalmaznak szegregáló maganyagot, mely szabálytalan gabonasávokat eredményez összehasonlítva a standardmintával; fentiek eredményeképpen az átlagos gyökértömeget egy adott növényre számoljuk (nem egységnyi területre) és a standardkörülmények között növekvő különböző körülmények beállításával hasonlított viszonyokkal vetjük össze. Az egyetlen konklúzió a szakember számára abból vonható le, hogy a fenti cikkek három cukorrépavonalat mutattak be, és azt találták, hogy a tolerancia szintje a kereskedelmi kifejlesztésre potenciálisan alkalmas értéket mutat.

A jelen találmánynak megfelelően elvégzett tesztek nagyobb terméshozamot mutatnak (egységnyi területre kifejezett) glifozáttoleráns növények, így a répa, az olajmagvú repce, a gabona vagy a gyapot, glifozát herbiciddel történő kezelése után maximum 50%-kal, ugyanazon a területen olyan növénnyel összehasonlítva, mely nem kapott glifozát herbicid kezelést. A hozam növekedése nem tételezi fel, hogy csupán a gyom és a termény közötti verseny megszűntének tudható be a glifozát herbicid alkalmazás következtében, mivel ezt a hatást olyan termények esetében figyelték meg, melyet lényegében gyommentes körülmények között növesztettek. Ugyancsak nincs növekedésregulációs hatás, mint az a szakember számára nyilvánvaló, az alábbi megfigyelések szerint. A növény retardálásának ideiglenes megszűntét vagy bármely más ideiglenes módosulást a természetes növekedésben vagy a növényi tenyészet kiterjedésében.

A jelen találmány tárgya tehát a glifozát vagy származékainak felhasználása a glifozáttoleráns növények hozamának növelésére.

Előnyösen a glifozátot rendszerint letális dózisban alkalmazzuk a gyompopuláció szabályozására a szimultán gyomirtás céljából. A glifozát herbicidet adott esetben egyszer vagy egymás után többszöri lépésben alkalmazzuk a kezelés során. Az alkalmazott általánosan elfogadott mennyiség 0,2-6,0 kg sav ekvivalens/hektár a klimatikus viszonyoktól, a szezontól, a gyomfertőzéstől, a gyomnövény állapotától és a terménytől, továbbá a szakember számára ismert más paramétertől függően.

A glifozát herbicidet adott esetben annak sav formájában vagy más származékok formájában, előnyösen só formában, így monoizopropil-ammónium-sója, vagy nátriumsója vagy ammóniumsója vagy ezek keverékei formájában alkalmazzuk. A más glifozátsók, ahol a kation önmagában nem mutat herbicid- vagy fitotoxikus aktivitást, adott esetben szintén használhatók.

A glifozát herbicid kezelés során tapasztalt hozamnövekedés hatása a glifozáttoleráns növényeken, így a cukorrépán, a takarmányrépán, a gabonán, az olaj3

HU 225 460 Β1 magvas repcén és a gyapjún, egymástól függetlenül használt technikákban okoz glifozáttoleranciát. A hatás különösen jelentős a glifozáttoleráns cukorrépán és takarmányrépán.

A glifozát herbicidet például annak sav formájában vagy valamely származék formájában, így vízoldható vagy diszpergált granulátum formájában használjuk, mint például vízoldható koncentrátum, amelyet spray alakban vízzel hígítunk vagy más készítménytípusok alakjában, így emulziók, kapszulázott hatóanyag és más készítmények formájában.

A glifozát herbicidet adott esetben egyszerre alkalmazzuk vagy egymás utáni időközönként alkalmazzuk különböző növénynövekedési stádiumokban. A glifozát herbicid hatása a glifozáttoleráns növényekre a legszignifikánsabb akkor, ha a kezelést a megfelelő növény növekedési szakaszában alkalmazzuk.

Ilyen készítményadjuvánsokat adott esetben a „McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents” irodalmi helyen találunk, és adott esetben ezek előnyösen az alábbiak:

- aminok, így etoxilezett alkil-aminok, különösen a faggyúaminok, a kókuszaminok, az Ethomeen (gyártó: Akzo Nobel) kereskedelmi néven forgalmazott felületaktív szerek, amin-oxidok, így az Empigen OB (gyártó: Huntsman) kereskedelmi néven fogalmazott felületaktív szer;

- kvaterner ammóniumsók, így az etoxilezett és/vagy propoxilezett kvaterner ammóniumsók, különösen előnyösen az Ethoquad (gyártó: Akzo Nobel), Emcol CC (gyártó: Witco Corp.) és Dodigen (Hoescht Ltd.) kereskedelmi néven forgalmazott felületaktív szerek;

- alkil-poliglikozidok, alkil-glikozidok, glukóz- és szacharóz-észterek.

