CN110376170B - 基于cb7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法，包括步骤：取水样，加入恩诺沙星使其呈不同浓度，调节pH至3.0‑5.0，加入CB7，混合均匀，避光放置至少15min后得到待测溶液，用荧光分光光度计分别检测待测溶液以及同等条件下未加入CB7的待测溶液在激发波长278nm下发射波长445nm处发射峰的荧光强度，分别对应记做CB7增敏荧光强度、未增敏荧光强度，基于恩诺沙星与CB7作用后荧光光度的增强制作标准曲线，用于测定恩诺沙星含量。该方法对恩诺沙星具有很好的选择性，检测过程需要时间短，能够快速测定，操作简单，对检测人员的要求不高且能够实现对水中恩诺沙星的定量检测，利于大范围的推广应用。

Description

基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法
技术领域
本发明涉及抗生素的检测技术领域，具体涉及一种基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法。
背景技术
喹诺酮类抗生素作为一类广谱抗菌药物，被大量用于治疗和预防畜禽及水生动物疾病以及促进其生长。但所使用的药物能够被目标动物吸收的只有20％-30％，其余部分通过不同途径进入环境，通过食物链参与循环，对生态环境和人类健康造成威胁和伤害。
恩诺沙星作为最常用的喹诺酮类药物之一，广泛用于畜禽养殖中。给药的途径主要包括：与饲料混合给药和养殖饮用水给药。根据农业部176号公告，我国已经禁止了部分药物品种在动物饮用水中的使用，明确规定在蛋鸡产蛋期禁止使用恩诺沙星，但是鸡蛋中恩诺沙星检出率较高，严重影响了鸡蛋的产品质量安全，因此在蛋鸡养殖期间，有必要监测饮用水中是否添加恩诺沙星。目前针对水中恩诺沙星的检测方法主要有液-质联用法、高效液相色谱法、酶联免疫法等。例如：中国专利申请CN108760957A公开了一种养殖废水中恩诺沙星的前处理及含量测定的方法，其包括过滤净化柱串联固相萃取柱的养殖废水前处理装置，含量测定方法包括前处理、富集、洗脱和HPLC-MS/MS检测，可检测养殖废水中兽药抗生素恩诺沙星，该方法可在短时间内对兽药抗生素恩诺沙星进行快速的分离检测。中国专利申请CN101696964A公开了一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，包括：将预处理后的水样通过活化的固相萃取柱，再用Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空，最后用浓氨体积百分比浓度为6％的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次0.5-2mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.1-0.4mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品，进行HPLC-荧光检测。中国专利申请CN108414654A公开了一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法，首先利用反相/离子交换混合模式色谱填料的固相萃取柱对预处理后的水样浓缩富集，然后利用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)进行分析检测，最后，根据样品的分析色谱图以及每种抗生素的标准工作曲线确定水样中喹诺酮类抗生素的浓度。中国专利申请CN107561187A公开了一种同步检测污染水体中多种抗生素的方法，包括步骤：(1)将待测污染水体固液分离后取上清液进行膜过滤，之后调节滤液的pH值至X，X为3.5-4间的任意值；(2)将调节pH值后的滤液过HLB柱进行富集，过柱完成后萃取得到抗生素的洗脱液；(3)采用高效液相色谱串联质谱法对抗生素的含量进行检测。现有的针对水中恩诺沙星的液-质联用检测法、高效液相色谱检测法多具有操作复杂、对检测人员的要求高、检测成本高、不利于大范围的推广应用等缺点。酶联免疫法虽然能够快速检测、对检测人员的要求不高，但其多为定性检测。
目前常规检测仪器例如荧光分光光度计的普及率较高，其具有操作简单方便、对检测人员的要求不高、检测快速等特点，因此，建立一种利用常规检测仪器例如荧光分光光度计快速、定量检测养殖用水(例如动物养殖饮用水)中恩诺沙星的检测方法尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法，该方法操作简便、快速、对检测人员的要求不高且能够实现对水中恩诺沙星的定量检测，利于大范围的推广应用。
