CN114609112A - 一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法 - Google Patents

一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，采用荧光光谱仪测定加有荧光探针BSA‑AuNCs、表面活性剂的待测溶液的荧光强度，与BSA‑AuNCs的荧光强度相比，如670nm处的红色荧光有降低，525nm处的绿色荧光强度有增强，则待测溶液含有MTC和/或DC成分。本发明的检测方法具有操作简便，快速，灵敏度高、选择性好、检测限低、成本低等优点，不需要大型仪器设备和专业的操作人员，在实际水样的检测中具有良好的加标回收率，检测结果可靠，具有很好的实用性。

Description

一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法
技术领域
本发明涉及四环素类抗生素的检测技术领域，具体涉及简单快速、高灵敏检测四环素类抗生素美他环素和/或强力霉素的方法。
背景技术
美他环素(MTC)和强力霉素(DC)属于半合成四环素类抗生素(TCs)，抗菌谱与四环素(TC)相似，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、立克次体等均有抑制作用。MTC又叫甲烯土霉素，DC又叫脱氧土霉素或多西环素，其结构式非常相似。与TC相比，MTC和DC的作用范围更广，抗菌活性更强，更容易被细胞吸收。MTC和DC与TCs的其他抗生素存在交叉耐药性，由于四环素类抗生素的广泛应用，临床常见病原菌对TCs也有较强的耐药性。目前，环境中的TCs主要来源于畜禽养殖、医院、药厂排污等。过量的TCs进入环境后影响土壤黏粒、水体环境、微生物生存，进而影响生态系统等。环境中的TCs会通过食物链或食物网进入人体，过量的TCs会引发人体的肝毒性及消化系统的反应、对骨骼和牙齿生长产生影响、产生过敏反应及形成耐药菌等。欧盟和中国对动物源性食品中TCs的限量作了规定，其中TCs在肌肉中最高限值(MRLs)为100μg/kg，肝脏中MRLs为300μg/kg，肾脏中MRLs为600μg/kg，牛奶中规定MRLs为100μg/L(相当于225nmol/L)。
TCs的检测方法主要分为传统检测方法和快速检测方法等，传统检测方法如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法、微生物检测法、酶联免疫法等。快速检测方法中传感器检测方法最为常见，如比色法、表面增强拉曼光谱法、毛细管电泳法、电化学法、荧光法等。传统的方法虽然普遍使用且灵敏精确，但它们大多无法将单一的抗生素从TCs中区分出来，而且需要较长的前处理时间、复杂的样品制备、昂贵的仪器、专业的技术操作人员等。因此，开发一种可以快速灵敏检测TCs的传感器具有重大意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速、灵敏度高、特异性好的检测MTC和/或DC方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，采用荧光光谱仪测定加有荧光探针BSA-AuNCs、表面活性剂的待测溶液的荧光强度，与BSA-AuNCs的荧光强度相比，如670nm处的红色荧光有降低，525nm处的绿色荧光强度有增强，则待测溶液含有MTC和/或DC成分。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，在待测定体系中加入的表面活性剂为Tween 20。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，Tween 20的浓度为0.08％。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，在待测定体系中还加入Ca2 +。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，在待测定体系中加入Ca2+的浓度为50μmol/L。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，步骤如下：
1)荧光探针BSA-AuNCs的制备；
2)MTC/DC标准浓度梯度曲线绘制；
配制不同浓度的MTC或DC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+，pH10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图；MTC的线性回归方程为y＝0.0006ln(x)+0.0061；DC的线性回归方程为y＝0.1951x+0.0003；
3)待测体系的检测；
采用与步骤2)相同的检测方法测定待测体系的ΔF525/F670值，用步骤2)的曲线计算出待测体系中的MTC和/或DC的浓度。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，MTC的线性浓度范围为5.0～200nmol/L，检出限为0.064nmol/L。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，DC的线性浓度范围为0.5～10nmol/L；检出限为0.31nmol/L。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，控制待测定体系的pH值为10。
所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，步骤如下：
1)荧光纳米材料BSA-AuNCs的制备；
2)标准浓度梯度曲线绘制；
A)基于Tween20和BSA-AuNCS检测MTC的曲线
配制不同浓度的MTC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20的10mmol/L，pH 10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图，线性回归方程为y＝0.0008ln(x)+0.0058；
B)基于Tween20、钙离子和BSA-AuNCS检测MTC或DC的曲线
配制不同浓度的MTC或DC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L的10mmol/L，pH 10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图；MTC的线性回归方程为y＝0.0006ln(x)+0.0061；DC的线性回归方程为y＝0.1951x+0.0003；
3)待测体系的检测；
