CN110396527A - 一种维生素d3羟化酶转化生产25-羟基维生素d3的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种以维生素D3为底物通过酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：产维生素D3羟化酶的大肠杆菌经IPTG诱导后培养18‑38h；b.破壁：发酵液通过离心收集大肠杆菌，并加入发酵液体积30%‑100%的纯水洗菌体，用磷酸盐缓冲液重悬菌体后通过高压均质机进行破壁处理；c.粗提：将b步骤获得的破壁液离心收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，加入到c步骤获得的粗酶液中，使得维生素D3的终浓度达到0.5‑5g/L，并加入该羟化酶的辅因子，于20‑40℃条件下，转化24‑48h。经HPLC检测，维生素D3的转化率达到80%以上。

Description

一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种以维生素D3为底物通过游离的维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法。
背景技术
25-羟基维生素D3，又称骨化二醇，是活性维生素D3 类药物的代表之一，于1995年获得美国食品药品管理局（FDA）认证，已载入美国药典USP36-NF31和欧洲药典(EP)8.0。临床上主要用于治疗骨紊乱、代谢性骨疾病等，尤其适合肾功能正常而肝功能丧失不全的患者使用。
目前生产25-羟基维生素D3的常用方法有化学合成法与生物转化法。化学合成25-羟基维生素的方法相当丰富，但路线反应步骤多，往往需要多步的保护与脱保护，分离纯化复杂，收率低，这些因素导致了化学法合成出的25-羟基维生素D3产品价格高昂，难以适应市场需要，且面临原料和试剂成本高、环境污染严重等问题。生物转化法能完成一些化学合成难以进行的反应，具有较强的区域选择性和立体选择性，在温和均一的条件下容易实现自动化和反应的重现性，且能耗低，对环境的污染小。
近年来对微生物催化维生素D3的羟基化研究逐渐热门，构建高效表达维生素D3羟化酶的基因工程菌，以维生素D3为底物进行生物转化获得25-羟基维生素D3是目前生物转化法的主流方向。由于维生素D3羟化酶属于胞内酶，该酶和电子传递链相关的蛋白均位于细胞质或细胞质膜，细胞壁及细胞膜会阻碍底物和产物在细胞内外的交换，羟基化产率较低。因此在发酵液直接转化或者静息全细胞转化时，需加入β-环糊精与表面活性剂等作用于细胞膜、细胞壁和底物的物质以增加转化效率，但是这些物质的引入，势必为后序的提取精制增加负担。因此在目前研究基础上，提高底物转化率、缩短转化周期、精简后提取步骤仍是生物转化法生产25-羟基维生素D3亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有生物转化法的不足，提供一种游离酶转化生产25-羟基维生素D3的技术，将大肠杆菌破壁后获得游离的维生素D3羟化酶，以维生素D3为底物，添加酶转化所需辅因子，使得底物转化率大于80%，转化周期缩短至24-48h。本发明提供的游离酶转化技术能有效的提高转化率、明显缩短转化周期、降低后续提取成本。
具体的，本发明的目的可通过如下技术措施来实现：
该方法按如下步骤进行：
a.发酵：在发酵培养基（含10-100mg/L氨苄青霉素）中接入大肠杆菌进行培养，初始培养温度为30-40℃，培养至OD600=1-5时加入终浓度为0.1-1mM的IPTG作为诱导剂，诱导温度为15-30℃，在转速为200-400rpm的条件下培养18-38h得到大肠杆菌发酵液；
所述发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl4-15g/L，pH至7.0；
b.破壁：发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min，收集大肠杆菌，并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次，用发酵液体积10-20%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）重悬菌体，菌液通过高压均质机在500-1000bar的压力下破壁处理10-40min，使细胞破碎率达到95%以上；
c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；
d.转化：用特定溶剂（包括乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种的组合）配制5-20%维生素D3溶液，缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中，同时加入终浓度为0.01%-0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子（包括：包括NADH、NADPH、维生素C、细胞色素C、铜盐和铁盐中的一种），在100-500rpm震荡条件下进行游离酶转化，转化温度为，20-40℃，转化时间为24-48h。
所述游离酶转化生产25-羟基维生素D3，经上述方法转化后，取1mL转化液，加入99mL甲醇，充分混匀后，过0.45μm有机滤膜，采用高效液相色谱法进行维生素D3和25羟基维生素D3的测定。色谱条件如下：色谱柱为Inertsil ODS-3 ( 4.6 mm×250mm，5 μm)、柱温30℃、波长264nm、流动相为甲醇:水= 95:5、流速1mL/min。根据标准曲线回归方程，计算样品中维生素D3和25-羟基维生素D3的量，计算转化率。
本发明的有益效果在于。
（1）首次采用游离酶法生产25-羟基维生素D3，大幅度增加了酶转化效率，转化率达80%以上，转化周期缩短至24-48h。
（2）破壁后，解除了细胞壁和细胞膜的屏障作用，底物能更加高效的结合到维生素D3羟化酶的结合位点上，转化体系中底物浓度提高至0.5-5g/L。
（3）游离酶转化体系中无需加入表面活性剂，因而避免了其对维生素D3羟化酶活力的影响，并且降低了后续提取工序的成本。