Különösen előnyösek a kvaterner ammóniumsók, így a 0 441 764 számú európai szabadalmi leírásban definiált keverék, amelyet nedvesítőszerrel, különösen előnyösen alkoxilezett szorbit-észterrel keverünk. A felületaktív anyagok vagy felületaktív anyagok ilyen keverékei nem mutatnak szignifikáns fitotoxikus hatást a terménynövényen és előnyösek azok környező karakterisztikájára. A kvaterner ammóniumsók közül különösen előnyösek a trimetil-etoxi-poli(oxi-propil)-ammónium-kloridok.

A példákban felhasznált és kereskedelmi névvel említett anyagok a „Pesticide Manual”-ban megtalálhatók kémiai névvel és egyéb jellemzőkkel együtt.

Az ott nem szereplő anyagok jellemzői:

- RENOL: paraffinolajból és halolajból álló adjuváns (Clariant)

- BÉTÁNÁL P vagy BÉTÁNÁL PROGRESS dezmedifán, etofumezát és fenmedifám elegye (Bayer)

- BÉTÁNÁL és BÉTÁNÁL E fenmedifámtartalmú készítmények (Bayer)

1. példa

A genetikusán módosított cukorrépát a 0 218 571 számú európai leírásban leírt technológiának megfelelően glifozáthoz toleránssá téve szokásos mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően 4,5 cm ültetési távolságra ültetjük, egy soron belül kézzel ritkítva és biztosítva a normáltermést szabálytalan blokkot kialakítva. A kialakított parcella mérete: 2,7*6 m; parcellánként hat sort telepítünk 0,45 m-es sor közötti távolságra. Minden egyes tesztben négy ismétlést végzünk.

A tesztparcellákat lényegében gyommentesen tartjuk: a preemergens herbicid alkalmazása esetén a szükséges és specifikus posztemergens glifozátkezelést végezzük, mint azt az alábbiak szerinti standard, hivatalosan elfogadott cukorrépa-kezelési eljárások során megadjuk (összehasonlítási célból).

Az alábbi kezeléseket végezzük:

1. Standard cukorrépa-herbicid

2. Standard cukorrépa-herbicid dupla mennyiségben

3. 3*720 g h. a./hektár glifozátkészítmény

4. 3*1080 g h. a./hektár glifozátkészítmény

5. 3*1440 g h. a./hektár glifozátkészítmény

6. 2*2160 g h. a./hektár glifozátkészítmény

Ha három egymás utáni glifozát herbicid kezelést hajtunk végre, az első lépést 2-4 leveles állapotban végezzük a terménynövény esetében; a másodikat 6-8 leveles állapotban és a harmadikat 10-12 leveles állapotban végezzük, de a sátor zárása előtt.

Ha két egymás utáni időpontban végzett kezelést hajtunk végre, az elsőt a terménynövény 2-4 leveles állapotában, a második alkalmazást a terménynövény 10-12 leveles állapotában végezzük.

A glifozát herbicid készítmény 360 g glifozát h. a./l tartalmaz izopropil-ammónium-só formájában és 180 g/l felületaktív anyagot, mely trimetil-etoxi-poli(oxipropil)(8)-ammónium-kloridot és etoxilezett (20) szorbit-észtert 80:20 tömegarányban tartalmaz. A glifozátkészítményt 200 l/hektár víz mennyiségű térfogatban alkalmazzuk 2Ί0⁵ Pa nyomáson.

A friss gyökértömeget betakarításkor mérjük. A friss gyökértömeget a standard 1. kezelés után 100% hozamban határoztuk meg, és a mért friss gyökértömeg a standard 1. vizsgált eredményének felel meg.

la. táblázat

Kezelés	%-os hozam (friss gyökértömeg/hektár)
1*	100
2‘	96
3	108
4	108
5	110
6	113

* A standardkezelés három kezelésből áll:

Herbasan	1,0 l/hektár	1,0 l/hektár	1,0 l/hektár
Ethosan	0,1 l/hektár	0,2 l/hektár	0,2 l/hektár

HU 225 460 Β1

Táblázat (folytatás)

Goltix	1,0 kg/hektár	1,0 kg/hektár	1,0 kg/hektár
Renol S	0,3 l/hektár	0,3 l/hektár	0,3 l/hektár

Herbasan (gyártó: Mirfield, Stefes): fenmedifám hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény

