CN110418649A - 全细胞疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及表达聚糖和糖缀合物抗原的减毒细菌细胞及其在制造有效预防或治疗非人类物种中的细菌感染的全细胞疫苗中的用途。

Description

全细胞疫苗
发明领域
本公开涉及表达聚糖和糖缀合物抗原的减毒细菌细胞及其在制造有效引发非人类动物物种中的免疫应答以及预防或治疗细菌感染的全细胞疫苗或免疫原性组合物中的用途。
发明背景
由于动物产品需求的增长，动物健康面临着新的和额外的挑战。尽管降低了动物生长和生产的成本，但数百只动物(诸如猪、牛或鸡)的限制和收容显著增加了疾病的发生率和传播。动物疾病不仅与经济风险(诸如生产力损失、市场破坏或农民的生计风险)相关，还具有人类健康风险的影响。维持健康的牲畜对于经济和社会的繁荣至关重要，然而，疫苗在兽医学中的应用和发展尚不成熟，主要是因为必须降低动物接种疫苗的成本并且因为我们对导致动物疾病的病原体的认识并不像对感染人类的那些病原体的认识一样先进。例如，糖缀合物疫苗在人类中广泛使用；然而，由于它们开发成本仍然很高，兽医应用受到限制。
致病性细菌是影响动物的传染病的主要原因。在农业上重要的动物物种中控制细菌感染是有问题的，因为动物彼此非常接近，这可以促进整个畜群中感染的散播。当较大比例的动物对特定感染因子免疫时，畜群免疫力存在，但是一旦大量非免疫动物存在于畜群中时畜群免疫力可能会被破坏。为了实现畜群免疫力，有必要持续监测动物的畜群易感性成员以控制传播。细菌传播的控制是通过许多措施来实施的，这些措施是劳动密集的以及实施起来很昂贵，并且包括隔离检疫；消除动物感染库；环境控制[即维持清洁水和食物供应，卫生处理排泄物，空气卫生]；使用抗生素；使用益生菌来增强非致病性细菌的生长，和抑制致病性细菌的生长以及主动免疫以增加畜群的抗性成员的数量。
通常对细菌感染具有抗性的畜群的产生需要鉴定形成诱导免疫力的疫苗基础的抗原。
此外，动物物种携带也会感染人类的细菌病原体。动物传染病是一种从非人类动物可传播给人类的传染病。由革兰氏阴性细菌导致的动物传染病的细菌感染的实例包括：从受细菌污染的奶和肉传播到人类的由布鲁氏菌(Brucella spp)导致的布鲁氏菌病；由弯曲杆菌(Campylobacter spp)导致的弯曲杆菌病；由霍乱弧菌导致的霍乱；由来自受细菌污染的未煮过的肉和未经高温消毒的奶的耶尔森氏菌(Yersina spp)导致的耶尔森氏菌病；以及由来自受细菌污染的肉、特别是猪肉和蛋的沙门氏菌(Salmonella spp)导致的沙门氏菌病。有由各种细菌引起的各种各样的疾病(例如鸡的大肠杆菌病、奶牛的乳腺炎或猪的呼吸系统疾病)可以影响牲畜。一旦感染发生，治疗选择是有限的，通常依赖于昂贵的抗生素，并且更重要的是它们的重复使用促成抗性的发展。因此，保护性疫苗接种是优选的方法，通常预防并有助于根除非人类动物疾病。
成功疫苗的定义性特征是能够以最小的副作用引起持久的保护性免疫应答。大多数兽用疫苗都是基于活的减毒细菌菌株或不含抗原活性组分的产品，诸如灭活的全细胞疫苗或仅含有病原体的抗原性部分的亚单位疫苗(基于蛋白质或碳水化合物亚基、重组蛋白、肽或基于核酸的产品)。
包含碳水化合物特异性抗原的糖缀合物疫苗可以提供针对多种致病性细菌的保护。然而，糖缀合物疫苗通常遭受低免疫原性并且不能产生足够的记忆B淋巴细胞细胞应答。多糖抗原与蛋白质载体的偶联产生的糖缀合物显著增加免疫原性。目前许可的人糖缀合物疫苗包括针对流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisserria meningitidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的那些糖缀合物疫苗，其包含与载体蛋白化学结合的细菌多糖。流感嗜血杆菌B型(Hib)疫苗或(针对由肺炎链球菌引起的疾病有保护作用的13价基于荚膜的糖缀合物疫苗)使用载体蛋白iCRM197(从白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)中分离出来的无毒形式的白喉毒素)。
这些糖缀合物疫苗是有效的，但它们的生产需要从天然病原体中纯化多糖聚糖并且将多糖与合适的蛋白质载体化学偶联，这是一种高成本，低效和耗时的过程。从细菌来源获得或通过化学合成获得聚糖。载体蛋白通常是细菌毒素如破伤风和白喉(最常见的是重组形式，CRM197)，尽管已经使用了其它载体。例如，钥孔血蓝蛋白(KLH)已经经常被用于动物疫苗研究。聚糖与载体蛋白的偶联需要聚糖和/或载体的化学活化，这通常需要几个步骤并产生异源性产物。
包含能够将抗原性多糖聚糖转移到蛋白质载体上的寡糖转移酶的修饰细菌菌株的使用为糖缀合物的生产提供了经济的可替代方法，并且是本领域已知的。在WO2009/104074或WO2014/114926中公开了在细菌表达系统中用于人用的糖缀合物疫苗的产生。在细菌表达系统中产生糖缀合物需要三个基因的共表达：受体蛋白质、多糖生物合成基因座以及用于偶联反应的寡糖转移酶。然而，仅在一个宿主中共表达通常导致次优的产量，这使其商业化不可行。
本公开使用聚糖偶联技术，以通过引入编码抗原性多糖、寡糖转移酶和受体蛋白的转录盒作为质粒的一部分或直接插入基因组，来在活的减毒全细胞疫苗中表达一种或多种致病性细菌的抗原性多糖，从而增加它们对多种病原体的保护谱。此外，还公开了具有降低的翻译效率的重组表达系统，其包含寡糖转移酶、毒性载体蛋白或编码聚糖生物合成所需蛋白质的基因。通过提供核糖体结合位点[RBS]与翻译起始密码子之间的距离增加的载体来降低翻译效率，从而使细菌生长到高密度并避免在对细菌细胞有毒的浓度下表达重组蛋白的有害影响。
发明内容
根据本发明的一方面，提供了致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了包含生物合成基因座的转录盒，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源性聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，其中所述异源聚糖抗原在细菌细胞表面处被表达。
根据本发明的一方面，提供了致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了一种或多种转录盒，所述一种或多种转录盒包含：
核酸分子，其编码寡糖转移酶多肽，
核酸分子，其编码作为所述寡糖转移酶的底物的包含至少一个糖基化位点的一种或多种载体多肽，和
核酸分子，其编码生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，
特征在于所述致病性细菌细胞是减毒的并且所述异源聚糖抗原在所述细菌细胞表面处被表达，并且其中所述异源聚糖还被偶联至所述载体多肽以提供保留在所述减毒的致病性细菌细胞内的糖缀合物。
在本发明另一优选的实施方案中，所述细菌细胞包含至少一个编码膜多肽或膜相关多肽的失活的或经突变的基因，其中活的致病性细菌细胞是减毒的并且所述减毒是所述基因失活或突变的结果。
在本发明优选的实施方案中，至少2、3或更多个基因是失活的或经突变的。
在本发明优选的实施方案中，所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。
在本发明优选的实施方案中，编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列，；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
在本发明优选的实施方案中，编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
在本发明优选的实施方案中，编码所述多糖修饰酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
ii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码多糖修饰酶。
当两个互补核酸分子彼此经历一定量的氢键结合时，核酸分子的杂交发生。杂交的严格性可根据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质及所用的核酸分子的组成和长度变化。关于获得特定程度的严格性所需的杂交条件计算讨论于Sambrook等人,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY,2001)；和Tijssen,生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针的杂交，第2章，第一部分，(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I,Chapter 2)(Elsevier,纽约,1993)中。Tm是50％的给定核酸分子的链与其互补链杂交的温度。以下是一套示例性的杂交条件并且不是限制性的：
极高严格性(允许共有至少90％同一性的序列杂交)
杂交：5×SSC，65℃持续16小时
洗涤两次：2×SSC，室温(RT)各自持续15分钟
洗涤两次：0.5×SSC，65℃各自持续20分钟
高严格性(允许共有至少80％同一性的序列杂交)
杂交:5×-6×SSC，65℃-70℃持续16-20小时
洗涤两次：2×SSC，RT各自持续5-20分钟
洗涤两次：1×SSC，55℃-70℃各自持续30分钟
低严格性(允许共有至少50％同一性的序列杂交)
杂交:6×SSC，RT至55℃持续16-20小时
洗涤至少两次：2×-3×SSC，RT至55℃各自持续20-30分钟。
在本发明优选的实施方案中，序列与SEQ ID NO:1、2或3所示的全长序列共有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在本发明优选的实施方案中，编码分选酶和/或所述多糖修饰酶的所述基因通过编码所述分选酶和/或多糖修饰酶的核苷酸序列的全部或部分的缺失，或者控制所述分选酶和/或多糖修饰酶表达的调节区的全部或部分的缺失而被修饰。
在本公开的上下文中，“减毒的”意指在已经施用包含减毒的细菌细胞的组合物的对象动物中，其毒力已经降低或减弱但仍能够驱使免疫应答(例如体液或细胞应答)的经修饰的细菌细胞。根据本发明的减毒的细菌细胞可以是灭活的。
转化根据本发明的减毒的细菌细胞以提供驱使对多种外源抗原的免疫应答的细胞。动物对象产生针对减毒的细菌细胞天然有的抗原的免疫应答。这由对在细胞表面处表达的外源异源聚糖的应答补充。动物的免疫应答包括产生找出并破坏表达每种聚糖抗原的细胞的调理素抗体。经工程化的细菌细胞的破坏导致在细菌细胞中表达和保留的糖缀合物(例如在周质空间中保留的糖缀合物)的释放。这用作增强剂以进一步诱导涉及糖缀合物的第二免疫应答，从而提供持续的抗原暴露于动物对象。来源于多种细菌病原体的抗原的使用允许针对超过一种细菌病原体的保护。
在本发明另一可替代的优选实施方案中，所述减毒的致病性细菌细胞是动物传染病的细菌物种。
动物物种携带有还感染人类的细菌病原体。动物传染病是从非人类动物可传播到人类的传染病。由革兰氏阴性细菌导致的动物传染病的细菌感染的实例包括：从受细菌污染的奶和肉传播到人类的由布鲁氏菌导致的布鲁氏菌病；由弯曲杆菌导致的弯曲杆菌病；由霍乱弧菌导致的霍乱；由来自受细菌污染的未煮过的肉和未经高温消毒的奶的耶尔森氏菌导致的耶尔森氏菌病；以及由来自受细菌污染的肉、特别是猪肉和蛋的沙门氏菌导致的沙门氏菌病。
在本发明优选的实施方案中，所述寡糖转移酶是弯曲杆菌属寡糖转移酶。
在本发明优选的实施方案中，所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)寡糖转移酶。
在本发明可替代的实施方案中，所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是生痰弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)寡糖转移酶。