附图说明：
图1为本发明方法技术路线示意图。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
大肠杆菌的发酵培养
斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。pH至7.0；
发酵培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。pH至7.0；
取新鲜斜面培养物1环接种于发酵培养基中，加入过滤除菌后的氨苄青霉素，使得发酵培养基中氨苄青霉素的终浓度为50mg/L，于37℃，200rpm条件下，培养至OD600=2时，加入终浓度为0.5mM的IPTG（过滤除菌）作为诱导剂，28℃进行诱导产酶，培养24h后得到大肠杆菌菌液。
实施例2：
游离酶法转化生产25-羟基维生素D3
取500mL发酵液，6000rpm离心5min，收集菌体，加入发酵液体积100%的纯水洗菌体1次，加入0.2M的磷酸缓冲液（pH7.0）100mL，制成菌悬液。通过高压均质机在600bar的压力下破壁处理20min，此时大肠杆菌破壁率达到99%。将破壁液以8000rpm的转速离心3min，收集上清液，即维生素D3羟化酶的粗酶液。取50mg维生素D3溶解于1mL乙酸乙酯溶液，缓慢加入到粗酶液中，并分别加入10mg的NADPH，混合均匀后，在300rpm震荡条件下进行酶转化，转化温度为30℃，转化时间为48h；
经上述方法转化后，通过HPLC方法进行检测，25-羟基维生素D3的产量为445mg/L，维生素D3的转化率为81.7%。
实施例3：
游离酶法转化生产25-羟基维生素D3。
取1L发酵液，8000rpm离心5min，收集菌体，加入发酵液体积50%的纯水洗菌体3次，加入0.2M的磷酸缓冲液（pH7.0）100mL，制成菌悬液。通过高压均质机在800bar的压力下破壁处理30min，此时大肠杆菌破壁率达到98.5%。将破壁液以10000rpm的转速离心1min，收集上清液，即维生素D3羟化酶的粗酶液。取50mg维生素D3溶解于1mL乙醇溶液，缓慢加入到粗酶液中，并加入10mg的NADH，混合均匀后，在250rpm震荡条件下进行酶转化，转化温度为35℃，转化时间为24h；
经上述方法转化后，通过HPLC方法进行检测，25-羟基维生素D3的产量为462mg/L，维生素D3的转化率为84.8%。
实施例4：
三种生物转化方法的比较。
制备3L大肠杆菌发酵液，分3份，以0.5g的维生素D3为底物，分别通过发酵液转化法、静息细胞转化法、游离酶转化法来制备25-羟基维生素D3。比较提取率、25-羟基维生素D3产量、转化周期。比较结果如下表：
三种转化方法经过对比发现，本发明提供的游离酶转化生产的25-羟基维生素D3的方法，大幅度增加了酶转化效率，明显缩短了转化周期，且游离酶转化体系中无需引入其他物质，降低了后续提取工序的成本。

Claims (9)

1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基（含10-100mg/L氨苄青霉素），培养至OD600=1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为0.1-1mM，诱导温度为15-30℃，发酵培养18-38h得发酵液；
b.破壁：发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min，收集菌体，并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；
c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；
d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中，同时加入0.01%-0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子，在100-500rpm震荡条件下进行游离酶转化。
2.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于a步骤所述的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于a步骤所述的发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl 4-15g/L，pH至7.0。
4.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于b步骤所述的磷酸缓冲液为发酵液体积10-20%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）。
5.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于b步骤所述的高压均质机破壁条件为500-1000bar的压力下处理10-40min。
6.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于d步骤所述的特定溶剂包括乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种的组合，特定溶剂中维生素D3的浓度为5-20%。
7.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于d步骤所述的维生素D3在粗酶液中的终浓度为0.5-5g/L。
8.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于d步骤所述的维生素D3羟化酶的辅因子为NADH、NADPH、维生素C、细胞色素C、铜盐和铁盐中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于d步骤所述的转化温度为20-40℃、转化周期为24-48h。
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