Ethosan (gyártó: Bayer CropScience): etofumezát hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény Goltix (gyártó: Bayer): metamitron hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény

Renol S (gyártó: Clariant): paraffinolajból és halolajból álló adjuváns, felületaktív szer

Ib. táblázat

Kezelés	%-os hozam (friss gyökértömeg/hektár)
1*	100
2*	102
3	110
4	113
5	117
6	113

* A standard kezelés három kezelésből áll:

Goltix	1,7 kg/hektár	0,75 kg/hektár	1,0 kg/hektár
Actipron	1,7 l/hektár
Bétánál E		2,0 l/hektár
Venzar		0,4 l/hektár
Bétánál prog.			2,0 l/hektár

Bétánál (gyártó: Aventis): fenmedifám hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény

Actipron (gyártó: British Petroleum): adjuváns olaj Venzar (gyártó: DuPont): lenacil hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény le. táblázat

Kezelés	%-os hozam (friss gyökértömeg/hektár)
1*	100
2*	-
3	129
4	156
5	136
6	132

* A standardkezelés preemergens kezelésből és két posztemergens kezelésből áll a hivatalosan elfogadott cukorrépaherbicidekkel, az alábbiak szerint:

Goltix	3 kg/hektár	0,5 kg/hektár	0,5 kg/hektár
Pyramin DF	2 kg/hektár
Bétánál P		1,0 kg/hektár	1,0 l/hektár
Stratos			1,0 l/hektár

Pyramin DF (gyártó: BASF): kloridazon hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény

Stratos (gyártó: BASF): cikloxidim hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény

2. példa

Azonos teszteket ismételtünk a glifozáttoleráns takarmányrépával (genetikailag ugyanazon technikával transzformálva).

Ha. táblázat

Kezelés	%-os hozam (friss gyökértömeg/hektár)
1*	100
2*	101
3	108
4	107
5	110
6	110

A standard (*) a teszt esetében három kezelést tartalmazott:

Herbasan	1,0 l/hektár	1,0 l/hektár	1,0 l/hektár
Ethosan	0,1 l/hektár	0,2 l/hektár	0,2 l/hektár
Goltix	1,0 kg/hektár	1,0 kg/hektár	1,0 kg/hektár
Renol S	0,3 l/hektár	0,3 l/hektár	0,3 l/hektár

Azonos tesztet ismételtünk meg ugyanazon fenti vonal szerint, kivéve a preemergens herbiciddel történő kezelést, melyet valamennyi parcellán elvégeztünk, mely parcella 1 kg/hektár Goltix- és 3 l/hektár Bétánál E-kezelést kapott.

Ilb. táblázat

Kezelés	%-os hozam (friss gyökértömeg/hektár)
1*	100
2*	100
3	108
4	110
5	113
6	110

* A standardteszt egy kezelésből állt:

Goltix	1 kg/hektár
Bétánál E	3 l/hektár

HU 225 460 Β1

3. példa

Ebben a kísérletben lényegében az 1. vagy 2. példa szerinti módszer szerint jártunk el.

A glifozáttoleráns cukorrépát jó mezőgazdasági gyakorlat szerint eljárva 1995 kora májusában ültettük. A parcellákat lényegében kézzel gyommentesítettük (kezeletlen) vagy glifozát herbicidet alkalmaztunk. A glifozát izopropil-ammónium-sóját tartalmazó készítmény formájában alkalmaztuk, mely készítmény 360 g/l sav ekvivalenst és 180 g/l felületaktív szert [trimetil-etoxi-poli(oxi-propil)(8)-ammónium-kloridot (80) etoxilezett (20) szorbit-észterrel (20)] együtt tartalmazott.

T1=2-4 levél állapot (körülbelül 30 nappal az ültetés után)

T2=8-10 levél állapot (körülbelül 50 nappal az ültetés után)

T3=14-18 levél állapot (körülbelül 65 nappal az ültetés után)

Az alábbi III. táblázat a friss gyökértömegek mért átlagértékeit mutatja grammokban kifejezve növényenként, 180 nappal az ültetés után, a glifozátkészítmények átlagos szintjét a fentiekben adtuk meg.

III. táblázat

T1	T2	T3	180 n. ü. u. (g)
Kezeletlen	Kezeletlen	Kezeletlen	1420
2	2	2 I	1717
3	0	3I	1538
6	0	6I	1885
4	0	4I	1904

Ez a kísérlet nyilvánvalóan mutatja a friss gyökértömeg aratáskor mért növekedését néhány glifozátkezelés után. Megfigyelhető a hozam növekedésének trendje, mint az alkalmazott glifozátmennyiség növelésének függvénye.