在本发明优选的实施方案中，所述寡糖转移酶由包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者由包含与SEQ ID NO:4所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
在本发明优选的实施方案中，所述寡糖转移酶由包含如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者与由包含SEQ ID NO:5或6所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
在本发明优选的实施方案中，所述寡糖转移酶由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQ ID NO:7所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。
在本发明优选的实施方案中，所述寡糖转移酶由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQ ID NO:8所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。
在优选的实施方案中，寡糖转移酶与如SEQ ID NO:4、5、6、7或8所示的全长核苷酸序列或氨基酸序列具有至少55％的同一性，更优选至少60％的同一性，甚至更优选至少65％的同一性，更优选至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％或90％的同一性，最优选至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本发明优选的实施方案中，所述载体多肽包含氨基酸基序：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在本发明可替代的实施方案中，所述受体多肽包括氨基酸基序：D/E-X-N-X-S/T，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在本发明可替代的优选实施方案中，所述受体多肽包括选自以下的糖基化基序：DQNAT(SEQ ID NO 44)、DNNNT(SEQ ID NO 45)、DNNNS(SEQ ID NO 46)、DQNRT(SEQ ID NO47)、ENNFT(SEQ ID NO 48)、DSNST(SEQ ID NO 49)、DQNIS(SEQ ID NO 50)、DQNVS(SEQ IDNO 51)、DNNVS(SEQ ID NO 52)、DYNVS(SEQ ID NO 53)、DFNVS(SEQ ID NO 54)、DFNAS(SEQID NO 55)、DFNSS(SEQ ID NO 56)、DVNAT(SEQ ID NO 57)、DFNVT(SEQ ID NO 58)、DVNAS(SEQ ID NO 59)、DVNVT(SEQ ID NO 60)、EVNAT(SEQ ID NO 61)。
在本发明优选的实施方案中，所述载体多肽是由所述减毒的致病性细菌细胞的基因组编码的内源性载体多肽。
在本发明可替代的实施方案中，所述载体多肽是由不是由所述减毒的致病性细菌细胞表达的核酸分子编码的异源性载体多肽。
在本发明优选的实施方案中，所述异源性载体多肽由从致病性细菌物种分离的核酸分子编码。
在本发明优选的实施方案中，所述异源性载体多肽由如SEQ ID NO:9、10或11所示的核苷酸序列编码。
在本发明优选的实施方案中，编码包含异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的生物合成基因座的所述核酸分子，编码荚膜多糖。
在本发明优选的实施方案中，所述多糖是O-抗原。
包含重复聚糖聚合物的O-抗原是发现与革兰氏阴性细菌的外膜相关的脂多糖(LPS)的多糖组分。O-抗原通常在动物中引发强烈的免疫应答。O链的组成从细菌菌株到细菌菌株不同，并且已知有超过160种不同的O-抗原结构由不同的大肠杆菌菌株产生。O-抗原被暴露在细菌细胞的外表面上，并用作宿主抗体识别的靶标。多糖合成基因座的实例是本领域公知的，并且可以在以下文献中找到：“Genetic analysis of the capsularbiosynthetic locus from all 90pneumococcal serotypes”,Bentley SD,Aanensen DM,Mavroidi A,Saunders D,Rabbinowitsch E,Collins M,Donohoe K,Harris D,Murphy L,Quail MA,Samuel G,Skovsted IC,Kaltoft MS,Barrell B,Reeves PR,Parkhill J,Spratt BG.PLoS Genet.2006年3月:2(3):e31；“Gene content and diversity of theloci encoding biosynthesis of capsular polysaccharides of the 15serovarreference strains of Haemophilus parasuis.”Howell KJ,Weinert LA,Luan SL,Peters SE,Chaudhuri RR,Harris D,Angen O,Aragon V,Parkhill J,Langford PR,Rycroft AN,Wren BW,Tucker AW,Maskell DJ；BRaDP1T Consortium.J Bacteriol.2013年9月:195(18):4264-73.doi:10.1128/JB.00471-13.Epub 2013年7月19日；“Exploitationof bacterial N-linked glycosylation to develop a novel recombinantglycoconjugate vaccine against Francisella tularensis”.Cuccui J,Thomas RM,Moule MG,D'Elia RV,Laws TR,Mills DC,Williamson D,Atkins TP,Prior JL,WrenBW.Open Biol.2013年5月22日；3(5):130002；和“Characterization of thestructurally diverse N-linked glycans of Campylobacter species”.Jervis AJ,Butler JA,Lawson AJ,Langdon R,Wren BW,Linton D.J Bacteriol 2012年5月：194(9):2355-62。
在本发明可替代的优选实施方案中，所述多糖是七糖。
在本发明优选的实施方案中，所述生物合成基因座包含含有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的核酸分子。
在本发明优选的实施方案中，编码所述寡糖转移酶的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
在本发明另一优选的实施方案中，编码所述载体多肽的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
在本发明另一优选的实施方案中，编码所述生物合成基因座的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
使用如本文所公开的转录盒对根据本发明的减毒致病性细菌细胞进行的遗传转化可以是经由使用游离型载体进行的转化，所述游离型载体与减毒致病性细菌细胞的基因组分别复制，以提供一个或多个基因的多个拷贝。可替代地，与减毒致病性细菌细胞的基因组重组并与所述减毒致病性细菌细胞的基因组一起复制的整合载体(例如转座子)。在本发明优选的实施方案中，编码寡糖转移酶多肽、载体多肽和包含异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的生物合成基因座的所述核酸分子各自整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。在本发明优选的实施方案中，所述转录盒包含与编码所述寡糖转移酶多肽的至少核酸分子可操作地连接的启动子。
在本发明优选的实施方案中，所述转录盒包含与编码所述所述载体多肽的至少核酸分子可操作地连接的启动子
在本发明优选的实施方案中，异源聚糖抗原合成所需的所述一种或多种多肽与一种或多种启动子可操作地连接，以提供编码所示多肽的每个或全部核酸分子的表达。
在本发明优选的实施方案中，所述启动子还与核糖体结合位点可操作地连接，其中在所述核糖体结合位点的3’主要端与编码所述载体多肽和/或异源聚糖抗原和/或寡糖转移酶多肽的5’初始的起始密码子之间提供了核苷酸间隔序列，其中当与不包含所述核苷酸间隔序列的编码所述重组多肽的对照核酸分子相比时，编码所述载体多肽和/或异源聚糖抗原和/或寡糖转移酶多肽的核酸分子的翻译减少。
原核核酸分子中的核糖体结合位点被称为Shine Dalgarno[SD]序列，并且是通常位于核酸分子的初始密码子上游5-13个核苷酸的共有序列。共有的RBS序列由富含嘌呤的区域组成，随后为富含A和T的翻译间隔区域，例如共有AGGAGG或AGGAGGU。初始密码子通常是AUG，但翻译也可以在诸如GUG、UUG、AUU或CUG的密码子处起始。在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是至少13个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是13至40个核苷酸；优选地，核苷酸间隔序列的长度是13至20个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是16个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是至少40个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度40至75个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸间隔序列的长度是40、45、50、55、60、65、70或75个核苷酸。
在本发明优选的实施方案中，所述启动子是赋予组成型表达的组成型启动子。
在本发明优选的实施方案中，所述启动子是可调节的，并且包括赋予可调节表达的诱导型或阻遏型核苷酸元件。
在本发明优选的实施方案中，所述启动子是可调节的启动子并且包括应答于诱导物而赋予经调节的表达的诱导型核苷酸元件。
在本发明可替代的实施方案中，所述可调节的启动子包括应答于阻遏物而赋予经调节的表达的阻遏型核苷酸元件。
利用基因表达的诱导物和阻遏物的细菌表达系统是本领域中公知的，并且包括已完善建立的增强基因表达的诱导或阻遏的修饰。例如，lacIq携带有导致细胞内转录增加和较高水平的Lac阻遏物的lacI基因的启动子区域中的突变。此外，Ptac是一种强杂合启动子，由trp启动子的-35区和lacUV5启动子/操纵子的-10区组成，并且具有强诱导性。
在本发明优选的实施方案中，当与编码所述寡糖转移酶和/或所述载体多肽和/或生物合成基因座但不包含所述间隔核苷酸序列的对照核酸分子相比时，所述寡糖转移酶和/或所述载体多肽和/或生物合成基因座的核酸分子翻译减少降低至少10％。
在本发明优选的实施方案中，当与编码所述重组多肽但不包含所述间隔核苷酸序列的对照核酸相比时，核酸翻译减少是15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在本发明优选的实施方案中，所述生物合成基因座是Pgl基因座。
优选地，所述Pgl基因座包含编码选自以下的所述一种或多种多肽的基因：PglG、PglF、PglE、Cj1122c、PglD、PglC、PglA、PglJ、PglI、PglH、PglK。
在另一优选的实施方案中，编码异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的所述核酸分子包含如SEQ ID NO 12所示的序列，其中所述SEQ ID NO:12不包括功能型的PglB，例如SEQ ID NO 4或其多态序列变体。
