BG63796B1

BG63796B1 - Приложение на n-(фосфонометил)глицин и неговите производни

Info

Publication number: BG63796B1
Application number: BG102804A
Authority: BG
Inventors: Ivo Brants; William Graham
Original assignee: Monsanto Europe S.A.
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2003-01-31
Also published as: IL126307A0; CA2249332C; SI0889692T1; SK283574B6; UA50765C2; EP0889692B1; NZ331764A; DE69713496D1; HUP9902665A2; AP9801354A0; PL329125A1; DK0889692T3; ES2178768T3; CZ287298A3; EE03588B1; JP2000507565A; EP0889692A1; AU712463B2; CZ292220B6; CN1220579A

Abstract

Изобретението се отнася до ново приложение на глифозат или негови производни за повишаване добива и/или качеството на културни растения, толерантни на глифозат, като захарно цвекло, фуражно цвекло, ряпа и памук.

Description

(54) ПРИЛОЖЕНИЕ НА Ν-(ΦΟΩΦΟΗΟΜΕТИЛ) ГЛИЦИН И НЕГОВИТЕ ПРОИЗВОДНИ

Област на техниката

Изобретението се отнася до ново приложение на глифозат, или М-(фосфонометил) глицин и негови производни като соли и естери, като средство за повишаване добива на културни растения, които са устойчиви на глифозат.

Предшестващо състояние на техниката

Глифозатът е добре известен като неселективен хербицид, който е активен (постемергентен) фолиант. Известно е, че глифозатът действа върху различни ензимни системи, като по този начин влияе на образуването на аминокиселини и други ендогенни химични съединения в третираните растения. Благодарение на относително ниската водна разтворимост на киселата форма глифозатът се прилага предимно под формата на сол, като моноизопропиламониева, амониева, натриева сол или други.

Известните продукти включват активния ингредиент и повърхностно активно вещество или смес от повърхностно активни вещества и вероятни други добавки, като противоразпенващи агенти, антифризи, оцветители и други, известни в областта. Литературната справка се намира в книгата “The Herbicide Glyphosate”, edited by E. Grossbard and D. Atkinson & Co, 1985.

US 3 853 530 описва приложението на Nфосфонометилглицин и неговите производни за изменение естествения прираст и развитие на растенията, като дефолиация (обезлистяване) и забавяне на вегетативния растеж. Счита се, че в определени растения това забавяне води до по-късо главно стебло и засилено странично разклоняване. Това изменение на естествения растеж или развитие би довело до получаване на по-малки кичести растения, които често демонстрират повишена резистентност на засуха и заразяване с вредители. При торфените треви забавянето на вегетативното развитие може да бъде особено желано, като по този начин се засилва развитието на корена за осигуряване на плътност, което закрепва торфа и удължава интервала между косенето на ливадите, площадките за голф и подобни тревни площи. Счита се, че в много типове растения, като силажни култури, захарна тръстика, цвекло, грозде, пъпеш и плодни дървета, забавянето на вегетативното развитие, причинено от глифозат, води до повишаване на въглехидратното съдържимо на растенията към момента на събирането на урожая. Тези приложения задължително изискват сублетални дози, докато в противен случай третираните растения биха загинали.

US 3 988 142 по-специално се отнася до приложение на N-фосфонометилглицин и неговите производни за повишаване на отлагането на въглехидрати в растения, като захарна тръстика. Отново, използваните стойности са сублетални и се прилагат малко преди събирането на урожая.

И в двата отбелязани по-горе случая се счита, че нелетални дози от глифозатния хербицид, т.е. доза, твърде далече от обичайно използваните дози за борба с популациите от плевели в полето с културни растения, причинява редукция или забавяне на вегетативното развитие и активният материал следва нормалния кръговрат при засилване на тяхното хербицидно действие в растенията. В случая на US 3 988 142 забавянето на вегетативното развитие се счита, че позволява повече от достъпните въглехидрати в растенията да бъдат превърнати в нишесте или захароза, вместо да бъдат използвани като храна за растенията за продължаване на развитието.

DE 3 200 486 се отнася до подобряване продуктивността на културните растения чрез обработването им със сублетални дози от фосфинотрицин (глуфозинат), който е също ефективен неселективен хербицид. Тук се счита, че инхибирането на вегетативното развитие чрез сублетални дози от хербицида причинява повишаване на въглехидратите в растенията или техните плодове. В сравнителен пример в DE 3 200 486 (пример II) се посочва, че глуфозинатът има по-добър ефект от глифозата при същите стойности.

ЕР 0 401 407 се отнася до сходна материя. Той описва приложението на сублетални стойности от неселективни хербициди, като глифозат и фосфинотрицин, по време на преминаването от масата, формираща стадия на съзряване на растенията с оглед повишаване въглехидратното отлагане в растения, продуциращи захар и нишесте, различни от тръстика, като захарно цвекло, картофи или житни растения.