A megnövekedett hozamokat a megfelelő megnövekedett száraz növény tömegére transzformálhatjuk betakarításkor.

4. példa

A kísérlet célja a transzgenetikus glifozát herbicid készítménnyel permetezett cukorrépa és a herbicid készítménnyel nem kezelt cukorrépa összehasonlítása, a répaminőség (répacukor-tartalom, invertcukor-tartalom, káliumtartalom, nátriumtartalom, amino-nitrogéntartalom a gyökérben; a cukorrépa és a felső rész tápanyagtartalma szárazanyagban, a nyers rostok és a taxin tartalma) összehasonlítása.

A cukorrépát főleg a cukoriparban használják fehércukor, cukorpép és melasz előállítására. A cukorrépa gyártási technológiája erre a célra a cukortartalom, káliumtartalom, nátriumtartalom és amino-nitrogén-tartalom analízise alapján számolt paraméterek beállítása útján történik. A cukorrépa toxinjait és saponinjait mértük.

A minták előállítása

Aratás után a gyökereket 0 °C és 10 °C közötti hőmérséklet-tartományban összegyűjtöttük és a felső rész mintákat -20 °C értéknél alacsonyabb hőmérsékleten fagyasztottuk.

A répakészítményt péppé alakítottuk valamely félautomata kezelés útján, ahol a répát szeleteltük és további aprítással pépet kaptunk. Ezután a pépet homogenizáltuk, 1 mintát használtunk extrakció után a polarizáció, az invertcukor, a nátrium, a kálium és az amino-nitrogén mérésére, más mintákat szárítottunk és táp készítésére használtuk. Ugyanazon brei harmadik mintáját a toxinok meghatározására fagyasztottuk. A cukorrépapép extrakcióját ásványmentesített vízzel végeztük, melyhez a tisztítás céljából alumínium-szulfát-tablettát adtunk és azt Venema típusú, automatikus feltáró-szűrő berendezésbe vezettük. A nagyméretű répa-felsőrészmintákat úgy állítottuk elő, hogy azokat horizontálisan, egyenlő almintákra vágtuk.

Analitikai módszerek

Szárazanyag-tartalom - Oven-féle módszer

Gyökér: Miután a gyökeret péppé alakítottuk, a pépet 95 °C hőmérsékletű szárítóba helyeztük és 24 órán keresztül állandó tömegűvé szárítottuk.

Felső rész: A mintát 95 °C hőmérsékletű szárítóba helyeztük 72 órán keresztül a minta méretétől függően, és a szárítást az állandó tömeg eléréséig folytattuk. Mind a gyökér, mind a felső tömeg tömegvesztését pontosan meghatároztuk, és a szárazanyagot százalékban kiszámoltuk.

Nyersrost - Weende-módszer

A mintákat egymás után forró kénsavoldattal és adott koncentrációjú kálium-hidroxiddal kezeltük. A párlási maradékot szűréssel elkülönítettük és Gosch tűzálló üveggyapoton keresztül szűrtünk, mostunk, szárítottunk és égetőkemencében 550 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül hamvasztottunk. A hamvasztás utáni tömegveszteséget gravimetriásán határoztuk meg, és a minta nyersrostanyagának százalékában fejeztük ki.

Toxinok: Saponinok - HPLC módszer

A módszer a cukorrépa-saponinok savas hidrolízisén alapszik. A felszabadult oleánsavat diklór-metánnal extraháljuk. A víz lepárlása után a mintamaradékot metanolban oldjuk. Az oleánsavat szerves fázisú HPLC módszerrel vizsgáltuk, acetonitril/víz eluenssel és 210 nm-nél UV-detektorral határoztuk meg.

A répaextraktum cukortartalma

A répaextraktumot alumínium-szulfáttal elegyítettük és PROPOL típusú polariméteren határoztuk meg az optikai forgatóképesség alapján. Az optikai forgatóképességet 70 nm hosszú csőben °Z (Pol%) konverziónál 546 nm hullámhosszon mértük vagy g/100 g répatömeg-értékben adtuk meg.

A répaextraktum amino-nitrogén-tartalma

A répaextraktumot alumínium-szulfáttal derítjük, 570 nm-en ninhidrinnel végzett színreakció után az amino-nitrogén-tartalmat kolorimetriásan határozzuk meg.

HU 225 460 Β1

A répaextraktum kálium- és nitrogéntartalmának meghatározása

A répaextraktumot alumínium-szulfáttal derítjük és lángfotométer IV készülékkel határozzuk meg, ahol a nagy energiaemittáló kálium- és nátriumvonalat mér- 5 tűk a lángban 589 nm és 768 nm hullámhosszon.