本发明发现，葫芦[7]脲(CB7)对恩诺沙星具有很好的选择性，对喹诺酮类药物中的其他药物增敏作用不强，可以在结构类似的同类药物中对恩诺沙星产生特异性荧光增敏，对其他类别抗生素药物无增敏作用，基于该发现提供了一种养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法。
一种基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法，包括步骤：
取水样，加入恩诺沙星使恩诺沙星呈不同浓度(得到一系列恩诺沙星呈不同不浓度的水样)，调节pH至3.0-5.0(优选4.0)，加入CB7，混合均匀，避光放置至少15min后得到待测溶液，用荧光分光光度计检测待测溶液以及同等条件下未加入CB7的待测溶液在激发波长278nm、发射波长445nm处发射峰的荧光强度，分别对应记做CB7增敏荧光强度、未增敏荧光强度，基于恩诺沙星浓度及恩诺沙星与CB7作用后荧光光度的增强幅度(即增强值)制作标准曲线，用于测定水体中恩诺沙星含量。
CB7本身没有荧光；对于不加CB7的恩诺沙星荧光测定法，由于结构类似的喹诺酮类药物具有相似的荧光激发与发射波长，此条件下(不加CB7)恩诺沙星荧光分光光度法的测定不具有特异性；本发明基于CB7对恩诺沙星的特异性荧光增敏作用，而对其他喹诺酮类抗生素的荧光增敏作用不显著，且对磺胺类等常用抗生素的荧光增敏也不显著，可以很大程度排除其他抗生素的测定干扰，且不需要借助色谱进行分离，可实现快速筛查。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述基于恩诺沙星浓度及恩诺沙星与CB7作用后荧光光度的增强幅度制作标准曲线，具体为：以恩诺沙星浓度为横坐标、以此恩诺沙星浓度下CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值为纵坐标绘制标准工作曲线。例如，标准工作曲线：y＝3502.6x+4.9883，r2＝0.9992。
所述待测溶液中CB7的浓度为大于等于(≥)10μmol/L，从节约试剂、降低检测成本等角度考虑，待测溶液中CB7的浓度优选为10μmol/L。
所述快速测定方法的检出限为0.00015μmol/L。所述检出限等于三倍空白样品11次测定值的标准偏差除以标准工作曲线斜率。
所述pH用酸调节，所述的酸可选用盐酸等酸性pH调节剂。
所述葫芦[7]脲的结构式如下：
Figure BDA0002116869100000031
本发明所用的原料均可选用市售产品。
本发明具有以下有益效果：
与现有技术相比，本发明方法检测过程需要时间短，能够快速测定，操作简单，对检测人员的要求不高且能够实现对水中恩诺沙星的定量检测，利于大范围的推广应用。利用CB7对恩诺沙星的荧光增敏作用，检测其荧光强度变化大小，对恩诺沙星的浓度进行定量。检出限可以达到0.00015μmol/L，满足对动物养殖用水中恩诺沙星含量检测要求。
本发明方法对恩诺沙星具有很好的选择性，对喹诺酮类药物中的其他药物增敏作用不强(见对比例2-4)，可以在同类药物中对恩诺沙星产生特异性荧光增敏，对其他类别抗生素药物无增敏作用(见对比例1)。本发明提出的利用CB7增敏测定恩诺沙星的方法具有特异性和专一性(见对比例1-6)。
附图说明
图1为不同pH条件下CB7对恩诺沙星荧光强度的影响图；
图2为不同CB7浓度对恩诺沙星荧光强度的影响图；其中，Wavelength为波长，Concentration of CB7为CB7的浓度，Fluorescence intensity为荧光强度；
图3为加入CB7前后恩诺沙星浓度与荧光强度的参考标准曲线图；
图4为本发明恩诺沙星浓度与荧光强度变化量(相同恩诺沙星浓度下CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值)的标准工作曲线。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
(1)确定恩诺沙星最佳荧光激发波长为278nm，发射波长为445nm。
选取两个不同激发波长进行扫描，根据荧光发射波长不随激发波长变化而变化的特点，记录出峰位置不变的荧光发射峰，然后在此发射波长下进行扫描，记录最大出峰波长为最佳荧光激发波长。最终确定本发明中恩诺沙星最佳荧光激发波长为278nm，发射波长为445nm。
(2)确定水样的pH，优化结果可使恩诺沙星加入CB7后于445nm波长处的荧光强度显著提升。取多个水样，分别加入相同含量的恩诺沙星和CB7，使用盐酸或氢氧化钠溶液调节水样pH范围：1-11，记录未加入CB7及加入CB7后水样中恩诺沙星的荧光强度差异。如图1，最终确定在pH＝3.0-5.0(最佳pH＝4)时，水样中恩诺沙星在加入CB7后，荧光强度有显著提高。