在本发明可替代的实施方案中，所述减毒的致病性细菌细胞是灭活的。
根据本发明的另一方面，提供了包含根据本发明的减毒的或灭活的致病性细菌细胞的疫苗或免疫原性组合物。
在本发明另一优选的实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包括佐剂和/或载体。
佐剂(免疫增强剂或免疫调节剂)数年来已被用于提高针对疫苗抗原的免疫应答。将佐剂掺入疫苗制剂目标在于增强、加速和延长针对疫苗抗原的特异性免疫应答。佐剂的优势包括增强较弱抗原的免疫原性、减少成功免疫所需的抗原量、减少增强免疫的频率。可选择地，佐剂还可以被用于优化所期望的免疫应答，例如关于免疫球蛋白种类和细胞毒性或辅助T淋巴细胞应答。此外，某些佐剂可被用于促进粘膜表面处的抗体应答。
可根据它们的来源、作用机制和物理或化学性质对佐剂进行分类。最常所描述的佐剂类别种类是凝胶型、微生物、油-乳剂和基于乳化剂的、微粒、合成物和细胞因子。超过一种佐剂可存在于根据本发明的最终疫苗产品中。目前使用或开发的佐剂的来源和性质是高度多样的。例如，MDP来源于细菌细胞壁；皂苷类是植物来源的，鲨烯来源于鲨鱼肝脏和重组内源性免疫调节剂来源于重组细菌、酵母或哺乳动物细胞。
有若干种佐剂经批准用于兽用疫苗，诸如对于人类使用来说太具有反应性的矿物油乳剂。类似地，完全弗氏佐剂是已知的最有效的佐剂之一。
可通过任何常规途径(包括注射)施用本发明的疫苗组合物。施用可以是例如静脉内的、腹膜内的、肌内的、腔内的、皮下的或皮内的。本发明的疫苗组合物以有效量被施用。“有效量”是单独或与另外剂量一起产生所期望的应答的疫苗组合物的量。在治疗细菌疾病的情况下，所期望的应答是当被感染剂攻击时提供保护。
根据本发明的一方面，提供了根据本发明的疫苗组合物，其用于预防或治疗非人类动物对象的细菌感染中的用途。
在本发明优选的实施方案中，所述疫苗组合物预防或治疗所述非人类动物对象的两种不同的细菌感染。
在本发明另一优选的实施方案中，所述疫苗组合物预防或治疗所述非人类动物对象的三种不同的细菌感染。
在另一优选的实施方案中，所述细菌感染由选自以下的细菌物种引起：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、空肠弯曲菌弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲菌弯曲杆菌(Campylobacter coli)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronhiseptica)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelotrix rhusiopatie)和肾脏钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌感染是链球菌感染的结果。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌感染由大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和乳房链球菌引起并且所述细菌感染是乳腺炎。
在本发明可替代的实施方案中，所述细菌感染由胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪链球菌引起并且所述细菌感染是呼吸系统感染。
在本发明的另一实施方案中，所述细菌感染由大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌和产气荚膜梭菌导致。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌感染由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)导致。
在另一优选的实施方案中，所述非人动物是牲畜动物(例如牛、绵羊、山羊、猪、马、鹿、野猪)、和家禽(例如鸡)、鱼(例如鲑鱼)。
在另一优选的实施方案中，所述动物是伴侣动物，例如猫、狗、鹦鹉、兔、仓鼠和豚鼠。
根据本发明的另一方面，提供了免疫原性组合物，其用于在非人类动物物种中诱导免疫应答中的用途。
在本发明优选的实施方案中，所述免疫应答是诱导体液应答，特别是诱导调理素抗体应答。
在本发明可替代的实施方案中，所述免疫应答是细胞介导的免疫应答。
根据本发明的一方面，提供了细胞培养物，其包含根据本发明的减毒的致病性细菌细胞。
根据本发明的另一方面，提供了用于制造根据本发明的减毒的致病性细菌细胞的方法，其包括以下步骤：
i)提供根据本发明的细菌细胞培养物；
ii)提供细胞培养条件；和
iii)培养和任选地从细胞培养物中分离减毒的致病性细菌细胞。
根据本发明的另一方面，提供了细胞培养容器，其包含根据本发明的细菌细胞培养物。
在本发明优选的实施方案中，所述细胞培养容器是发酵罐。
根据本发明的方法中使用的细菌培养物以技术人员熟悉的方式生长或被培养，这取决于宿主生物体。通常，将细菌在包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以如酵母提取物的有机氮源形式)或盐(诸如硫酸铵)、微量元素(诸如铁、锰和镁的盐)，以及如果合适的话，还有维生素的液体培养基中在0℃至100℃(优选在10℃至60℃)的温度，同时在氧气中放气下生长。
可以将液体培养基的pH保持恒定(即在培养期间调节)或不恒定。可以将培养物分批、半分批或连续生长。营养素可以在发酵开始时提供，或者半连续或连续地进料。所产生的产物可以通过技术人员已知的方法(例如通过萃取、蒸馏、结晶，如果合适的话用盐沉淀和/或色谱法)从如上所述细菌中分离。在该方法中，将pH值有利地保持在pH4至12，优选在pH 6至9，特别优选在pH 7至8。
已知的培养方法的综述可以在教科书生物工艺技术1.生物工艺技术简介(Bioprocess technology 1.Introduction to Bioprocess technology)(GustavFischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen[生物反应器和外围设备(Bioreactors and peripheral equipment)](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中找到。
使用的培养基必须适当地满足所讨论的细菌菌株的要求。各种细菌的培养基的描述可以在美国细菌学学会(American Society for Bacteriology)(华盛顿,USA,1981)的教科书"普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)"中找到。
如上所述，可根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖，诸如单糖、二糖或多糖。碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以经由复杂的化合物(诸如糖蜜或糖精制的其他副产物)添加到培养基中。添加各种碳源的混合物也可能是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪诸如例如大豆油、向日葵油、花生油和/或椰子脂肪，脂肪酸诸如例如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸，醇和/或多元醇诸如例如甘油、甲醇和/或乙醇，和/或有机酸诸如例如乙酸和/或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的物质。氮源的实例包括呈液体或气体形式的氨或铵盐(诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐，尿素，氨基酸或复合氮源(诸如玉米浆、豆渣、大豆蛋白、酵母提取物，肉膏等)。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷和硫酸盐。
无机含硫化合物(诸如例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物)或其他有机硫化合物(诸如硫醇(mercaptans)和硫醇(thiols))可被用作生产含硫精细化学品、特别是甲硫氨酸的硫源。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可被用作磷源。
可以将螯合剂添加到培养基以使金属离子保持在溶液中。特别合适的螯合剂包括二羟基酚(诸如儿茶酚或原儿茶酸酯)和有机酸(诸如柠檬酸)。
根据本发明使用的用于培养细菌的发酵培养基通常还包含其他生长因子，诸如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常来源于复杂的培养基组分，诸如酵母提取物、糖蜜、玉米浆液等。此外，可以向培养基中加入适合的前体。培养基化合物的确切组成在很大程度上取决于特定的实验，并且针对每种具体情况单独决定。关于培养基优化的信息可以在教科书"实用的微生物学生理学，实用的方法(Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach)"(编辑P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL出版社(1997)第53-73页,ISBN 0 19 963577 3)中找到。生长培养基也可以从商业供应商获得，例如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。
通过加热(在1.5巴和121℃下20min)或通过过滤灭菌对所有培养基组分进行灭菌。可以将组分一起灭菌，或者如果需要，可以分别灭菌。所有培养基组分可以在培养开始时存在，或者根据需要连续或分批加入。
培养温度通常为15℃至45℃，优选的为25℃至40℃，并且可以保持恒定或可以在实验期间改变。培养基的pH应在5至8.5的范围内，优选约7.0。可以通过添加碱性化合物(诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水)或酸性化合物(诸如磷酸或硫酸)，在培养期间控制培养的pH。可以通过使用消泡剂(诸如例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制起泡。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入具有选择性作用的合适物质，例如抗生素。通过将氧气或含氧气体混合物(诸如例如环境空气)引入培养物来维持需氧条件。培养温度通常为20℃至45℃，并且优选为25℃至40℃。继续培养直至所期望的产物的形成达到最大值。这个目标通常在10到160小时内完成。
然后可以进一步处理发酵液。根据需要，生物质可以通过分离方法(诸如例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合)从发酵液中完全或部分地去除，或者完全留在所述液体培养基中。在其分离后处理生物质是有利的。
然而，发酵液也可以使用已知方法(诸如例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透或通过纳米过滤)在不分离细胞的情况下增稠或浓缩。最后，可以处理该浓缩的发酵液以获得其中存在的脂肪酸。根据本发明的一方面，提供了活的致病性细菌细胞，其包含编码膜多肽或膜相关多肽的至少一种失活的或经突变的基因，其中活的致病性细菌细胞是减毒的并且减毒是所述基因失活或突变的结果。
在本发明优选的实施方案中，所述减毒的细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。
在本发明可替代的优选实施方案中，所述减毒的细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