A mintát lítium-szulfáttal hígítjuk, a lítiumot belső standardként használjuk a lángfotométer jelegyensúlyozására.

A répaextraktum invertcukor-tartalmának meghatá- 10 rozása

A répaextraktumot alumínium-szulfáttal derítjük, a meghatározást kolorimetriásan végezzük 560 nm-en, réz-szulfát neokuproin-sósavas reagenssel történő reakció után. 15

A glifozáttoleráns cukorrépaterményt genetikusán a 0 218 571 számú európai szabadalmi leírásban leírt technológia szerint transzformáltuk toleráns glifozát herbiciddé, a termesztés 6 különböző helyen (Olaszországban, Spanyolországban, Belgium- 20 bán, Dániában, Franciaországban és Angliában) történt.

A termesztett növények típusa a helyi adottságoktól függött. Az anyagot számos jellemző határozta meg, az egyik igen fontos szempont a cukortartalom, ame- 25 lyet polarizációból (Pol) határoztunk meg. A cukorrépát alcsoportokra osztottuk: E-típus, N-típus és Z-típus. Az E-típus alacsony polarizációjú, a Z-típus magas polarizációjú és az N-típus az E- és a Z-típus közötti polarizációval rendelkezik. Az Észak-Európában termesztett 30 fajtákat E-N, N vagy N-Z jelöléssel jellemezhetjük.

A példákban használt anyagok az N-csoportnak felelnek meg.

A cukorrépát a helyi mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően ültettük, manuálisan ritkítással biztosítva 35 a normál termésmennyiséget. Vizsgálatonként legalább egy ismétlést végeztünk.

A parcellák lényegében gyommentesek voltak az alábbi kezelés következtében:

- glifozát herbicid a tesztparcellán, 40

- állandó répaszelektív herbicid kezelés (helynek megfelelően) a kontrollparcellába, kivéve Dániát, Olaszországot, ahol a glifozáttól eltérő, más herbicidet nem alkalmaztunk a gyommentes körülmények fenntartására. 45

A glifozát herbicid készítmény azonos az 1. példában használt készítménnyel. A herbicid glifozátkészítményt az alábbiak szerint alkalmaztuk:

- preemergens 2,0 l/hektár

- 2-4 valódi répalevél 2 l/hektár 50

- 6-8 valódi répalevél 2 l/hektár

-12-14 valódi répalevél (zárt sátorban) 2 l/hektár

A szelektív herbicidszinteket az alábbiak szerint alkalmaztuk:

- Spanyolország: 3,55 kg/hektár Goltix WG (metamitron hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Bayer) preemergens.

- Belgium: - 2 l/hektár Gramoxone (parakvat-diklorid hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Zeneca) ültetéskor;

- 3 l/hektár Pyramin FL (kloridazon hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: BASF) 1 héttel az ültetés után;

- 0,5 l/hektár Bétánál (fenmedifám hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Aventis) 3 héttel az ültetés után;

- 0,5 l/hektár Goltix (metamitron hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Bayer) 3 héttel az ültetés után;

- 0,5 l/hektár Trámát (etofumezát hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Aventis) 3 héttel az ültetés után;

- 0,75 l/hektár Goltix (metamitron hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Bayer) 5 héttel az ültetés után;

- 0,75 l/hektár Vegelux (herbicidként alkalmazható, paraffinalapú ásványolaj, gyártó: Micro Nutrients NV) 5 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Tramat 5 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Goltix 6 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Vegelux 6 héttel az ültetés után -0,17 l/hektár Fusilade (fenaziprop-P-butil hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Zeneca) 6 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Bétánál 6 héttel az ültetés után 0,75 l/hektár Tramat 9 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Bétánál 9 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Goltix 9 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Vegelux 9 héttel az ültetés után

- Franciaország: 0,75 l/hektár Goltix WP 1 nappal az ültetés után

- 0,75 l/hektár Goltix WP 2 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Bétánál 2 héttel az ültetés után

- 0,75 l/hektár Tramat 2 héttel az ültetés után

- Anglia: 1,0 l/hektár Laser (cikloxidim hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény) 5 héttel az ültetés után

Az analitikai eredményeket összegyűjtöttük, és az átlagokat az alábbi táblázatban mutatjuk be. Az egyes országokra kapott átlagértékek kiszámításához azonos tömegeket alkalmaztunk.