WO 95/05082 описва метод за повишаване добива на културни растения, които са резистентни на глутамин синтетазни инхибитори, като фосфинотрицин, посредством обработването им с такива стойности от хербицида, каквито се използват за борба с плевелите в полето с културни рас тения. В този документ по-нататък се твърди, че хербициди с различен начин на действие не проявяват този ефект или често показват отрицателен ефект върху добива.

Развитието напоследък на генната технология направи възможно генетичното трансформиране на растения, по-специално културни растения, за да станат устойчиви към глифозат или неговите производни. Например, ЕР 0 218 571 се отнася до клониращ или експресионен вектор, включващ ген, който кодира EPSPS полипептид, който при експресиране в растителна клетка придава глифозатната устойчивост на растенията, регенерирани от такава клетка. ЕР 0 293 358 понататък се отнася до усилване ефективността на глифозатустойчиви растения чрез продуциране на мутантни EPSP синтетазни ензими, които проявяват по-слаб афинитет към глифозата при съхранение на каталитична активност. WO 92/00377 разкрива гени, кодиращи глифозат оксидоредуктазен ензим. Гените са приложими при получаване на трансформирани растения, които разграждат глифозатния хербицид и са устойчиви на глифозатен хербицид. WO 92/04449 разкрива гени, които кодират клас II EPSPS ензими, които са приложими за продуциране на трансформирани растения, които са устойчиви на глифозатен хербицид. Такива културни растения могат да бъдат поддържани по същество чисти от плевели чрез прилагане на глифозатен хербицид след поникване на растението. Chemical Abstracts, vol. 124, N 8, 1996, се отнася до статия в ’’Weeds” (1995) by В. Н. Wells, озаглавена “Development of Glyphosate Tolerant Crops into the Market”. Авторът твърди, че са използвани два подхода за придаване устойчивост до търговски нива от глифозата в различни растения.

Статия, озаглавена Roundup Ready™ Sugar Beet by Brants et al., публикувана в началото на 1996 г. в “Proceedings of the International Symposium On Weed and Crop Resistance to Herbicides”, симпозиум проведен 3-6 Април 1995 показва, че нивата на устойчивост на търговския продукт Roundup™ са били получени в генетично модифицирани растения на захарно цвекло.

Установено е, че при обработване на поле от културни растения като цвеклови растения, рапица или житни растения, които са така модифицирани, че са устойчиви на глифозатен хербицид, дори с нормално летални стойности от глифозатен хербицид или стойности, обикновено използвани за борба с плевели, добивът от растенията се повишава. Този изненадващ ефект не би могъл да се очаква от изложеното по-горе ниво на техниката, доколкото в неустойчиви културни растения това би довело до загиване, и доколкото фосфинотрициновите хербициди имат начин на действие, различен от този на глифозатния хербицид.

Chemical Abstracts, vol. 123, No 21,1995 публикува един абстракт (Abstract N. 281158c) на статия от X. Delannay and others, в която се прави оценка на добива на глифозат-толерантна линия от соеви растения след третиране с глифозат. Авторите на статията заключават, че тенденциите в данните най-общо предполагат, че не съществува реална разлика, и че сравнения със стандартни хербицидни контроли подкрепят заключението за всеобхватна безопасност на третирането с глифозат, като вариабилността се счита, че се дължи на неблагоприятния климат и/или състояния на почвата.

В Weed (1995), посочен по-горе, В. Н. Wells също отбелязва, че не се забелязва значително редуциране след самостоятелни или последователни приложения на глифозат при различни стадии на културата. Посочва се, че водещи линии от глифозат устойчив памук също не показват понижаване на добива след прилагане на глифозат. Тези оценки потвърждават проявите на генетични модификации на релевантните културни растения, доколкото тяхната устойчивост спрямо релевантния хербицид е съхранена. В тази статия не се съдържат данни и няма описание или не може да бъде намерено предположение за възможното повишаване на добива на растението след прилагане на глифозата.

Макар по-рано посочената статия от I. Brants et al. да показва данни за средна стойност на теглото на корена (%) за три различни линии от глифозат, устойчиви растения захарно цвекло, характеризиращи се с три различни трансформационни събития, за различни глифозатни третирания, сравнени със стандарта, не е възможно да се получи повишаване на добива над показаните данни. Представени са данни за изпитана устойчивост. Показаните данни не са индикация за каквото и да е повишаване на добива в захарно цвекло, тъй като оценката на устойчивостта не е повлияна в условия без плевели, доколкото позволява конкуренция на плевелите в стандартни участъци. По-нататък, както става ясно за специалиста в областта, показаните данни са много ранни данни, получени в малки участъци, без повторения, локализирани на едно място, поради достъпност на семе ната. Също такива ранни семена все още съдържат сегрегиран семенен материал, който води до неправилна стойка на растенията в сравнение със стандарта; като впоследствие средното тегло се изчислява за растение (не за единица участък) и се сравнява със стандартното развитие при различни условия. Единственото заключение, което специалистът в областта може да направи от посочената по-горе статия е, че за три линии захарно цвекло е установено да показват ниво на устойчивост с потенциалност за комерсиално развитие.