在本发明优选的实施方案中，所述减毒的细菌致病性革兰氏阴性细胞选自：埃希氏菌(例如大肠杆菌、大肠杆菌血清组078)、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌)、钩端螺旋体、弗朗西斯菌(例如土拉弗朗西斯菌)、志贺氏菌(例如弗氏志贺氏菌)、耶尔森氏菌(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌)、博德特氏菌(例如支气管炎博德特氏菌)和布鲁氏菌(例如流产布鲁氏菌)、短螺旋体(例如多毛短螺旋体(Brachyspira pinosicoli)、嗜血杆菌(例如副猪嗜血杆菌)。
在本发明可替代的优选实施方案中，所述细菌致病性革兰氏阳性细胞选自以下组：李斯特氏菌(例如单核细胞增多性李斯特氏菌)、丹毒丝菌(例如猪红斑丹毒丝菌(Erysipelotrix rhusiopathiae))和分枝杆菌(例如牛结核分枝杆菌)。
在本发明可替代的优选实施方案中，所述细菌细胞属于链球菌属。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌病原体选自：猪链球菌(Streptococcussuis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、海豚链球菌(Streptococcus innuae)、马链球菌(Streptococcus equi)、乳房链球菌(Streptococcus uberus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌细胞是猪链球菌。
在本发明优选的实施方案中，所述细菌细胞是猪肺炎支原体。
在本发明优选的实施方案中，所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。
在本发明优选的实施方案中，编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核酸分子；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列的核酸分子，其中所述序列由于(i)中所定义的核苷酸序列的遗传密码而是简并的；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交至以上与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。在本发明优选的实施方案中，编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的核酸分子；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列的核酸分子，其中所述序列由于(i)中所定义的核苷酸序列的遗传密码而是简并的；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交至与以上上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。在本发明优选的实施方案中，编码所述多糖修饰酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的核酸分子；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列的核酸分子，其中所述序列由于(i)中所定义的核苷酸序列的遗传密码而是简并的；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交至以上与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码多糖修饰酶。在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“含有”以及词语的变体，例如“包含(comprising/comprises)”意指“包括但不限于”，并且不旨在(和不排除)其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。“基本上由......组成”意指具有必要的整数，但包括不会对必要的整数的功能产生实质影响的整数。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数形式涵盖复数形式。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为考虑复数形式以及单数形式。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与它们不相容。
现在将仅通过实施例并参考以下附图来描述本发明的实施方案；
图1说明了诱导空肠弯曲杆菌pglB和CspglB2的表达后大肠杆菌CLM24的生长比较。建立生长曲线以监测诱导CjpglB或CspglB2后大肠杆菌细胞的光密度(图1A和B)：我们发现CspglB2和空肠弯曲杆菌pglB似乎具有非常相似的毒性水平；
图2说明了在携带单个糖基化位点的大肠杆菌CLM24糖基化外毒素A中的糖基化效率测试。
图3说明了来自PoulvaC大肠杆菌[条带B和C]的两个独立克隆的CjaA的空肠弯曲杆菌七糖糖基化。A)仅抗cMyc标签通道；B)仅抗空肠弯曲杆菌七糖；C)叠加的cMyc和空肠弯曲杆菌七糖组合信号；
图4说明了PoulVac大肠杆菌和沙门氏菌；和马链球菌(具有表面呈现将经由附接至磷脂酰甘油膜锚着点而非UndPP的改变)的表面上杂合多糖的形成。
图5说明了原型双重家禽糖缀合物疫苗。
图6对应于组装的构建体的DNA序列。绿色，pEXT21序列；紫色，EcoRI限制位点；黄色，10个核苷酸的插入；红色，生痰弯曲杆菌pglB序列。重叠群表明组装的构建体，而预期是经预期的生痰弯曲杆菌pglB序列；
图7：代表由等位基因交换操作的遗传基因座的示意图，A cps2E基因座，B srtB基因座和C srtF基因座。大箭头表示基因座内的各个基因，蓝色的那些表示缺失的靶向基因。小箭头表示用于构建缺失盒的引物对；
图8：A负责荚膜产生的cps2E基因的缺失，B srtB基因的缺失，和C来自猪链球菌P1/7的srtF基因的缺失。使用跨猪链球菌P1/7中的靶向基因以鉴定缺失的引物进行PCR筛选以确认三种靶向基因的缺失。A.以下物质的PCR：Δcps2E筛选MW，(超阶梯I分子量标记)；Δcps2E、csp2E缺失突变体DNA；R，回复突变为野生型DNA；WT，野生型P1/7DNA；水，水对照。B.以下物质的PCR：ΔsrtB筛选MW(超阶梯I分子量标记)；ΔsrtB、ΔsrtB缺失突变体DNA；WT，野生型P1/7DNA。C.以下物质的PCR：ΔsrtF筛选MW(超阶梯I分子量标记)；ΔsrtF、ΔsrtF缺失突变DNA；WT，野生型P1/7DNA。通过对PCR产物进行Sanger测序来确认所有缺失；
图9对应于组装的构建体的DNA序列。绿色，pEXT21序列；紫色，EcoRI限制位点；黄色，10个核苷酸插入；红色，生痰弯曲杆菌pglB序列。重叠群表明组装的构建体，而预期是经预期的生痰弯曲杆菌pglB序列；
图10携带糖工程化构建体的大肠杆菌CLM24的生长曲线。橘色，编码生痰弯曲杆菌PglB的pEXT21，其具有紧接着EcoRI限制位点的ATG起始密码子。蓝色，携带空肠弯曲杆菌pglB的pEXT21；
图11携带糖工程化构建体的大肠杆菌CLM24的生长曲线。PglB的来源是编码生痰弯曲杆菌PglB的pEXT21，其具有在紧接着EcoRI限制位点的ATG起始密码子之前的10个碱基对间隔，；和
图12：在用突变体攻击猪后第0天和第15天的血清抗体效价。
材料和方法
细菌菌株和生长条件
在合适的情况下，大肠杆菌Top10(Invitrogen)生长在补充有氯霉素(12.5μg.ml-1)的Luria-Bertani(LB)生长培养基中。猪链球菌P1/7菌株在37℃下在5％CO2恒温箱中培养并在BHI培养基上生长。适当的培养基补充有氯霉素(5μg.ml-1)。通过电穿孔将质粒转移至猪链球菌中。
普通分子生物学技术
在用溶菌酶(在磷酸盐缓冲盐水中10mg.ml-1，在37℃下持续30min)处理，然后SDS(10％[wt/vol])，在65℃下持续30min)或chelex提取(将细胞沉淀在5％chelex[Sigma]中涡旋，煮沸10min，沉淀并移除和使用上清液)之后，使用质粒微型试剂盒(Qiagen)提取质粒，并用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。均根据制造商的说明书，使用Phusion高保真度聚合酶(NEB)扩增用于克隆的DNA和使用Go-taq聚合酶(Promega)扩增用于筛选的DNA。分别使用QIAquick PCR和凝胶提取试剂盒(Qiagen)从PCR反应物和琼脂糖凝胶中提取DNA。使用限制性内切核酸酶、热敏磷酸酶和T4连接酶(NEB)通过限制/连接克隆来构建质粒。通过限制分析和Sanger测序(SourceBioscience)来确认质粒。
等位基因交换质粒的构建
模块化质粒pMTL82151在本研究中被用作所有等位基因交换质粒的骨架。等位基因交换盒通过用限制性内切核酸酶消化的SOE-PCR组装，并与pMTL82151连接，使用相同的限制性内切核酸酶进行线性化。所有引物及它们相应的限制性内切核酸酶的列表可见于表2。设计内部SOE引物以扩增靶基因的前三个密码子和末端的五个密码子，分别在上游或下游扩增其大约1200bp的区域。
诱变
通过电穿孔将等位基因交换质粒转移至猪链球菌，并将转化体在补充有氯霉素(Cm)的BHI琼脂上生长以选择携带catP基因的质粒。在实验的第二部分，移除氯霉素选择以允许缺乏质粒标记catP的双交叉克隆生长。将单交叉克隆在非选择性培养基上每天传代培养持续多达八天。在每次传代培养时，通过影印平板法，筛选若干个菌落的质粒编码的Cm抗性的丢失。通过影印平板法至非选择性和Cm板上来检测双交叉事件，并通过PCR验证突变体(参见下文)。
框架内缺失突变体的确认
通过PCR，还使用染色体侧接引物确认了框架内缺失突变体。通过Sanger测序(Sourcebioscience)确认了突变体的序列。
生痰弯曲杆菌pglB2表达质粒pELLA1的构建
通过克隆载体pUC57km中的DNA合成产生密码子优化形式的生痰弯曲杆菌pglB2，并将其设计成在构建体的5’和3’末端具有EcoRI(GAATTC)限制酶位点。质粒pEXT21在大肠杆菌DH5α细胞中生长，并通过质粒提取(QIAGEN Ltd UK)纯化。将1μg含有CsPglB2的pUC57Km和1μg pEXT21用EcoRIHF(New England Biolabs U.K.)消化，克隆到IPTG诱导型表达载体pEXT21的EcoRI位点中以产生载体pELLA1。
pELLA2的构建
用来自质粒pEXT21的pTac启动子和LacI阻遏物作为模板，使用accuprime Taqhifi(其中(SEQ ID 13:5’-TTTTGCGGCCGCTTCTACGTGTTCCGCTTCC-3’)作为正向引物和(SEQID 14:5’-TTTTGCGGCCGCATTGCGTTGCGCTCACTGC-3’)作为反向引物)，使用以下循环条件：94℃/2分钟；然后35个循环：94℃持续30秒，56℃持续30秒和68℃持续4分钟，通过PCR扩增编码生痰弯曲杆菌PglB2的基因，并将其连接到pJCUSA1(抗性转座子)中的独特NotI位点，其中抗生素标记侧接有loxP位点，从而允许经由引入CRE酶从最终靶标菌株进行抗生素标记的下游去除。它具有pMB1复制起点，并因此可以在切割之前被维持在任何大肠杆菌菌株中，并使用SfiI限制酶消化与抗性盒一起转移并转移到pUT递送载体中，从而产生功能性转座子。转座子的序列如下所示(SEQ ID 15)：5’GGCCGCCTAGGCCGCGGCCGCCTACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGATCAGCACGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAAACATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGCCGCCTAGGCC-3’。
