CN110396527B - 一种维生素d3羟化酶转化生产25-羟基维生素d3的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以维生素D3为底物通过酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法,该方法按如下步骤进行:a.发酵:产维生素D3羟化酶的大肠杆菌经IPTG诱导后培养18‑38h;b.破壁:发酵液通过离心收集大肠杆菌,并加入发酵液体积30%‑100%的纯水洗菌体,用磷酸盐缓冲液重悬菌体后通过高压均质机进行破壁处理;c.粗提:将b步骤获得的破壁液离心收集上清液,获得维生素D3羟化酶粗酶液;d.转化:用特定溶剂溶解维生素D3,加入到c步骤获得的粗酶液中,使得维生素D3的终浓度达到0.5‑5g/L,并加入该羟化酶的辅因子,于20‑40℃条件下,转化24‑48h。经HPLC检测,维生素D3的转化率达到80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其是一种以维生素D3为底物通过游离的维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法。
背景技术
25-羟基维生素D3,又称骨化二醇,是活性维生素D3 类药物的代表之一,于1995年获得美国食品药品管理局(FDA)认证,已载入美国药典USP36-NF31和欧洲药典(EP)8.0。临床上主要用于治疗骨紊乱、代谢性骨疾病等,尤其适合肾功能正常而肝功能丧失不全的患者使用。
目前生产25-羟基维生素D3的常用方法有化学合成法与生物转化法。化学合成25-羟基维生素的方法相当丰富,但路线反应步骤多,往往需要多步的保护与脱保护,分离纯化复杂,收率低,这些因素导致了化学法合成出的25-羟基维生素D3产品价格高昂,难以适应市场需要,且面临原料和试剂成本高、环境污染严重等问题。生物转化法能完成一些化学合成难以进行的反应,具有较强的区域选择性和立体选择性,在温和均一的条件下容易实现自动化和反应的重现性,且能耗低,对环境的污染小。
近年来对微生物催化维生素D3的羟基化研究逐渐热门,构建高效表达维生素D3羟化酶的基因工程菌,以维生素D3为底物进行生物转化获得25-羟基维生素D3是目前生物转化法的主流方向。由于维生素D3羟化酶属于胞内酶,该酶和电子传递链相关的蛋白均位于细胞质或细胞质膜,细胞壁及细胞膜会阻碍底物和产物在细胞内外的交换,羟基化产率较低。因此在发酵液直接转化或者静息全细胞转化时,需加入β-环糊精与表面活性剂等作用于细胞膜、细胞壁和底物的物质以增加转化效率,但是这些物质的引入,势必为后序的提取精制增加负担。因此在目前研究基础上,提高底物转化率、缩短转化周期、精简后提取步骤仍是生物转化法生产25-羟基维生素D3亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有生物转化法的不足,提供一种游离酶转化生产25-羟基维生素D3的技术,将大肠杆菌破壁后获得游离的维生素D3羟化酶,以维生素D3为底物,添加酶转化所需辅因子,使得底物转化率大于80%,转化周期缩短至24-48h。本发明提供的游离酶转化技术能有效的提高转化率、明显缩短转化周期、降低后续提取成本。
具体的, 本发明的目的可通过如下技术措施来实现:
该方法按如下步骤进行:
a.发酵:在发酵培养基(含10-100mg/L氨苄青霉素)中接入大肠杆菌进行培养,初始培养温度为30-40℃,培养至OD600=1-5时加入终浓度为0.1-1mM的IPTG作为诱导剂,诱导温度为15-30℃,在转速为200-400rpm的条件下培养18-38h得到大肠杆菌发酵液;
所述发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L,酵母提取物1-10g/L,NaCl 4-15g/L,pH至7.0;
b.破壁:发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min,收集大肠杆菌,并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次,用发酵液体积10-20%的0.2M的磷酸缓冲液(pH7.2)重悬菌体,菌液通过高压均质机在500-1000bar的压力下破壁处理10-40min,使细胞破碎率达到95%以上;
c.粗提:将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min,收集上清液,获得维生素D3羟化酶粗酶液;
d.转化:用特定溶剂(包括乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种的组合)配制5-20%维生素D3溶液,缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中,同时加入终浓度为0.01%-0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子(包括:包括NADH、NADPH、维生素C、细胞色素C、铜盐和铁盐中的一种),在100-500rpm震荡条件下进行游离酶转化,转化温度为,20-40℃,转化时间为24-48h。
所述游离酶转化生产25-羟基维生素D3,经上述方法转化后, 取1mL转化液,加入99mL甲醇,充分混匀后,过0.45μm有机滤膜,采用高效液相色谱法进行维生素D3和25羟基维生素D3的测定。色谱条件如下:色谱柱为Inertsil ODS-3 ( 4.6 mm×250mm,5 μm)、柱温30℃、波长264nm、流动相为甲醇:水= 95:5、流速1mL/min。根据标准曲线回归方程,计算样品中维生素D3和25-羟基维生素D3的量,计算转化率。
本发明的有益效果在于:
(1)首次采用游离酶法生产25-羟基维生素D3,大幅度增加了酶转化效率,转化率达80%以上,转化周期缩短至24-48h。
(2)破壁后,解除了细胞壁和细胞膜的屏障作用,底物能更加高效的结合到维生素D3羟化酶的结合位点上,转化体系中底物浓度提高至0.5-5g/L。
(3)游离酶转化体系中无需加入表面活性剂,因而避免了其对维生素D3羟化酶活力的影响,并且降低了后续提取工序的成本。