Съгласно изобретението тестовете показват повишаване на добива (изразено като единица участък от повърхността) на глифозат устойчивите растения, като цвеклови растения, рапица, житни растения или памук, обработени с глифозатен хербицид до около 50%, в сравнение със същото растение, което не е било третирано с глифозатен хербицид. Счита се, че повишаването на добива не се дължи просто на по-слабата конкуренция между плевелите и културните растения като следствие от прилагане на глифазатния хербицид, тъй като ефектът е отбелязан за културни растения, оставени да се развиват в условия по същество без плевели. Също не е отбелязано въздействие за регулиране на растежа, както се разбира в нивото на техниката, като не е описано временно забавяне или друго временно изменение на естествения растеж или развитие на културното растение.

Техническа същност на изобретението

Съгласно изобретението е разработено приложение на глифозат или негови производни за повишаване добива на глифозат устойчиви културни растения.

За предпочитане глифозатът се прилага в обичайните летални дози за контролиране на популациите от плевели с оглед едновременно убиване на плевелите. Глифозатният хербицид може да бъде прилаган веднъж или в няколко успешни третирания. Прилаганите стойности най-общо включват в интервала между 0,2 и 6,0 kg киселинен еквивалент/ha, в зависимост от климатичните условия, сезона, заплевеността, стадия на развитие на плевелите и в зависимост от растението и други параметри, известни на специалиста в областта.

Глифозатният хербицид може да бъде прилаган в своята кисела форма или като нейно производно, за предпочитане сол, като моноизопропиламониева сол, натриева сол, или амониева сол или техни смеси. Могат да бъдат използвани и други соли на глифозата, в които катионът не е сам по себе си хербицидно активен или фитотоксичен.

Ефектът на повишаване добива на глифозат хербицидното третиране е установен в глифозат устойчиви растения, подбрани от различни видове цвекло като захарно цвекло или фуражно цвекло, житни растения, рапица и памук, независимо от използваните техники за предизвикване на устойчивост към глифозат.

Ефектът по-специално се отбелязва в глифозат устойчиво захарно цвекло и фуражно цвекло.

Глифозатният хербицид може например, да бъде приложен в кисела форма или под формата на негови производни, като водно разтворими или дисперсионни гранули, като водно разтворим концентрат, разреден в пулверизирана вода, или под формата на различни типове формулировки, като емулсии, капсулиран активен ингредиент и други.

Глифозатният хербицид може да бъде прилаган еднократно или в последващи приложения, в различни етапи на развитието на растението. Ефектът на глифозат хербицидното третиране върху глифозат устойчиви културни растения е от най-голямо значение, когато третирането се провежда в стадия на растеж на релевантни растения.

Такива формулировки на адюванти могат да бъдат намерени в “McCutchen’s Emulsifiers and Detergents”, и може да бъде подбран предимно от:

- амини, като етоксилирани алкил амини, по-специално талови амини, кокосови амини, повърхностно активни вещества, продавани под търговското наименование Ethomeen, амино оксиди, като повърхностно активни вещества, продавани под търговското наименование Empigen ОВ;

- кватернерни амониеви соли, като етоксилирани и/или пропоксилирани кватернерни амониеви соли, по-специално повърхностно активни вещества, продавани под търговското наименование Ethoquad, Emcol СС Dodigen;

- алкилполигликозид, алкилгликозид, глюкозо-и захарозоестери.

Особено предпочитани са кватернерни амониеви соли, като определените в ЕР 0 441 764, възможно в смес с омокрящ агент, и най-вече алкоксилиран сорбитанов естер. Този тип на повърхностно активно вещество или смес от повърхнос тно активни вещества не показва значим фитотоксичен ефект върху културните растения и се предпочита заради неговите благоприятни за опазване на околната среда характеристики.

Кватернерни амониеви соли от особен интерес са триметилетоксиполиоксипропил амониеви хлориди.

Пример 1. Растения на захарно цвекло, генетично модифицирани съгласно технологията, описана в ЕР 0 218 571 с оглед да им бъде придадена устойчивост към глифозат, се засяват съобразно добрата агрономична практика на 4,5 cm междукореново разстояние в лехата и се разреждат ръчно за осигуряване нормална стойка на растението съгласно дизайна на блока; размер на насаждението: 2,7 х 6 ш; 6 реда в участък с разстояние помежду им от по 0,45 ш. За всеки тест се използват четири повторения.

Тестуваните участъци се поддържат по същество чисти от плевели чрез предварителни приложения на хербицида, ако това се изисква, чрез последващи третирания с глифозат, прилагани както специално е посочено по-долу или стандарт, официално възприети за обработване на цвекло (за сравнителни цели).

Провеждат се следните третирания:

1. Стандартен хербицид за захарно цвекло;

2. Стандартен хербицид за захарно цвекло в двойна доза;

3. Три пъти по 720 g a.e/ha от формулирания глифозат;

Таблииа 1а

4. Три пъти по 1080 g a.e/ha от формулирания глифозат;

5. Три пъти по 1440 g a.e/ha от формулирания глифозат;

6. Два пъти по 2160 g a.e/ha от формулирания глифозат.