将CspglB2插入该转座子并转移到pUT递送载体中产生质粒pELLA2并维持在Transformax大肠杆菌菌株EC100D pir+(Cambio U.K.)中。
细菌接合
为了能够将CspglB2转座子货物转移到受体大肠杆菌菌株或任何其他细菌的染色体中，将质粒pELLA2转移到大肠杆菌MFD(二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型)中。生长培养基补充有(100μg/ml)和的氨苄青霉素(100μg/ml)。供体和受体细菌均生长至指数期后期。将细菌细胞通过离心沉淀，用PBS洗涤3次并以1：3受体与供体的比率混合在一起，并在不含抗生素的干燥LB琼脂板上点样4-8小时。将细胞刮下并悬浮在PBS中，并将稀释液涂布在含有适当选择抗生素的LB琼脂上以选择转化接合子。挑取单个菌落并筛选pUT骨架的丢失和转座子存在的菌落。
未标记的pglB插入的产生
将携带围绕抗性盒的CspglB2和loxP重组位点的转座子引入PoulVAc大肠杆菌中。在选择抗性菌落后，通过经由电穿孔引入温度敏感性载体pCRE5来去除抗生素选择标记(参考文献：Appl Environ Microbiol.2008年2月；74(4):1064–1075.Genetic Tools for Select-Agent-Compliant Manipulation of Burkholderiapseudomallei.Kyoung-Hee Choi,Takehiko Mima,Yveth Casart,Drew Rholl,AyushKumar,Ifor R.Beacham和Herbert P.Schweizer)。
将PoulVAc大肠杆菌在卡那霉素(50μg/ml)的存在下于28℃下培养，加入鼠李糖以诱导最终浓度为0.2％的表达，并将生物体继代培养数次以选择对失去抗性但维持对卡那霉素的抗性的菌落，表明博来霉素抗性基因已被翻出染色体。
然后将该大肠杆菌突变体在42℃下进行继代培养以去除pCRE5质粒。筛选再次对卡那霉素敏感的菌落证实了pCRE5的丢失并且在大肠杆菌的染色体上完成了未标记的pglB诱导型拷贝的产生。
pELLA3的构建
使用引物CsPglB1fwd：TTTT GAATTCGATTATCGCCATGGCGTCAAATTTTAATTTCGCTAAA(SEQ ID NO 16)和反向引物CsPglB1rev:TTTT GAATTCTTATTTTTTGAGTTTATAAATTTTAGTTGAT(SEQ ID NO 17)，使用Accuprime Taq Hifi和以下的循环条件：94℃/30s，然后以下条件的24个循环：94℃/30s，53℃/30s，68℃/2min，扩增来自生痰弯曲杆菌的pglB基因。将PCR产物在37℃下用限制酶EcoRI HF切割16hr。还将质粒pEXT21用限制酶EcoRI HF在37℃下切割16hr。将质粒和PCR产物两者用PCR纯化试剂盒(QIAGEN UK)纯化，并通过在37℃下用热敏磷酸酶(NEB UK Ltd)处理1hr来将质粒pEXT21脱磷酸化。在将质粒和插入物使用T4DNA连接酶(Promega UK)连接在一起之前，将酶通过在80℃下加热2min来热灭活，并将反应物在4℃下孵育过夜。将连接反应物转化至大肠杆菌Dh10β细胞(NEB UK Ltd)中，并在LB壮观霉素板(80μg/ml)上回收。然后将构建体测序以确认经克隆的生痰弯曲杆菌PglB在克隆过程期间未获得任何突变。这种新型构建体被称为命名为pELLA3。
在该糖基工程化工具的另一种形式中，修饰了mariner Himar1元件以在转座子的IR1和IR2末端之间携带独特的NotI位点。该NotI位点被用于在Himar1转座子内含有的erm盒的控制下，使来自肺炎链球菌血清型3的透明质酸合酶基因和UDP-Glc脱氢酶编码基因整合。用于制备基于Himar1的插入的载体是载体pCAM45的衍生物(May等人，FEMSMicrobiology Letters 2004)，其中修饰是去除了R6k复制起点。这种新的转座子携带载体被命名为pELLA4。
载体多肽
用编码修饰的载体多肽[GT-ExoA]的质粒pGVXN150:GT-ExoA转化减毒细菌菌株。将GT-ExoA构建体工程化以在载体pGH中表达铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)外毒素A的修饰形式，并使用限制酶NheI和EcoRI(NEB)将其封闭到来源于pEC415的载体中。合成的蛋白质含有两个内部修饰，它们允许Pgl对蛋白质进行糖基化，以及在N末端含有4个N-糖基化序列子和在C末端糖标签含有另外4个N-糖基化序列子。此外，在蛋白质的C末端添加六组氨酸标签以帮助纯化，并且将大肠杆菌DsbA信号肽添加至N-末端序列，使得Sec依赖性分泌至周质。pGVXN150:GT-ExoA是氨苄青霉素抗性的和L-(+)-阿拉伯糖诱导型的。然后使用Sanger序列用引物GTExoA NF(SEQ ID NO 18；GCGCTGGCTGGTTTAGTTT)、GTExoA NR(SEQ ID NO 19；CGCATTCGTTCCAGAGGT)、GTExoA CF(SEQ ID NO 20；GACAAGGAACAGGCGATCAG)和GTExoA CR(SEQ ID NO 21；TGGTGATGATGGTGATGGTC)确认构建体序列。
降低PglB的毒性
蛋白质聚糖偶联技术需要使用空肠弯曲杆菌PglB。该酶具有13个跨膜结构域，并且当在大肠杆菌中过表达时是有毒的。使用引物(SEQ ID NO 22:AAGAATTCATGTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCC)和PglBNcoI-HA(SEQ ID NO 23:AACCATGGTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAATTTTAAGTTTAAAAACCTTAGC)，使用Pfu聚合酶，用pACYC(pgl)作为模板，最初通过PCR用寡核苷酸PglBEcoRI(EcoRI以粗体显示)扩增pgIB基因。寡核苷酸PglBNcoI-HA编码HA标签以遵循PglB表达(通过蛋白质印迹)。将PCR产物用EcoRI和NcoI消化，并克隆到载体pMLBAD的相同位点中。获得的质粒被命名为pMAF10。通过蛋白质印迹证实了PglB的阿拉伯糖依赖性表达(Feldman等人，2005)。该构建体已经被亚克隆到载体pEXT21的EcoRI位点中，允许CjpglB的IPTG依赖性诱导表达。这种质粒和ORF组合已经使用了几年，以产生几种糖缀合物疫苗。在最近使用来自生痰弯曲杆菌的PglB的修饰中，我们进行了测试并发现核糖体结合位点在pEXT21载体本身内被编码。这意味着翻译效率部分地受到RBS与pglB的ATG起始密码子之间的距离的控制。我们注意到，将PglB编码基因插入具有延伸的10个碱基对的DNA序列的载体pEXT21中导致酶的毒性降低，并且随后如通过光密度测量，载体大肠杆菌菌株的生长增加。因此，可以通过在ATG起始密码子之前插入额外的核苷酸的简单修饰或者可替代地将所述基因克隆远离表达质粒内携带的RBS来降低空肠弯曲杆菌PglB的毒性。
在pACYC184中克隆的空肠弯曲杆菌81116pgl基因座的体外诱变
使用定制的EZ::TN转座子系统(Epicentre,麦迪逊,WI,USA)在体外进行在pACYC184(pACYCpgl)中克隆的空肠弯曲杆菌81116糖基化基因座中的11个基因的诱变。简而言之，通过PCR扩增缺乏转录终止因子并因此不能发挥下游极性效应的卡那霉素抗性盒(Trieu-Cuot等人，1985)并将其克隆到载体pMODTM<MCS>(Epicentre)的多克隆位点中。通过ScaI消化使该构建体线性化，并使用引物FP-1和RP-1(Epicenter)通过PCR扩增卡那霉素抗性盒以及侧面的马赛克末端(mosaic ends)。将PCR产物与质粒pACYCpg1(Wacker等人， 2002)在根据制造商的说明书(Epicenter)进行的体外转座反应中组合。将得到的突变的pACYCpgl质粒库电穿孔到大肠杆菌XL1-Blue MRF′(Stratagene)中，并通过PCR筛选推定的突变体以鉴定卡那霉素盒的位置和方向。我们仅使用具有与糖基化基因座的基因相同的转录方向插入的卡那霉素抗性盒的那些突变体，其也通过序列分析证实。
猪中猪链球菌突变体和野生型P1/7菌株的发病机理
表1：实验组
在用猪链球菌突变体和野生型菌株鼻内攻击之前，从猪中取出鼻拭物和血液样品(第0天)。将猪用2ml(1ml/鼻孔)的于PBS中大约109CFU/ml的猪链球菌突变体和野生型菌株激发(表3)。
表3接种物的滴度：
在第2天、第5天和第7天，取鼻腔或鼻腔和扁桃体拭物并将其立即涂铺以进行细菌计数。
观察猪的严重疾病的临床病征，包括跛足、嗜睡、神经症状。尸体剖检时的样品，诸如SST用于血液、鼻拭物、扁桃体拭物、浆膜拭物(心包、胸腔、腹腔)、关节穿刺或拭物(受影响的关节或肘关节)、CSF穿刺。将肺灌洗液取出并立即培养或冷冻，记录总的病变。将样品收集在2ml PBS中，除了肺灌洗液，其中将50ml PBS滴入肺中并用移液管收集。将100ul样品涂铺在TSA血琼脂板上。
如果呈现足够严重(呼吸困难、扁跗节和/或在人类进入围栏后不起来)，对猪进行安乐死。否则，如果没有显示临床病症，猪在感染后第15天对猪进行安乐死。在猪中暴露15天后测量血清抗体效价(图12)。
实施例1
将构建体pELLA1与具有单个内部糖基化位点的编码铜绿假单胞菌外毒素A的pEC415载体以及编码整个空肠弯曲杆菌七糖的质粒pACYCpglB::km(通过插入微型Tn5km2(miniTn5km2)元件而在pglB基因中具有中断)一起转化至大肠杆菌CLM24细胞中。作为比较，将外毒素A和空肠弯曲杆菌七糖编码构建体转化到携带来自空肠弯曲杆菌的pEXT21pglB的大肠杆菌CLM24细胞中。用10ml的CLM24构建体组合的O/N培养物接种含有30μg/ml-1cm、100μg/ml-1amp、80μg/ml-1壮观霉素的500ml LB，并在37℃下振荡孵育。在每小时间隔获取光密度600nm读数，并通过加入IPTG(1mM)和L-阿拉伯糖(0.2％的终浓度)在OD600nm为0.4下诱导蛋白质表达。初始诱导后5hr，加入0.2％的L-阿拉伯糖，并继续测量OD600nm(图1A)。
还测量了没有任何蛋白质表达诱导的大肠杆菌CLM24细胞的生长。这与如上针对携带pELLA1的大肠杆菌CLM24细胞所述的相同方式进行，除了不加入IPTG或L-阿拉伯糖(图1B)。
实施例2
携带编码单个可糖基化外毒素A、生痰弯曲杆菌PglB2或空肠弯曲杆菌PglB的质粒的大肠杆菌CLM24培养物被用于接种500ml LB液体培养基。如实施例1中所述诱导蛋白质表达，修改为在第二次添加0.2％的L-阿拉伯糖后将培养物再孵育16hr。此时，通过以4000×g离心30分钟使细胞沉淀，并使用高压细胞匀浆器(Stansted Fluid power)裂解。使用NiNTA结合从CLM24细胞中纯化HIS标记的外毒素A。在转移到硝酸纤维素膜上之前，在12％Bis-tris凝胶(Invitrogen)上分离蛋白质。这用第一兔hr6抗campy聚糖抗体和小鼠抗HIS探测。山羊抗兔和抗小鼠红外染料标记的第二抗体被用于使得使用Odyssey LI-COR扫描仪(LI-COR Biosciences UK Ltd)的糖蛋白可视化(图2)。
实施例3
通过电穿孔将pACYCpgl连同编码c-Myc标记的可四糖基化的L-阿拉伯糖诱导型CjaA的质粒pUA31引入PoulVAC大肠杆菌中。用0.2％的L-阿拉伯糖诱导2次后，并在37℃下振荡孵育总共24hr，获得1ml培养物并子10,000×g下离心10min。弃去上清液，并将沉淀重悬于100μl的2×SDS PAGE上样染料中。将其煮沸10min，然后将20μl加载到12％Bis-Tris凝胶中并转移到硝酸纤维素膜上。用小鼠抗c-Myc抗体和兔hr6抗体探测样品。使用山羊抗兔和抗小鼠红外染料标记的第二抗体来使得用Odyssey LI-COR扫描仪(LI-COR BiosciencesUK Ltd)使糖蛋白可视化(图3)。