Növényből származó rész	Analizált egység	Kezelt/kezeletlen	Cukorrépa
Pép	szárazanyag-tartalom	kezelt	21,309
	(g/100 g gyökér)	kezeletlen	20,444
Gyökér	invertcukor-tartalom	kezelt	1,011
	(mmol/100 g gyökér)	kezeletlen	1,755

HU 225 460 Β1

Táblázat (folytatás)

Növényből származó rész	Analizált egység	Kezelt/kezeletlen	Cukorrépa
	káliumtartalom	kezelt	5,162
	(mmol/100 g gyökér)	kezeletlen	5,286
	amino-nitrogén- (NH₂N) tart.	kezelt	2,470
	(mmol/100 g gyökér)	kezeletlen	2,878
	nátriumtartalom	kezelt	1,118
	(mmol/100 g gyökér)	kezeletlen	1,769
	cukortartalom (Pol)	kezelt	15,610
	(g/100 g gyökér)	kezeletlen	14,478
felső rész	szárazanyag-tartalom	kezelt	14,724
	(g/100 g felső rész)	kezeletlen	13,996

Kezelt: glifozát herbiciddel permetezve Kezeletlen: glifozát herbiciddel nem permetezve

Az adatok szerint a glifozát herbiciddel kezelt cukorrépa jelentősen magasabb cukortartalmat mutat 20 csökkentett nátrium-, kálium-, amino-nitrogén- (NH₂N) és invertcukor-tartalommal a gyökérben. A gyökér és a felső rész szárazanyag-tartalma szintén növekedett. Részletesebb adatokkal a glifozáttal kezelt cukorrépa leveleiben a magasabb rosttartalom mutatható ki.

A jelen példa szerinti eredményeket egybevetve az előző példa szerinti eredményekkel az tűnik fel, hogy a hozam növekedése a korábbi tömeg/hektár értékhez viszonyítva szintén a szárazanyag-, a rost- és a cukortartalom növekedését mutatja a betakarított anyagban. 30

5. példa

A cukorrépát és a takarmányrépát a 0 218 571 számú európai szabadalmi leírásban leírt technológiának megfelelően genetikusán módosítottuk, toleránssá 35 téve a glifozáttal szemben, és különböző országokban a helyi mezőgazdasági adottságoknak megfelelően ültettük 4,5 cm növényközti távolságra, a sorokon belül a normáltermés kialakítására manuálisan ritkítottunk a szabályozatlan blokk megjelenítés céljából; parcella- 40 méret: 2,7*7 m; 6 sor parcellánként 0,45 m soronkénti távolsága. Mindegyik kísérletben négy ismétlést végeztünk.

A tesztparcellákat lényegében gyommentessé tettük oly módon, hogy standard preemergens herbicid 45 kezelést alkalmaztunk az egész területen, és ezután kézzel gyomtalanítottunk, amelyet a posztemergens glifozátkezelés követett, melyet az alábbiakban ismertetünk.

Az alábbi kezeléseket végeztük

Kézi gyomirtás önmagában

3*720 g h. a./hektár glifozátkészítmény

3*1080 g h. a./hektár glifozátkészítmény

3*1440 g h. a./hektár glifozátkészítmény 55

2*2160 g h. a./hektár glifozátkészítmény

Ha három egymás után következő glifozát herbiciddel történő kezelést valósítottunk meg, akkor az első kezelést 2-4 levelű állapotban végeztük a terményre vonatkoztatva, a második kezelést a termény 6-8 leve- 60 lű állapotában hajtottuk végre, a harmadik kezelést a termény 10-12 levelű állapotában hajtottuk végre, a fóliasátorral történő fedés előtt.

Ha két egymás után történő kezelést végeztünk, akkor az első kezelést 2-4 levelű állapotban végeztük, a második kezelést 10-12 levelű állapotban végeztük a terménynövényre vonatkoztatva.

A glifozát herbicid készítmény 360 g glifozát h. a./l mennyiséget tartalmazott izopropil-ammónium-só formájában és 180 g/l feletti aktív anyagot trimetiletoxi-poli(oxi-propil)(8)-ammónium-klorid és etoxilezett (20) szorbit-észter 80:20 tömegaránya mellett. A glifozátkészítményt hektáronként 200 I víz térfogatban 2-10⁵ Pa nyomáson alkalmaztuk.

A friss gyökértömeget aratáskor mértük. A friss gyökértömeget a kézzel gyomtalanított talajból 100% hozammal termeltük és mértük a friss gyökértömeget a glifozátkezelés után, a kézzel gyomirtott parcella eredményeihez vonatkoztatva.