Ако се осъществяват три последователни приложения на глифозатен хербицид, първото се провежда на стадий 2-4 листа върху културните растения; второто се провежда на стадий 6-8 листа върху културните растения; и третото се провежда на стадий 10-12 листа върху културните растения, но преди завършването на листния покров.

Ако се осъществят две последователни приложения, първото се провежда в стадий 2-4 листа, а второто - на стадий 10-12 листа на растението.

Формулировката на глифозатен хербицид включва 360 g глифозат а.е./1 като изопропиламониева сол, и 180 g/Ι повърхностно активно вещество, съставено от триметил етоксиполиоксипропил (8) амониев хлорид и етоксилиран (20) сорбитанов естер (80:20). Глифозатната формулировка се прилага във воден обем от 2001/ha при налягане 2 bar.

Прясното кореново тегло се измерва при брането. Теглото на пресните корени след стандартна обработка N.1 се приема за 100% добив и измерените тегла за пресните корени се свързват с резултата от нея.

Третиране	% аобив (тегло на пресни корени за хектар)
1*	100
2*	96
3	108
4	108
5	110
6 .	113

Herbasan	1. OL/ha	1.017 ha	1.017 ha
Ethosan	0.117 ha	0.217 ha	0.217 ha
Goltrix	1.0 Kg/ha	1.0 Kg/ ha	1.0 Kg/ha
Renol S	0,3 L/ ha	0.317 ha	0.317 ha

Таблииа I.b ,

Третиране	% аобиВ (тегло на пресни корени за хектар)
1*	100
2*	102
3	110
4	113
5	117
6	113

* Стандартната обработка Включва три приложения:

Goltrix	1.7 Kg/ha	0.75 Kg/ha	1.0 Kg/ha
Actipron	1.717 ha
Betanal Е		2. 0L/ha
Venzar		0.417 ha
Goltrix
Benatai Prog.			2. 0 17 ha

Таблица I. с «

Третиране	i % аобиВ (тегло на пресни i I [ \| корени за хектар) 1 ι-——. —I
1*	100 !
o* z.	’i i
3	i 129 i — i
	i 156 1
5	^! 136 ! 1 j
i 6	Г · 132 Ί L .. . J

Стандартна ти обработка включва приложение преди поникването н две приложения след поникването с официално приети хербициди за. щтарно цвекло, както следва:

Gollrix ' 3 Kg/ha ,0.5 Kg/ha 0. 5 Ки/ϊκι I

I I ·. I ¹ J’yramin DI⁷ 2 Kg/ ha '

Betunai P ! ~ iT0”Kg/ha ; L0iTha ^— ' Strains ’ ....... ~ “ Д. O bha””

Пример 2. Същите тестове се повтарят с устойчиво на глифозат фуражно цвекло, генетично трансформирано съгласно същата технология.

Таблица II. а .

	Третиране	% аобиВ (тегло на пресни
		копени за хектар)
	1*	100
	2*	101
	3	108	“1
	4	107
	5	110
L_	6	111

Стандарта (*) от този тест Включва три приложения;

Herbasan	l.OL/ha	1.0 L/ha	l.OL/ha
Ethosan L .	0.1 bha	0.2 L/ha	0.2 L/ha
Goltrix	1.0 Kg/ha	l.OL/ha	1.0 Kg4ia
RenolS	ГбЗЪЪа .....j	0.3 L/ha __	0.3 L4ia

Същият тест е повторен със същата линия, както по-горе, с изключение на това, че обработка с хербицид преди поникването се прилага вър ху всички участъци и се състои от 1 kg/ha Goltrix (търговско наименование) и 3l/ha Betanal Е (тър45 говска марка).

Таблииа IT. Ь .

Г Третиране

1* корени за хектар)

J % добиВ (тегло на пресни j j

100

2*

1.00 ^_108”

1.10

113 по “Стандартът от този тест Включба едно приложение:

Golirix

Bctanal

Пример 3. За този експеримент се следва п< същество същия протокол, както в примери 1 и 2.

Устойчиви на глифозат растения на захарно цвекло са засадени в началото на май 1995 съгласно агрономичната практика. Участъците са запазени по същество свободни от плевели чрез ръчно почистване (без третиране) или чрез прилагане на глифозатен хербицид по подходящ начин. Глифозатьт се прилага като форма на изопропиламониева сол на глифозат, съдържаща 360 g/Ι киселинен еквивалент и 180 g/Ι повърхностно активно вещество (триметилетоксиполиоксипропил (8)

амониев хлорид (80) с етоксилиран (20) сорбитанов естер (20)).

Т1 = 2-4 листен стадий (приблизително 30

DAP - дни след засаждането)

Т2 = 8-10 листен стадий (приблизително 50 DAP)

ТЗ - 14-18 листен стадий (приблизително 65 DAP)

Таблица IV по-долу показва измереното средно тегло (в g) от корените за едно растение, 180 DAP, за няколко стойности на глифозатната форма, както е показано по-горе.