(3)确定水样中CB7的加入量，最终确定CB7的最佳浓度为10μmol/L，可显著提高恩诺沙星在445nm波长处的荧光强度。在标准曲线范围内分别添加恩诺沙星高中低三档浓度并保持不变，改变CB7加入浓度，通过测定荧光响应值，发现水样中CB7浓度大于等于10μmol/L时，三档恩诺沙星添加浓度下的荧光响应值均为最大。考虑经济原因，最终确定水样中CB7的最佳浓度为10μmol/L。图2为中档添加浓度下，改变CB7加入浓度时记录的荧光响应值。
(4)制作标准曲线：
a.在pH＝4条件下，在水样中分别添加恩诺沙星，使恩诺沙星浓度分别为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.02μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L。将上述一系列溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计测定，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作未增敏荧光强度，绘制未加入CB7水样中恩诺沙星荧光强度参考标准曲线y＝5599.5x+8.3453，r2＝0.9998，如图3。
b.在pH＝4条件下，在水样中分别添加恩诺沙星与CB7，使恩诺沙星一系列浓度与a中对应，且CB7浓度均为10μmol/L。将溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度，绘制加入CB7后的恩诺沙星荧光强度参考标准曲线y＝9102.1x+13.334，r2＝0.9999，如图3。
c.以恩诺沙星浓度为横坐标、以相同恩诺沙星浓度下CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值为纵坐标绘制标准工作曲线：y＝3502.6x+4.9883，r2＝0.9992，如图4所示。
如图3所示，CB7存在下不同浓度恩诺沙星的荧光强度均有提升，且加入CB7后恩诺沙星浓度与荧光强度的斜率(即标准曲线的斜率)比未加入CB7标准曲线的斜率增强了1.63倍，表明CB7对恩诺沙星的荧光增敏作用显著，且线性良好。
实施例1
取水样，添加恩诺沙星至其浓度为0.002μmol/L，得到待测水样。
取40mL待测水样用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL(其中，CB7终浓度为10μmol/L)，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm发射波长处发射峰的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度。
另取恩诺沙星浓度为0.002μmol/L的40mL待测水样，用盐酸溶液调节pH为4.0，加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm发射波长处发射峰的荧光强度，记作未增敏荧光强度。
将CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值代入标准工作曲线，结合稀释倍数计算，得到恩诺沙星的浓度为0.0018μmol/L，测定三次，平均回收率为90％，相对标准偏差(RSD)为4.91％。
实施例2
取水样，添加恩诺沙星至其浓度为0.02μmol/L，得到待测水样。
取40mL待测水样用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL(其中，CB7终浓度为10μmol/L)，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度。
另取恩诺沙星浓度为0.02μmol/L的40mL待测水样，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作未增敏荧光强度。
将CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值代入标准工作曲线，结合稀释倍数计算，得到恩诺沙星的浓度为0.019μmol/L，测定三次，平均回收率为95％，RSD为5.11％。
实施例3
取水样，添加恩诺沙星至其浓度为0.1μmol/L，得到待测水样。
取40mL待测水样用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL(其中，CB7终浓度为10μmol/L)，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度。