实施例4
用pUA31(编码受体蛋白CjaA)、pACYCpgl(pglB::km)(编码空肠弯曲杆菌七糖编码基因座，但pglB被敲除)和pELLA1(编码阿拉伯糖诱导型空肠弯曲杆菌pglB)转化鼠伤寒沙门氏菌菌株SL3749。制备10mlO/N 37℃振荡培养物并将其用于接种200ml LB液体培养基。将其继续在37℃下振荡，直到达到0.4的OD600nm。此时，加入0.2％的L-阿拉伯糖以诱导CjaA和PglB表达。孵育4小时后，再次添加L-阿拉伯糖至0.2％的最终浓度，并将培养物在37℃下再振荡孵育16hr。通过在6000×g下离心30min沉淀细菌培养物，并将其重悬于30ml25mM Tris、0.15M NaCl pH 7.5(TBS)中。使用高压细胞匀浆器裂解细胞。加入2％的SDS和1％的Triton X-100，并将裂解的材料在4℃下混合孵育3hr。然后将材料在4000×g下离心20min。在加入300μl c-Myc琼脂糖(Thermo Scientific USA)之前弃去沉淀。允许其在4℃下混合孵育O/N。然后将材料在4000×g下离心10min并除去上清液。加入1ml的TBS和0.05％的吐温。将其通过在10,000×g下脉冲洗涤5次。通过添加含有3μl DTT的300μl的2×SDS上样缓冲液实现蛋白质洗脱，并煮沸10分钟来。如实施例3所述，进行蛋白质印迹(图5)。
实施例5
我们已经使用携带IPTG可诱导的CspglB拷贝的转座子pELLA2将该基因整合到糖工程化的大肠杆菌菌株W3110、CLM24、CLM37、Sθ874、SCM7、SCM6、SCM3以及PoulVAc大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的染色体中。
实施例6
将携带编码空肠弯曲杆菌七糖pACYCpgl(在pglB中没有敲除)和受体蛋白质的质粒以及构建体pELLA1的大肠杆菌菌株CLM24在含有Cm 30μg/ml、Sp 80μg/ml、Amp 100μg/ml的50ml LB液体培养基中在37℃下振荡生长。以每小时间隔在600nm处获取光密度读数。将生长与pEXT21携带空肠弯曲杆菌pglB时观察到的生长进行比较。在OD600nm的光密度为0.4下，加入终浓度为1mM的IPTG，并加入终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖。结果显示在图8中，并且是三个生物学重复的均值(平均值)。
实施例7
将携带编码空肠弯曲杆菌七糖pACYCpgl(在pglB中没有敲除)和受体蛋白质的质粒以及构建体pELLA3的大肠杆菌菌株CLM24在含有Cm 30μg/ml、Sp 80μg/ml、Amp 100μg/ml的50ml LB液体培养基中在37℃下振荡生长。以每小时间隔在600nm处获取光密度读数。将生长与pEXT21携带空肠弯曲杆菌pglB时观察到的生长进行比较。在OD600nm的光密度为0.4下，加入终浓度为1mM的IPTG，并加入终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖。结果显示在图9中，并且是三个生物学重复的均值(平均值)。
实施例8
在没有反选择标记的情况下猪和人病原体猪链球菌血清型2(ss2)的诱变
猪链球菌血清型2是猪的主要病原体，最近据报道已跨越种间屏障，引起人类感染。多糖荚膜的存在被认为是主要的毒力决定因素，并且基因cps2E被认为是荚膜形成所必需的。我们感兴趣的其他基因是猪链球菌分选酶，其中有6种推定的分选酶，SrtA-F。
首先，我们鉴定了质粒pMTL82151，其在猪链球菌中是非复制性的并因此适合作为该生物体中的自杀质粒。用pMTL82151转化的猪链球菌P1/7感受态细胞不能在选择性平板上形成菌落，而用复制型质粒pSET1转化的细胞如预期形成菌落。然后构建用于缺失基因csp2E、srtB和srtF的等位基因交换盒，具有大约1.2kbp的同源区域(除了srtF同源区域2，其含有700bp的同源区域以避免克隆似乎对大肠杆菌有毒的任何完整基因)。用等位基因交换质粒转化猪链球菌，并获得氯霉素(Cm)抗性单交叉克隆。单交叉整合体在没有选择的情况下传代，并且每天对菌落进行斑点涂布以确定是否发生了双重组合。该频率足够高，突变体可以通过第五次传代和第六次传代容易地分离而无需选择。通过PCR筛选Cm敏感性克隆以确定它们是否包含回复到野生型的突变体或等位基因，分离cps2E、srtB和srtF的突变体并通过Sanger测序确认。
表2
HA＝同源臂；bp＝碱基对；F＝正向；R＝反向。带下划线的序列对应于限制性内切核酸酶的识别序列
实施例9
用猪链球菌的野生型菌株(P1/7)、用作非致病性对照的cps2E突变体，srtB和srtF突变体以及ssu1476(推定的分选蛋白)中的突变攻击猪。攻击是鼻内的，即猪的自然感染途径。
第4-5组的临床病征的发作/尸体剖检在3-8天之间，而第1-3组在攻击后15天未显示临床症状。
表4：结果–在尸体剖检时的链球菌培养物
NCS＝无临床病征
？＝太多污染细菌以致于不能确认是否存在链球菌菌落，计划进行PCR。
+＝链球菌存在但很难估计数量，有其他细菌存在。
参考文献
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ttaaaatcag acattttaca agccatgatg aaagattata atcaaagcaa tgtggattta 1620
tttctagctt cattatcaaa acctgatttt aaaatcgata caccaaaaac tcgtgatatt 1680
tatctttata tgcccgctag aatgtctttg attttttcta cggtggctag tttttctttt 1740
attaatttag atacaggagt tttggataaa ccttttacct ttagcacagc ttatccactt 1800
gatgttaaaa atggagaaat ttatcttagc aacggagtgg ttttaagcga tgattttaga 1860
agttttaaaa taggtgataa tgtggtttct gtaaatagta tcgtagagat taattctatt 1920
aaacaaggtg aatacaaaat cactccaatc gatgataagg ctcagtttta tattttttat 1980
ttaaaggata gtgctattcc ttacgcacaa tttattttaa tggataaaac catgtttaat 2040
agtgcttatg tgcaaatgtt ttttttggga aattatgata agaatttatt tgacttggtg 2100
attaattcta gagatgctaa agtttttaaa cttaaaattt aa 2142
<210> 5
<211> 2133
<212> DNA
<213> 生痰弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)
<400> 5
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ctttcttact atggctcatc tctttctaca cttagcatgt ggctatatag cattttgcca 300
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cctttgatac ttataggtaa agaactaaac gcttcaaaag ctggatttat agctgcactt 420
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ccatcttctt actcactatt actcgcaatg attgggatgt ttgttttata taccattgtt 660
tttgaaagat atgaaaaact aaactatgaa gctatggttt ttatgatttt ggcaatcaca 720
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tatcaaagat tttttgataa aaaagtaata tttgcattaa ttatagcttc atcaatatgc 840
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<211> 2133
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<213> 生痰弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)
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<212> PRT
<213> 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
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275 280 285
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<213> 生痰弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)
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catcaccatt ga 2112
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<212> DNA
<213> 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
<400> 12
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tttcgcactg gttttatttg tgattacttg ttttttattt caaaaaggtt tttttagtct 13800
ttttgataat caagctatag gcatagaaca tatgtttgaa agtaccattg ccataacttt 13860
agctttagct atttttgatt tggcaaaaac tttgatcgaa caagaagtat taggaaggac 13920
aaaaaaagaa gaaggtggaa ttcaaaaaac catggtgaga tttttgggtt ctattatcat 13980
tgctttagct atagaagctt tgatgttggt atttaaactt gctattggtg atctttctca 14040
gatgatttat gcgatttatc ttatcggtgg agtgagcttg cttcttttag gcttaagtgt 14100
atatttattt acggttaagt ataaaaataa taatatttga gtaaaaattt aagtaaaaga 14160
tgatataatg ctgtttttta aaatttttta gcttgattaa taaggctaaa aagggtaaaa 14220
taaaactata aaaactttga aaggacgaaa ttgtgaaatt gttagttgtt gatgacagtt 14280
ctactatgag aaggattatt aaaaataccc taacaagact tggacacgat gatgttttag 14340
aagctgagca tggcgttgaa gcttgggatt tattaactaa aaatgaagat gtaaaagttt 14400
taattacaga ttggaatatg ccagaaatga atggcttgga gttggtaaaa aaagtaagag 14460
cagagaaaaa atatgaagat atgcctatta tcatggttac aactgagggc ggaaaagctg 14520