Таблица Ш,

Т1	Т2	ТЗ	180 DAP g
нетретирани	нетретирани	нетретирани	1420
2	2	21	1717
3	0	31	1538
6	0	61	1885
4	0	41	1904

Този експеримент ясно показва повишаването на теглото на пресни корени след няколко приложения на глифозат. Налице е също и тенденция за повишаване на добива като функция на стойностите на прилагания глифозат.

Повишеният добив се прехвърля в съответ ното сухо тегло на растенията при събиране на урожая.

Пример 4. Целта на този експеримент е сравняване на транегенни растения на захарно цвекло, които са били напръсквани с форма на глифозатен хербицид, и транегенни растения на захарно цвекло, които не са били третирани с такава хербицидна форма, от гледна точка на качеството на цвеклото със съдържание на захар, инвертна захар, калий, натрий, аминен азот в корените; веществата на корените и най-важните проби, като % сухо вещество, фиброзно съдържимо и съдържание на токсини.

Захарното цвекло се използва главно в захарната индустрия за получаване на бяла захар, пулпа и патока. Технологичната стойност на цвеклото за тази цел най-общо се оценява чрез анализиране на тяхното съдържимо на захар, калий, натрий и аминен азот. Във връзка с токсините в цвеклото, наблюдават се и сапонините.

Изготвяне на пробите

След събиране на урожая, корените се съхраняват на температура от 0 до 10°С и пробите от връхната част се замразяват на температура, пониска от -20°С.

Изготвянето на каша от цвекло става чрез полуавтоматична обработка, където цвеклото се нарязва на парченца в цвеклорезачка за получаване на цвеклова маса. След хомогенизирането на получената маса 1 субпроба се използва след екстракция за анализ на поляризацията, инвертната захар, натрия, калия и аминния азот, а друга субпроба се изсушава и се използва за хранителни вещества. Трета част от същата проба цвеклова маса се замразява за изследване на токсичност. Екстрахирането на цвекловата маса става с деминерализирана вода, в която се добавя таблетка алуминиев сулфат за осветляване и се прехвърля в автомат за разграждане и филтруване Venema. Получаването на голяма връхна част от цвеклото става чрез разделянето му хоризонтално на еднакви субпроби.

Методи за анализ

Сухо вещество - Метод с печка (EF 71/ 393/Е F; L279/7 р. 858-61 20/12-71):

Корен:

След преработката на корените в цвеклова маса пробата се поставя в печка при 95°С и се изсушава за 24 h (до постоянно тегло).

Връхна част:

Пробите се поставят в печка при 95°С и се изсушават до 72 h, в зависимост от размера на пробата, до постоянно тегло.

Загубите в теглото на корена и връхната част се определят количествено и се изчисляват като процент сухо вещество.

Сурова фиброзна маса - Метод на Weende (EF L 344/36-37 26/11-92 модифициран):

Пробата се третира последователно с ки пящи разтвори на сярна киселина и калиев хидроксид при определени концентрации. Остатъкът се разделя чрез филтруване върху тигел на Gosch със стъклена вълна, промива се, изсушава се, претегля се и се изгаря в затворена печка при температура 550°С за 3 h. Загубата на тегло от изпепелената маса се определя количествено по гравиметричен метод и се изчислява като процент сурови фибри в пробата.

Токсини: Сапонини - метод HPLC (Hilmer Sorensen, KVL 1991, модифициран от DC):

Методът се основава на киселинна хидролиза на цвекловите сапонини. Освободената олеанова киселина се екстрахира с дихлорометан. След изпаряване на водата от пробата остатъкът се разтваря в метанол. Олеановата киселина се изпитва чрез HPLC в обратна фаза с ацетонитрил/вода като елуент и се определя при 210 nm в UV-детектор.

Захарно съдържимо на цвекловия екстракт Поляризация (Pol) (ICUMSA, Sugar Analysis 1979, Proc. 1990).

Цвекловият екстракт, осветлен с алуминиев сулфат, се определя с алуминиев сулфат върху поляриметьр тип PROPOL, който се основава на определяне на степента на оптично въртене. Оптичното въртене се измерва при 546 nm в 70 mm дълга епруветка и се превръща в °Z (Pol %) или g/100 g корен.

Аминен азот в цвекловия екстракт - SMAIIC Analyzer (ICUMSA, Sugar Analysis 1979, модифициран): Цвекловият екстракт, осветлен с алуминиев сулфат, се определя на колориметър при 570 nm, след цветна реакция с нинхидрин.

Калий и натрий в цвекловия екстракт - SMAIIC Analyzer (Technicon, Tech. Publ. ТНО-0160-Ю):

Цвекловият екстракт, осветлен c алуминиев сулфат, се определя на Flame Phonometer IV, където интензивността на светлинните енергии, емитирани от калий и натрий в пламъка, се измерва при съответно 589 nm и 768 nm. Пробата се разрежда с литиев сулфат, където литият се използва като вътрешен стандарт за балансиране на сигнала от пламъковия фотометър.