另取恩诺沙星浓度为0.1μmol/L的40mL待测水样，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录278nm激发波长下，445nm处发射峰的荧光强度，记作未增敏荧光强度。
将CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值代入标准工作曲线，结合稀释倍数计算，得到恩诺沙星的浓度为0.096μmol/L，测定三次，平均回收率为96％，RSD为3.12％。
对比例1
将水样中恩诺沙星替换成其它抗生素(定容后CB7浓度为10μmol/L)，其余操作同实施例1，测定CB7增敏荧光强度和未增敏荧光强度。
所述其它抗生素选择金霉素、土霉素、强力霉素、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、链霉素、卡那霉素、庆大霉素中的一种。
在恩诺沙星激发波长278nm下分别检测对比例1中处理过的样品，记录恩诺沙星荧光发射波长范围附近(400-500nm)的荧光强度，结果表明对比例1中，与未加入CB7的水样相比，加入CB7后荧光强度无显著差异，表明CB7不能对对比例1中添加的药物金霉素、土霉素、强力霉素、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、链霉素、卡那霉素和/或庆大霉素产生明显的荧光增敏，进而说明本发明的方法具有很好的选择性，可以排除磺胺类、四环素类、氨基糖苷类抗生素的干扰，对恩诺沙星具有特异选择性，可以用于实际样品的测定。
上述抗生素在pH＝4条件下添加CB7前后均无荧光，在恩诺沙星激发波长下荧光发射波长处测定记录荧光强度，可以确定这些抗生素对发明中要检测的波长处的荧光强度不造成干扰。
对比例2
取水样，添加适量氧氟沙星，分别得到氧氟沙星浓度为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L的5种待测水样。
5种待测水样各取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL，使CB7浓度为10μmol/L，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录激发波长278nm下，最大发射波长488nm处的荧光强度，记做CB7增敏荧光强度。
5种待测水样各另取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录氧氟沙星最佳激发波长278nm下，最大发射波长488nm处的荧光强度，记做未增敏荧光强度。
以氧氟沙星浓度为横坐标、以此氧氟沙星浓度下CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值为纵坐标绘制标准工作曲线：y＝103.7x+5.542，r2＝0.9966。
对比例3
取水样，添加适量环丙沙星，分别得到环丙沙星浓度为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L的5种待测水样。
5种待测水样各取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL，使CB7浓度为10μmol/L，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录环丙沙星于激发波长278nm下，最大发射波长450nm处的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度。
5种待测水样各另取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录环丙沙星于激发波长278nm下，最大发射波长450nm处的荧光强度，记做未增敏荧光强度。
以环丙沙星浓度为横坐标、以此环丙沙星浓度下CB7增敏荧光强度与未增敏荧光强度的变化值为纵坐标绘制标准工作曲线：y＝127.8x+3.36，r2＝0.9943。
对比例4
取水样，添加适量诺氟沙星，分别得到诺氟沙星浓度为0.001μmol/L、0.005μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L的5种待测水样。
5种待测水样各取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB7水溶液，加水定容至50mL，使CB7浓度为10μmol/L，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录诺氟沙星于激发波长278nm下，最大发射波长443nm处的荧光强度，记作CB7增敏荧光强度。