附图说明:
图1为本发明方法技术路线示意图。
具体实施方式:
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围,参考图1,本发明提供了以下实施例:
实施例1:
大肠杆菌的发酵培养
斜面培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,琼脂粉15g/L。pH至7.0。
发酵培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L。pH至7.0。
取新鲜斜面培养物1环接种于在发酵培养基,加入过滤除菌后的氨苄青霉素,使得发酵培养基中氨苄青霉素的终浓度为50mg/L,于37℃,200rpm条件下,培养至OD600=2时,加入终浓度为0.5mM的IPTG(过滤除菌)作为诱导剂,28℃进行诱导产酶,培养24h后得到大肠杆菌菌液。
实施例2:
游离酶法转化生产25-羟基维生素D3
取500mL发酵液,6000rpm离心5min,收集菌体,加入发酵液体积100%的纯水洗菌体1次,加入0.2M的磷酸缓冲液(pH7.0)100mL,制成菌悬液。通过高压均质机在600bar的压力下破壁处理20min,此时大肠杆菌破壁率达到99%。将破壁液以8000rpm的转速离心3min,收集上清液,即维生素D3羟化酶的粗酶液。取50mg维生素D3溶解于1mL乙酸乙酯溶液,缓慢加入到粗酶液中,并分别加入10mg的NADPH,混合均匀后,在300rpm震荡条件下进行酶转化,转化温度为30℃,转化时间为48h。
经上述方法转化后,通过HPLC方法进行检测,25-羟基维生素D3的产量为445mg/L,维生素D3的转化率为81.7%。
实施例3:
游离酶法转化生产25-羟基维生素D3
取1L发酵液,8000rpm离心5min,收集菌体,加入发酵液体积50%的纯水洗菌体3次,加入0.2M的磷酸缓冲液(pH7.0)100mL,制成菌悬液。通过高压均质机在800bar的压力下破壁处理30min,此时大肠杆菌破壁率达到98.5%。将破壁液以10000rpm的转速离心1min,收集上清液,即维生素D3羟化酶的粗酶液。取50mg维生素D3溶解于1mL乙醇溶液,缓慢加入到粗酶液中,并加入10mg的NADH,混合均匀后,在250rpm震荡条件下进行酶转化,转化温度为35℃,转化时间为24h。
经上述方法转化后,通过HPLC方法进行检测,25-羟基维生素D3的产量为462mg/L,维生素D3的转化率为84.8%。
实施例4:
三种生物转化方法的比较
制备3L大肠杆菌发酵液,分3份,以0.5g的维生素D3为底物,分别通过发酵液转化法、静息细胞转化法、游离酶转化法来制备25-羟基维生素D3。比较提取率、25-羟基维生素D3产量、转化周期。比较结果如下表:
转化方法 | 转化液体积 | 25-羟基维生素D3产量 | 转化率 | 转化周期 | 备注 |
游离酶法 | 100mL | 462mg/L | 84.8% | 24h | 添加0.01%辅因子NADH |
发酵液法 | 1000mL | 25.6mg/L | 47.0% | 72h | 添加0.1%β-环糊精、0.1%吐温-80 |
静息细胞法 | 100mL | 365mg/L | 67.1% | 120h | 添加0.1%β-环糊精、0.1%吐温80 |
三种转化方法经过对比发现,本发明提供的游离酶转化生产的25-羟基维生素D3的方法,大幅度增加了酶转化效率,明显缩短了转化周期,且游离酶转化体系中无需引入其他物质,降低了后续提取工序的成本。
Claims (4)
1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法,其特征在于该方法按如下步骤进行:
a.发酵:将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入含10-100mg/L氨苄青霉素的发酵培养基中,培养至OD600=1-5时加入IPTG进行诱导产酶,其中IPTG的终浓度为0.1-1mM,诱导温度为15-30℃,发酵培养18-38h得发酵液;
b.破壁:发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min,收集菌体,并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次,用发酵液体积10%-20%的0.2M磷酸缓冲液重悬菌体,其中磷酸缓冲液的pH值为7.2,菌液通过高压均质机进行机械破壁,破壁条件为500-1000bar的压力下处理10-40min,获得细胞破壁液;
c.粗提:将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min,收集上清液,获得维生素D3羟化酶粗酶液;
d.转化:用特定溶剂溶解维生素D3,所述的特定溶剂为乙酸乙酯或乙醇,缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中,维生素D3在粗酶液中的终浓度为0.5g/L,同时加入0.01%-0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子,在100-500rpm震荡条件下进行游离酶转化,转化温度为20-40℃,转化周期为24-48h。
2.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法,其特征在于a步骤所述的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法,其特征在于a步骤所述的发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L,酵母提取物1-10g/L,NaCl 4-15g/L,pH至7.0。
4.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法,其特征在于d步骤所述的维生素D3羟化酶的辅因子为NADH、NADPH、维生素C、细胞色素C、铜盐和铁盐中的一种。
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