V. táblázat % hozam (friss gyökértömeg)

Kezelés	Cukorrépa	Takarmányrépa
Kézzel gyomtalanított	100%	100%
3*720 g h. a.	101	105
3*1080 g h. a.	98	106
3*1140 g h. a.	115	108
2*2160 gh. a.	107	102

6. példa

Ebben a szabadföldi kísérletben téli vörös magvú repcét, adott genetikai háttérrel, genetikailag modifikáltunk a glifozát herbicid tolerancia kimutatására (az EPSPS-kifejeződés és glifozátoxidoreduktáz-kifejeződés a kombinált technikáknak megfelel). Ezeket 1995. szeptember közepén ültettük a jó mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelően, 4 kg magot ültetve hektáronként 100 növény/m² értéket beállítva (normál szabadföldi stand), a randomizált blokktelepítésnek eleget

HU 225 460 Β1 téve; parcellaméret: 3*7 m, sorok közti távolság: 0,14 m; tesztenként 4 ismétlés.

A parcellákat lényegében gyommentesen tartottuk. A gyommentesítést standard preemergens herbicidek alkalmazásával végeztük az egész területen, azaz 1,5 I Butisan S-t (metazaklór hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: BASF) alkalmaztunk 1 nap alatt soros vetés után, és még 1 l-t alkalmaztunk az egész standardparcellára. A glifozátkezelést az alábbiak szerint végeztük.

A glifozátos kezelést ősszel végeztük a növény egy meghatározott növekedési állapotában, és az 1. példában használttal azonos készítményt alkalmaztunk.

Az aratást augusztus elején végeztük és a hozam értékelését tonna/hektár gabonában fejeztük ki (9% nedvességtartalom mellett). A VI. táblázat a mért hozamokat mutatja %-ban a standardparcellában.

VI. táblázat Hozam

Standard	100
1080 g h. a./hektár	104,5

7. példa

Ezt a szabadföldi tesztet az előző példákban leírtakkal analóg teszttel végeztük, azzal az eltéréssel, hogy ebben a példában tavaszi olajmagvú repcét műveltünk (1996. április közepe). Az ilyen növények ismert genetikai háttérrel rendelkeznek és toleránsak a glifozát herbiciddel a 6. példában említett kombinációs technikának megfelelően.

A parcellákat 1,5 l/hektár Butisan S (metazaklór hatóanyagot tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: BASF) alkalmazásával az egész területen gyommentesítettük és kézzel gyomtalan itattunk a standardparcella vonatkozásában, majd a maradék parcellarészt glifozát herbiciddel kezeltük. Azonos glifozátkészítményt alkalmaztunk 1 hónappal az ültetés után. Az aratás augusztus közepén történt.

Az alábbi VII. táblázat a hozamadatokat mutatja (a

6. példa szerint mérve és kifejezve), az értéket a standardparcella %-os hozamában kifejezve.

VII. táblázat Hozam

Standard	100
720 g h. a./hektár	120
1080 g h. a./hektár	112

8. példa

A korábbi szabadföldi kísérleteket Olaszországban végeztük a hozamnövekedés vizsgálatára a glifozátra toleráns terményekben a glifozát herbiciddel történő kezelés után. Ismert genetikusán módosított glifozátra toleráns növényeket, és az ültetést és a növesztést az adott mezőgazdasági körülményeknek megfelelően végeztük, 62 000 növényt ültetve hektáronként (körülbelül 4,7 mag/m) a 3*9 m-es parcellában, 9 m-es sortávolságban, komplett szabálytalan blokkot megvalósítva, négy ismétlést alkalmazva egy kísérletben, majd a normál termésstand kialakítására kézzel ritkítottunk és azonos növényszámot állítottunk be valamennyi parcellában. A teljes terület standardparcellát és tesztparcellát foglalt magában, melyeket preemergens herbiciddel (Lasso Micromix: alaklór és terbutil-azin 7:3 arányú keverékét tartalmazó herbicid készítmény, gyártó: Monsanto) kezeltünk 6 l/hektár (azaz 2016 g alaklór és 864 g terbutil-azin) mennyiségben. A standardparcellákat kézzel gyomtalan itattuk kívánt esetben, és a parcellákat azonos glifozátkészítménnyel az 1. példa szerint kezeltünk különböző mennyiségben és különböző növénynövekedési állapotban. Csak a középső sort arattuk a középső 7 méteren. A hozamot tonna mag/hektár értékben fejeztük ki 15% nedvességtartalom mellett és az egyes táblázatban mint százalékos hozamot a standardhoz viszonyítva fejeztük ki (STD).