5种待测水样各另取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录诺氟沙星于激发波长278nm下，最大发射波长443nm处的荧光强度，记作未增敏荧光强度。
以诺氟沙星浓度为横坐标、以此诺氟沙星浓度下CB7增敏荧光强度与未增敏荧光强度的变化值为纵坐标绘制标准工作曲线：y＝-410.72x+6.5901，r2＝0.9858。
将对比例2-4中得到的标准工作曲线与本发明方法中建立的恩诺沙星的标准工作曲线进行比较，恩诺沙星添加CB7前后荧光强度变化的标准工作曲线斜率均显著高于对比例2中氧氟沙星标准工作曲线斜率、对比例3中环丙沙星标准工作曲线斜率，本发明中恩诺沙星标准工作曲线的斜率是对比例2中氧氟沙星标准工作曲线斜率的33.8倍、是对比例3中环丙沙星标准工作曲线斜率的27.4倍；且对比例4中诺氟沙星标准工作曲线斜率<0，表明诺氟沙星添加CB7后荧光猝灭且猝灭现象明显。结果表明CB7不能对对比例2-4中添加的药物造成明显的荧光增敏，进而说明本发明方法具有很好的选择性，可以在同类药物中对恩诺沙星产生特异性荧光增敏。
对比例5
取水样，添加适量氧氟沙星，得到氧氟沙星浓度为0.002μmol/L的待测水样。
待测水样取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L葫芦[8]脲(CB8)水溶液，加水定容至50mL，使CB8浓度为10μmol/L，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录氧氟沙星最佳激发波长293nm下，488nm处最大发射峰的荧光强度，记作CB8增敏荧光强度。
待测水样另取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录氧氟沙星最佳激发波长293nm下，最大发射波长488nm处的荧光强度，记做未增敏荧光强度。
对比例6
取水样，添加适量恩诺沙星，得到恩诺沙星浓度为0.002μmol/L的待测水样。
待测水样取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，添加2.5mL 200μmol/L CB8水溶液，加水定容至50mL，使CB8浓度为10μmol/L，摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录最佳激发波长278nm下，最大发射波长445nm处的荧光强度，记做CB8增敏荧光强度。
待测水样另取40mL，用盐酸溶液调节pH为4.0，直接加水定容至50mL。将定容后的溶液摇匀，避光放置15分钟后用荧光分光光度计检测，记录最佳激发波长278nm，最大发射波长445nm处的荧光强度，记做未增敏荧光强度。
对比例5中，添加CB8后氧氟沙星荧光强度有明显增大，添加CB8前后的荧光相应值的比值为2.9(CB8增敏荧光强度与未增敏荧光强度的差值显著大于对比例2中氧氟沙星浓度为0.002μmol/L时CB7增敏荧光强度与未增敏荧光强度的差值)，与对比例2中的结果进行对比发现，CB8对氧氟沙星有很强的荧光增敏作用，而CB7对氧氟沙星荧光增敏效果不明显；对比例6中，添加CB8后，恩诺沙星荧光强度无显著增强，与本发明中得到的结果对比发现，CB8对恩诺沙星荧光增敏效果不明显，而CB7对恩诺沙星有很强的荧光增敏作用。表明CB7和CB8对喹诺酮类药物的荧光增敏作用效果有显著差异，本发明提出的利用CB7增敏测定恩诺沙星的方法具有特异性和专一性。
本发明方法中参数的变化并不影响水样中恩诺沙星的检测，因此本发明方法中任意参数的组合均可实现水样中恩诺沙星的检测。在此不再赘述。

Claims (3)

1.一种基于CB7的养殖用水中恩诺沙星的快速测定方法，其特征在于，包括步骤：
取水样，加入恩诺沙星使恩诺沙星呈不同浓度，调节pH至4.0，加入CB7，混合均匀，避光放置至少15min后得到待测溶液，用荧光分光光度计分别检测待测溶液以及同等条件下未加入CB7的待测溶液在激发波长278nm、发射波长445nm处发射峰的荧光强度，分别对应记做CB7增敏荧光强度、未增敏荧光强度，以恩诺沙星浓度为横坐标、以此恩诺沙星浓度下CB7增敏荧光强度减去未增敏荧光强度的差值为纵坐标绘制标准工作曲线：y=3502.6x+4.9883，r²=0.9992，用于测定水体中恩诺沙星含量；
所述待测溶液中CB7的浓度为大于等于10μmol/L。
2.根据权利要求1所述的快速测定方法，其特征在于，所述待测溶液中CB7的浓度为10μmol/L。
3.根据权利要求1所述的快速测定方法，其特征在于，所述快速测定方法的检出限为0.00015μmol/L。
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