aagtgattac tgctttaaaa gctggcgtaa ataactatat tgtaaaacct tttactccac 14580
aagttttaaa ggaaaaactt gaagatgttt taggaacagg aagtggagaa ggtgcagctg 14640
agtaa 14645
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 13
ttttgcggcc gcttctacgt gttccgcttc c 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 14
ttttgcggcc gcattgcgtt gcgctcactg c 31
<210> 15
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 转座子
<400> 15
ggccgcctag gccgcggccg cctacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgtctga 60
cgctcagtgg aacgacgcgt aactcacgtt aagggatttt ggtcatgatc agcacgttga 120
caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaaa 180
catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt 240
cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg 300
tgtggtccgg gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga 360
caacaccctg gcctgggtgt gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga 420
ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca 480
gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc 540
cgaggagcag gactgaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat ggccgcctag 600
gcc 603
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 16
ttttgaattc gattatcgcc atggcgtcaa attttaattt cgctaaa 47
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 17
ttttgaattc ttattttttg agtttataaa ttttagttga t 41
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 18
gcgctggctg gtttagttt 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 19
cgcattcgtt ccagaggt 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 20
gacaaggaac aggcgatcag 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 21
tggtgatgat ggtgatggtc 20
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 22
aagaattcat gttgaaaaaa gagtatttaa aaaaccc 37
<210> 23
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 23
aaccatggtt aagcgtaatc tggaacatcg tatgggtaaa ttttaagttt aaaaacctta 60
gc 62
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 24
ttacttactt ccctctctca atatttcaat attcatagct cct 43
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 25
aggagctatg aatattgaaa tattgagaga gggaagtaag taa 43
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 26
tatattgaat tcaattacaa agattacagg tttg 34
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 27
agttcaggat cctcctttaa acaacttctc atac 34
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 28
ctgcggctag tctcgctatt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 29
catgcgcttc aaattcattc 20
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 30
agttcacata tgcgggtggt atcggtacac tt 32
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 31
cctttttgtt aataagaaaa tcagtttctg tatcataatc cgaacttc 48
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 32
gaagttcgga ttatgataca gaaactgatt ttcttattaa caaaaagg 48
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 33
ttcgtatgga tccaactacg gtgaccggca at 32
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 34
gagaattgaa ggaagtgata 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 35
atataaggag tacaggttag 20
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 36
agttcagcta gcgggcaaag aatttcggta ca 32
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 37
ctttctgagg ttccatggta aggagccatt tgatcatgaa at 42
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 38
atttcatgat caaatggctc cttaccatgg aacctcagaa ag 42
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 39
ttcgtatgga tccgtagtcc aaatgagcta cttac 35
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 40
gacaagccaa ctgaaacaac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 41
agattcccct gatttagcta 20
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 42
actggccgtc gttttaca 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 43
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 44
Asp Gln Asn Ala Thr
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 45
Asp Asn Asn Asn Thr
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 46
Asp Asn Asn Asn Ser
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 47
Asp Gln Asn Arg Thr
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 48
Glu Asn Asn Phe Thr
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 49
Asp Ser Asn Ser Thr
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 50
Asp Gln Asn Ile Ser
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 51
Asp Gln Asn Val Ser
1 5
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 52
Asp Asn Asn Val Ser
1 5
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 53
Asp Tyr Asn Val Ser
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 54
Asp Phe Asn Val Ser
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 55
Asp Phe Asn Ala Ser
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 56
Asp Phe Asn Ser Ser
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 57
Asp Val Asn Ala Thr
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 58
Asp Phe Asn Val Thr
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 59
Asp Val Asn Ala Ser
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 60
Asp Val Asn Val Thr
1 5
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 糖基化基序
<400> 61
Glu Val Asn Ala Thr
1 5

Claims (51)

1.致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了一个或多个转录盒，所述一个或多个转录盒包含：
核酸分子，其编码寡糖转移酶多肽，