Инертна захар в цвекловия екстракт - SMAIIC Analyzer (Technicon, Tech. Publ. THO-0160-10): Цвекловият екстракт, осветлен c алуминиев сулфат, се определя на колориметър при 560 nm след реакция с реагента купросулфат неокуприон хидрохлорид.

Цвекловият екстракт, осветлен с алуминиев сулфат, се определя на колориметър при 560 nm след реакция с реагента купросулфат неокуприон хидрохлорид.

Глифозат устойчиви растения на захарно цвекло, генетично трансформирани съгласно технологията, описана в ЕР 0 218 571 за устойчивост спрямо глифозатен хербицид, се култивират на 6 различни места (Италия, Испания, Белгия, Дания, Франция, Англия). 5

Типът на култивираните сортове е в зависимост от местните условия. Материалът варира в много особености, една от които е захарното съдържимо, измерено чрез поляризация (Pol). Захарното цвекло може да бъде разделено на подгрупи: Е-тип, 10 N-тип и Z-тип. Е-тип е с ниско Pol, Z-тип е с високо Pol и N-тип е между Е и Z. Сортовете, култивирани в Западна Европа, могат да бъдат охарактеризирани като E-N, N или N-Z типове. Материалът, използван в тази група, спада към N групата. 15

Захарното цвекло се засажда съгласно местната агрономична практика, с ръчно разреждане за осигуряване на нормална стойка на растението. Използва се поне едно повторение за тест.

Участъците се поддържат по същество сво- 20 бодни на плевели чрез прилагане на:

- глифозатен хербицид в изпитваните участъци

- стандартни хербицидни третирания, специално избрани за цвекло (съобразно местоположението) в контролните участъци; освен в Дания, 25 Италия, където друг хербицид освен глифозата не се счита за необходим за поддържане на свободни от плевели условия

- преди поникване2,5 1/ha

- 2-4 листен стадий на цвеклото 21/ha

- 6-8 листен стадий на цвеклото 21/ha

- 12-14 листен стадий (затваряне на листния покров) 21/ha Прилаганите хербицидни стойности са следните: 35

В Испания:

3. 55 kg/ha Goltrix WG (metamitron) преди поникване

В Белгия:

21/ ha Gramoxone (Paraquat 200)

1/ ha Pyramin FL (Chloridazone 430)

0.5 1/ ha Betanal (Phenmediphame 150)

0.5 1/ ha Goltrix (Metamitron 70% WP) 0.51/ ha Tramat (Ethofumesate 200) 0.751/ ha Goltrix 0.751/ ha Vegelux (Mineral oil 40)

0.75 1/ha Tramat

0.751/ha Goltrix

0.751/ha Vegelux

0.171/ ha Fusilade

0.75 1/ha Betanal

0.75 1/ ha Tramat

0.751/ha Betanal

0.751/ha Goltrix

0.751/ha Vegelux

Във Франция:

0.5 1/ ha Goltrix WP (Metamitron)

0.751/ ha Goltrix WP 0.75 1/ha Betanal (Phenmediphame 150) 0.751/ha Tramat (Ethofumesate 200) преди засаждане седмица след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмица след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане седмици след засаждане

В Англия:

1.01/ ha Laser (cycloxydim) 5 седмици след засаждане

Резултатите от анализа са събрани и средните стойности са представени на таблицата подолу, като всички държави, зачитащи еквивалентни тегла в изчисляването на средните стойности.

Част па растението	Анализирана единица	Trt/Unt	Захарно цвекло
цв. маса	сухо вещ. (DM)	Trt	21. 309
	g/100 g корен	Unt	20.444
корен	инвертна захар	Trt	1.011
	mmol/ 100 g корени	• Unt	1. 755
	калий	Trt	5. 162
	mmol/100 g корени	Unt	5. 286

	NH2N mmol/100g корени	Trt	2.470
Unt	2.878
	натрий	Trt	1.118
	mmol/100 g корени	Unt	1.769
	Pol	Trt	15.610
	g/100 g корени	Unt	14.478
връхна част	сухо вещество	Trt	14.724
	g/100g Връх	Unt	13.996

Trt: напръсквани c глифозатен хербицид

Unt: ненапръскани с глифозатен хербицид DM: сухо вещество

Данните показват, че захарното цвекло, третирано с глифозатен хербицид, има значително по-високо захарно съдържимо с понижено съдържание на натрий, калий, аминен азот и инвертна захар в корена. Сухото вещество на корена и връхната част също е повишено. По-подробни данни предполагат, че листата на третирани с глифозат растения захарно цвекло показват по-високо фиброзно съдържимо.

Свързвайки резултатите от този пример с резултатите от предишните примери, става ясно, че повишаването на добива, установено по-рано в тегло за хектар, също се отразява като повишаване на сухото вещество, фиброзна материя и захарно съдържимо в събрания материал.