Xllla. táblázat % hozam/glifozátkezelés 3-4 levelű állapotban

	Transzformáció 1. művelet	Transzformáció 2. művelet
STD	100	100
720 g h. a./hektár glifozát	106	103
1800 g h. a./hektár	107	107

Xlllb. táblázat

Hozam/glifozátkezelés 5-6 levelű állapotban

	Transzformáció 1. művelet	Transzformáció 2. művelet
STD	100	100
720 g h. a./hektár glifozát	114	105
1800 g h. a./hektár	109	108
1440 g h. a./hektár	109	105
1800 g h. a./hektár	111	102

9. példa

A további szabadföldi kísérleteket az 1. példában leírt módszer alapján végeztük abból a célból, hogy értékeljük a különböző glifozát herbicid készítmények hatását a hozamnövelés szempontjából. A transzgenetikus termények három glifozát herbicid kezelést kaptak 720 g h. a./hektár mennyiségben és 1080 g h. a./hektár mennyiségben.

IX. táblázat % hozam - friss gyökértömeg

	3*720 g h. a.	3*1080 g h. a.
Roundup®	100	100
Granulátumké- szítmény	101,4	100,2

HU 225 460 Β1

IX. táblázat (folytatás)

	3*720 g h. a.	3*1080 g h. a.
Folyadékkészít- mény	104,2	102

Roundup® (gyártó: Monsanto)

- glifozát-izopropil-ammónium-só 360 g h. a./l

- etoxilezett faggyúamin felületaktív szer 180 g/l

Szilárd granulátumkészítmény:

- glifozát-nátrium-só 430 g h. a./kg

-trimetil-etoxi-poli(oxi-propil)(8)-ammónium-klorid 160 g/kg

- ammónium-szulfát 330 g/kg

Folyékony készítmény: azonos az 1. példában használtakkal.

A példa bemutatja a találmány szerinti készítmény javított alkalmazását, mely készítmény környezeti szempontból elfogadható, definíció szerinti felületaktív szereket foglal magában.

10. példa

Hasonló eljárást hajtunk végre, mint a 7. példában leírtak (tavaszi olajmagvas repce), jelen példában a különböző glifozát herbicidek különböző hatását értékeltük. A tesztparcellák jelen kísérletben 1,5*10 m-esek.

X. táblázat

Hozam tonna/hektár mag 9% nedvességtartalomnál

	% hozam
l/hektár	1	2	3	4
Roundup®	100	100	100	100
Granulátumké- szítmény	101	103	109	-
Folyadékkészít- mény	103	101	110	108

A Roundup®-kezelés után nyert hozam 100%.

Ez a példa további bizonyíték a 7. példában használt készítmény előnyére.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Glifozát vagy valamely származékának alkalmazása növény terméshozamának növelésére, melynek során a növényt glifozáttal szemben toleráns cukorrépa, takarmányrépa, gabona, olajmagvú repce és gyapot közül választjuk ki, és a glifozátot vagy valamely származékát a szokásos letális dózisban juttatjuk ki.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, melynek során a glifozátot vagy valamely származékát 0,2 és 6,0 kg hatóanyag/hektár közötti letális dózistartományban juttatjuk ki.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, melynek során a glifozátot vagy annak valamely származékát egyszeri vagy egymást követő kezelésekben alkalmazzuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, melynek során glifozátszármazékként glifozátsót, előnyösen monoizopropil-ammónium-sót, ammóniumsót vagy nátriumsót vagy ezek keverékét használjuk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, melynek során a kijuttatott készítmény segédanyagaként aminokat, így etoxilezett alkil-aminokat, előnyösen faggyúaminokat, kókuszaminokat, felületaktív szereket, aminoxidokat, kvaterner ammóniumsókat, így etoxilezett és/vagy propoxilezett kvaterner ammóniumsókat, előnyösen alkil-poliglikozidot vagy alkil-glikozidot, glükóz- vagy szacharóz-észtereket, előnyösen etoxilezett polipropoxilezett kvaterner ammóniumsókat mint adjuvánsokat tartalmaz.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás glifozát herbiciddel szemben toleránssá tett cukorrépa, takarmányrépa, olajmagvú repce, gyapot vagy gabona terméshozamának növelésére.
7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás cukor- vagy takarmányrépa terméshozamának növelésére.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a termény valamely EPSPS polipeptidet kódoló gént tartalmaz.
9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a termény valamely glifozát oxidoreduktázenzimet kódoló gént tartalmaz.
10. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a növény II osztályú EPSPS enzimeket kódoló gént tartalmaz.