核酸分子，其编码作为所述寡糖转移酶的底物的包含至少一个糖基化位点的一种或多种载体多肽，和
核酸分子，其编码生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，
特征在于所述致病性细菌细胞是减毒的并且所述异源聚糖抗原在所述细菌细胞表面处被表达，并且其中所述异源聚糖还被偶联至所述载体多肽以提供保留在所述减毒的致病性细菌细胞内的糖缀合物。
2.根据权利要求1所述的致病性细菌细胞，其中所述细菌细胞包含至少一个编码膜多肽或膜相关多肽的失活的或经突变的基因，其中活的致病性细菌细胞是减毒的并且所述减毒是所述基因失活或突变的结果。
3.根据权利要求1或2所述的致病性细菌细胞，其中所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。
4.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列，；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
5.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
6.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述多糖修饰酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
ii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码多糖修饰酶。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶和/或所述多糖修饰酶的所述基因通过编码所述分选酶和/或多糖修饰酶的核苷酸序列的全部或部分的缺失，或者控制所述分选酶和/或多糖修饰酶的表达的调节区的全部或部分的缺失而被修饰。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶是弯曲杆菌属寡糖转移酶。
9.根据权利要求8所述的致病性细菌细胞，其中所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)寡糖转移酶。
10.根据权利要求8所述的致病性细菌细胞，其中所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是生痰弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)寡糖转移酶。
11.根据权利要求9所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者由包含与SEQ ID NO:4所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
12.根据权利要求10所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由包含如SEQ IDNO:5或6所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者由包含与SEQ ID NO:5或6所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
13.根据权利要求9或11所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQ ID NO:7所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。
14.根据权利要求10或12所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQ ID NO:8所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述载体多肽包含氨基酸基序：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，或其中所述受体多肽包括氨基酸基序：D/E-X-N-X-S/T，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的致病性细菌细胞，其中,所述载体多肽是由所述减毒的致病性细菌细胞的基因组编码的内源性载体多肽。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述载体多肽是由不是由所述减毒的致病性细菌细胞天然表达的核酸分子编码的异源性载体多肽。
18.根据权利要求17所述的致病性细菌细胞，其中所述异源性载体多肽由从致病性细菌物种分离的核酸分子编码。
19.根据权利要求17或18所述的致病性细菌细胞，其中所述异源性载体多肽由如SEQID NO:9、10或11所示的核苷酸序列编码。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码包含异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的生物合成基因座的所述核酸分子，编码荚膜多糖。
21.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述多糖是O-抗原。
22.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述多糖是七糖。
23.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述生物合成基因座包含含有如SEQID NO:12所示的核苷酸序列的核酸分子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述寡糖转移酶的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述载体多肽的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述生物合成基因座的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述生物合成基因座是Pgl基因座。
28.根据权利要求27所述的致病性细菌细胞，其中所述Pgl基因座包含编码选自以下的所述一种或多种多肽的基因：PglG、PglF、PglE、Cj1122c、PglD、PglC、PglA、PglJ、PglI、PglH、PglK。
29.根据权利要求27或28所述的致病性细菌细胞，其中编码异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的所述核酸分子包含如SEQ ID NO 12所示的序列，其中所述SEQ ID NO:12不包括功能型的PglB。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述转录盒包含与编码所述寡糖转移酶多肽的至少核酸分子可操作地连接的启动子。
31.根据权利要求30所述的致病性细菌细胞，其中所述启动子还与核糖体结合位点可操作性地连接，其中在所述核糖体结合位点的3’主要端与编码所述载体多肽和/或异源聚糖抗原和/或寡糖转移酶多肽的5’初始的起始密码子之间提供了核苷酸间隔序列，其中当与不包含所述核苷酸间隔序列的编码所述重组多肽的对照核酸分子相比时，编码所述载体多肽和/或异源聚糖抗原和/或寡糖转移酶多肽的核酸分子的翻译减少。
32.根据权利要求30或31所述的致病性细菌细胞，其中所述启动子是可调节的并且包括赋予可调节表达的诱导型或阻遏型核苷酸元件。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述减毒的致病性细菌细胞是灭活的。
34.疫苗或免疫原性组合物，其包含减毒的或灭活的权利要求1至33中任一项所述的致病性细菌细胞。
35.权利要求34所述的疫苗或免疫原性组合物，其用于预防或治疗非人类动物对象的细菌感染中的用途。
36.根据权利要求35所述用途的组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物预防或治疗所述非人类动物对象的两种不同的细菌感染。
37.根据权利要求35所述用途的组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物预防或治疗所述非人类动物对象的三种不同的细菌感染。
38.根据权利要求35至37中任一项所述用途的组合物，其中所述细菌感染由选自以下的细菌物种引起：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronhiseptica)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelotrix rhusiopatie)和肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)。
39.根据权利要求35至38中任一项所述用途的组合物，其中所述细菌感染是链球菌感染的结果。
40.根据权利要求35至37中任一项所述用途的组合物，其中所述细菌感染是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)感染的结果。
41.细胞培养物，其包含减毒的权利要求1至32中任一项所述的致病性细菌细胞。
42.细胞培养容器，其包含权利要求41所述的细菌细胞培养物。
43.活的致病性细菌细胞，其包含编码膜多肽或膜相关多肽的至少一种失活的或经突变的基因，其中所述活的致病性细菌细胞是减毒的并且所述减毒是所述基因失活或突变的结果。
44.根据权利要求43所述的活的致病性细菌细胞，其中所述细菌细胞属于链球菌属。
45.根据权利要求44所述的活的致病性细菌细胞，其中所述细菌病原体选自：猪链球菌(Streptococcus suis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、海豚链球菌(Streptococcus innuae)、马链球菌(Streptococcusequi)、乳房链球菌(Streptococcus uberus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
46.根据权利要求45所述的活的致病性细菌细胞，其中所述细菌细胞是猪链球菌。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的活的致病性细菌细胞，其中所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。
48.根据权利要求47所述的活的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
49.根据权利要求47所述的活的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。
50.根据权利要求47所述的活的致病性细菌细胞，其中所述多糖修饰酶由选自以下的核苷酸序列编码：
i)核酸分子，其包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的；
ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和
iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码多糖修饰酶。
51.致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了包含生物合成基因座的转录盒，所述生物合成基因座包含不是由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，其中所述异源聚糖抗原在细菌细胞表面处被表达。
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