Пример 5. Растения захарно цвекло и фуражно цвекло, генетично модифицирани съгласно технологията, описана в ЕР 0 218 571 с цел устойчивост към глифозат, се засаждат на различни места, съобразно агрономичната практика, в интервали от 4,5 cm в лехата и се придържат ръчно за осигуряване на нормална стойка на растението, съобразно предвидения дизайн на блока; размер на участъка: 2,7 х 7 т; 6 реда за участък с разстояние между тях от 0,45 т. За всеки тест се използват четири повторения.

Изпитателните участъци се поддържат по същество чисти от плевели чрез стандартно прилагане на хербицид преди поникване върху цялата площ, и след това - чрез ръчно оплевяване, а като подходящата обработка след поникването с глифозат се третира, както е описано по-долу.

Прилагат се следните третирания:

Само ръчно плевене х 720 g a.e./ha от глифозатната форма х 1080 g a.e./ha от глифозатната форма х 1440 g a.e./ha от глифозатната форма х 2160 g a.e./ha от глифозатната форма

Ако бъдат проведени три последователни приложения на глифозатния хербицид, първото се осъществява на стадий 2-4 листа от културните растения; второто се осъществява на стадий 6-8 листа; а третото - в стадий 10-12 листа на културните растения, но преди завършване на листното покритие.

Ако бъдат проведени две последователни приложения на глифазатен хербицид, тогава първото се осъществява на стадий 2-4 листа, а второто на стадий 10-12 листа от развитието на културните растения.

Глифозат хербицидната формулировка включва 360 g глифозат а.е./1 като изопропиламониева сол, и 180 g/Ι повърхностно активно вещество, съставено от триметил етоксиполиоксипропил (8) амониев хлорид и етоксилиран (20) сорбитанов естер (80:20). Глифозатната формулировка се прилага във воден обем от 2001/ha при налягане 2 bar.

Теглото на пресни корени се измерва при събирането на урожая. Теглото на пресните корени от отделни ръчно оплевявани участъци се приема за 100% добив и измерените тегла на пресните корени след обработката с глифозат се отнасят към резултатите от ръчно оплевяваните участъци.

Таблица V, % добив (тегло на пресни корени)

	Захарно цвекло	фуражно цвекло
ръчно оплеВявани	100%	100%
3 х 720 g а.е.	101	105
3 х 1080 g а.е.	98	106
3 х 1140 g а.е.	115	108
2 х 2160 g а.е.	107	102

Пример 6.

За този полски опит зимни растения рапица със съществуващо генетично ниво, модифицирано за проява на устойчивост спрямо глифозатен хербицид (съгласно комбинираните техники на EPSPS експресия и оксидоредуктазна експресия), се засаждат в средата на септември съгласно агрономичните изисквания при 4 kg семена/ha, съответстващо на приблизително 100 растения за т² (нормална стойка на растението), в съответствие с дизайна на блока; размер на участъка: 3 х 7 ш, 0,14 m интервал между редовете; 4 повторения за опит.

Участъците се поддържат по същество чис15 ти на плевели: по стандартни хербицидни приложения преди поникване върху цялата нива, т.е. 1,51 Butisan (metazachlor) един ден след сеитбата; и с глифозатно третиране, прилагано както следва.

Глифозатните третирания се прилагат през есента в растежен етап на растението В4-В5; използва се същата формулировка, както в пример 1.

Урожаят се събира рано през август и добивът се оценява и изразява с ton/ha (при 9% влажност). Таблица VI показва измерения добив в % от добива на стандартен участък.

Таблица VI ДобиВ

Стандарт	100
1080 g a.e./ha	104.5

Пример 7. Този полски опит се провежда аналогично на опита от предишния пример, с изключение на това, че е показано пролетно засаждане на рапица (средата на април). Такива растения с известно генетично ниво се модифицират с оглед устойчивост към глифозат с техники, отбелязани в пример 6.

Участъците се поддържат чисти от плевели чрез прилагане на 1,5 1/ha Butisan върху целия участък, ръчно плевене за стандартния участък 35 и хербицид глифозат за останалите участъци. Същата глифозатна формулировка се прилага приблизително 1 месец след засаждането, т.е. в стадий на растеж ВЗ-В4. Събирането на урожая става в средата на август.

Таблица VII по-долу показва данните за добива (измерени и изразени както в пример 6) в % добив от стандартните участъци.

Таблица VII. Добив

Стандарт	100
720 g a.e./ha	120
1080 g a.e./ha	112

Пример 8. Следващи полски опити са проведени в Италия за изследване повишаването на добива от глифозат устойчиви житни растения след прилагане на глифозатен хербицид. Известни житни растения, генетично модифицирани за глифозатна устойчивост съгласно комбинираните техники на EPSPS и глифозат оксидоредуктазна експресия, се засаждат и отглеждат съгласно агрономичните изисквания при приблизително 62000 повторения, и след това ръчно се разреждат за осигуряване на нормална изправена стойка и еднакъв брой растения във всички участъци. Цялото поле съдържа стандартни участъци и опитните участъци се обработват преди поникването с хербицид (Lasso Micromix) в стойности 6 Ι/ha (т.е. 2016 g alachlor и 864 g terbuthylazine). Стандартните участъци се поддържат чисти от плевели чрез 5 ръчно плевене, ако е необходимо, а опитните участъци - чрез обработване със същата глифозатна формулировка, както в пример 1, при различни стойности и стадии на развитие на растенията. Събран е добивът само на два централни участъка със сред10 на дължина от 7 т. Добивът се измерва в t/ha, изразено при 15% влажност, и е изразен в таблицата като процент от стандарта (STD).

Таблица XIII а % Добив/ обработване с глифозат β стадии 3- 4 листа

	Трансформационно събитие 1 .....	Трансформационно ; събитие 2 !
STD 720 g a.e./lia глифозат	100 106	100 > 103 j
1800 g a.e./ha	107	107 , i

Таблица XIII Ь.

Добив/ обработване с глифозат в стадий 5-6 листа

μ ........ _ . . . ... .	Tpa 1 j сформ auuoi ι н o събитие 1	T раи сформ auuoi in o ; i събитие 2 ‘
STD	100	100
720 g a.e./ha глифозат	114	105 >
1080 g a.e./ha	109	108 :
144U g.a.e./ha	109	105
1800 g a.e./ha	111	102

Пример 9. Следващи полски опити се про- 40 бива. Трансгенни културни растения получават веждат съгласно същия протокол, както в пример три глифозат хербицидни третирания от 720 g a.e./ha

1, за оценка на ефекта от различни формулиров- и 1080 g a.e./ha, съответно.

ки на глифозатния хербицид за повишение на доТаблнцаIX .

% добив - тегло на пресни корени

	3 х 720 g a.e./ha	3 x 1080 g a.ejia
Roundup^t:	100	100
Гранулирана форма	Ίθϊ.4	100.2
Течна форма	104.2	102

Roundup*

- глифозат изопропиламониева сол при 360 ga.e./ha

- етоксилирано мастно аминно повърхностно активно вещество при 180 g/1

Твърда формулировка:

- глифозат натрий при 430 g а.е./kg

- триметил етоксиполиоксипропил (8) амониев хлорид при 160 g/kg

- амониев сулфат при 330 g/kg

Течна формулировка: същата както в при10 мер 1

Течна форма:

Този пример показва тенденция по посока на подобрена изява на формулировката, съдър5 жаща благоприятно за околната среда повърхностно активно вещество, както е дефинирано.

Пример 10. Работи се, както в пример 7 (пролетно засаждане на рапица) с оглед оценка на ефекта на различните формулировки глифозатен хербицид. Опитните участъци в този експеримент са с размер 1,5 х 10 т.

Таблица X: Добив В ton/ha hdu 9% Влажност

		% Добив
1/ha	1	2	3	4
Roundup®	100	100	100	100
Гранулиран а форма	101	103	109
Течна форма	103	101	110	108

Добивът е получен, като обработките с Roundup* се приемат за 100%.

Този пример по-нататък потвърждава предимствата на използваната в пример 7 формулировка.

Claims

Патентни претенции

1. Приложение на глифозат или негови производни за повишаване на добива от културни растения, характеризиращо се с това, че растенията са подбрани от глифозат устойчиви захарно цвекло, фуражно цвекло, житни растения, рапица и памук, и че глифозатът се прилага при обичайна летална доза.
2. Приложение на глифозат или негови производни съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че се прилага в обичайна летална доза от 0,2 до 6,0 kg киселинен еквивалент/ha.
3. Приложение на глифозат или негови производни съгласно претенциите 1 или 2, характеризиращо се с това, че се прилага еднократно или в последователни третирания.
4. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите от 1 до 3, характеризиращо се с това, че глифозатът или неговите производни са под формата на глифозатна сол, която е моноизопропиламониева сол, амониева сол или натриева сол, или техни смеси.
5. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите от 1 до 4, характеризиращо се с това, че се прилага във формулировка с адювант, подбран от амини, като етоксилирани алкил амини, по-специално талови амини, кокосови амини, повърхностно активни вещества, амино оксиди като повърхностно активни вещества; четвъртични амониеви соли, като етоксилирани и/или пропоксилирани кватернерни амониеви соли като повърхностно активни вещества; алкилпропилгликозид или алкилгликозид, глюкозо- и захарозни естери, с етоксилирано полипропоксилирано амониево повърхностно активно вещество.
6. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите от 1 до 5 за повишаване добива на цвекло, рапица, памук или житни културни растения, създадени така, че да са устойчиви към глифозатен хербицид.
7. Приложение на глифозат или негови производни съгласно претенция 6 за повишаване добива и/или качеството на захарно или фуражно цвекло.
8. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите от 1 до 6, като културните растения съдържат ген, който кодира EPSPS полипептид.
9. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите от 1 до 6, като културните растения съдържат ген, който кодира ензима глифозат оксидоредуктаза.
10. Приложение на глифозат или негови производни съгласно която и да е от претенциите 5 от 1 до 6, като културните растения съдържат ген, който кодира EPSPS ензими от клас II.