采用与步骤2)相同的检测方法测定待测体系的ΔF525/F670值，用步骤2)的曲线计算出待测体系中的MTC或DC的浓度。
所述的基于Tween20和BSA-AuNCS检测MTC的方法，线性浓度检测范围为1.0～200nmol/L，检出限为0.88nmol/L，明显低于中国和欧盟对动物源性食品中规定的MRLs值。
所述的检测TCs的方法，荧光纳米材料BSA-AuNCs的制备过程为：将30mL 50mg/mL的BSA溶液及30mL 10mmol/L的HAuCl4溶液加入到锥形瓶中，使用磁力搅拌器在室温黑暗条件下搅拌2-5min，用1mol/L的NaOH调pH至12，将其置于空气恒温摇床中，37℃，220rpm黑暗条件下振荡12h后，溶液冷却后，先用0.45μm的微孔过滤器进行过滤，之后用10KDa超滤管进一步过滤纯化，得到亮棕色BSA-AuNCs，放置在4℃冰箱中密封保存。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本发明具有操作简便，快速，灵敏度高、选择性好、检测限低、成本低等优点，不需要大型仪器设备和专业的操作人员；
2)本发明使用的BSA-AuNCs具有独特的光学性能，低毒性和良好的生物相容性等特点；
3)本方法使用的Tween20和钙离子的混合均可以增强BSA-AuNCs检测MTC和DC的灵敏度；
4)目前大多数检测TCs的方法都不能将单一的TCs与同类抗生素进行区分，本发明能将MTC和DC与其他类常见抗生素区分，特异性更强；
5)本方法使用的含Tween20(不含钙离子)的检测体系，在待测液中的TCs的浓度低于5μmol/L时，能将MTC与DC区分；
6)本发明在实际水样的检测中具有良好的加标回收率，检测结果可靠。
附图说明
图1是比率型荧光传感器检测MTC和/或DC的工作原理图；
图2是制备的BSA-AuNCs的吸收光谱和荧光光谱图；
图3是Tween 20和钙离子分别对MTC和DC检测体系荧光影响图(激发波长为375nm)，其中A图是针对MTC，B图是针对DC；
图4是不同pH值对MTC/BSA-AuNCs体系荧光强度的影响光谱图；
图5A是不同表面活性剂对MTC荧光强度的影响光谱图；其中，缓冲液为BR(10mmol/L，pH＝10)，MTC的浓度为50μmol/L，表面活性剂的浓度为0.05％；图5B不同浓度的Tween20对MTC/BSA-AuNCs体系荧光影响的折线图；其中，缓冲液为BR(10mmol/L，pH＝10)；
图6是不同浓度的Mg2+和Ca2+对体系荧光影响的折线图；其中，图A为Mg2+，图B为Ca2 +，缓冲液为BR(10mmol/L，pH＝10，含0.08％Tween20)；
图7是MTC浓度与检测体系荧光强度差值(ΔF525/F670)的标准曲线图(含0.08％Tween 20)，插图为线性关系图；
图8是MTC和DC浓度与检测体系荧光强度差值(ΔF525/F670)的标准曲线图(含0.08％Tween 20，50μmol/L Ca2+)，插图为线性关系图，其中A图为MTC，B图为DC；
图9是三种不同检测体系，无Tween20和钙离子、Tween20、Tween20和钙离子，对MTC和DC荧光影响图，A图为MTC，B图为DC(10mmol/L BR缓冲液，pH＝10)；
图10是特异性图；图中，MTC、DC浓度为5μmol/L，其他抗生素的浓度均为10μmol/L(含0.08％Tween20，50μmol/L Ca2+)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。
实施例1BSA-AuNCs的制备和检测测定
1、BSA-AuNCs的制备
1)采用一锅法制备光学性能良好的BSA-AuNCs
将30mL 50mg/mL的BSA溶液及30mL 10mmol/L的HAuCl4溶液加入到锥形瓶中，使用磁力搅拌器在室温黑暗条件下搅拌2-5min，用1mol/L的NaOH调pH至12，将其置于空气恒温摇床中，37℃，220rpm黑暗条件下振荡12h。
2)BSA-AuNCs的预处理
溶液冷却后，使用0.45μm的微孔过滤器和100KDa超滤管将BSA-AuNCs进行过滤，滤除多余的BSA，得到亮棕色BSA-AuNCs，放置在4℃冰箱中密封保存。
2、检测测定
将所制备的BSA-AuNCs检测TCs：将BSA-AuNCs(体积用量为检测体系总体积的5％，下同)、含有MTC或DC的待测体系依次加入含0.08％的Tween20或/和50μmol/L Ca2+的BR缓冲液中，BR缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝10，充分混匀后，静置反应30min，用365nm的紫外灯照射并观察其颜色变化，使用荧光分析仪测定荧光光谱。
如图1所示，该比率型荧光传感器BSA-AuNCs检测MTC和DC的工作原理：在375nm的激发下，BSA-AuNCs在670nm处显示出红色发射，弱荧光物质TCs在525nm处显示出较弱绿色荧光(图2、图3)。向BSA-AuNCs加入MTC或DC后，670nm处的红色荧光略有降低，在525nm处的荧光强度有所增强。这是由于BSA和MTC或DC之间的络合反应，TCs猝灭AuNCs的荧光，与此同时，体系中的MTC和DC的荧光有所增强。向体系中加入表面活性剂以提高TCs在体系中的稳定性，其中非离子型表面活性剂Tween 20具有较好的效果，使525nm处的荧光有较明显的增强效果，尤其对MTC的效果更显著。向体系中再加入金属钙离子，钙离子与BSA-AuNCs中的BSA和TCs形成更稳定的络合物，使525nm处的荧光有更明显的增强效果(图3)。
3、检测体系pH值的确定
将MTC分别用不同pH值的BR缓冲液进行稀释，并检测其吸光度；设置pH 6、7、9、10，10mmol/L的BR缓冲液，分别向其中加入50μmol/L MTC，BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)，设置对照组和实验组(0和50μmol/L MTC)检测体系的荧光强度，如图4所示，当pH值为10时，体系ΔF525/F670的值最大，所以选择pH10的BR缓冲液。
4、检测体系的表面活性剂及浓度的确定
向MTC中分别加入0.05％的聚乙烯亚胺(PEI)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、曲拉通X-100(Triton X-100)及Tween 20，如图5A所示，相比于其它表面活性剂，非离子型表面活性剂的荧光增强效果较明显，其中Tween 20对MTC荧光增强效果最明显，且Tween 20属于非离子型表面活性剂，对体系中BSA-AuNCs的影响很小，所以选择Tween 20作为体系的荧光增敏剂。
在BR缓冲液(10mmol/L，pH 10)中设置浓度分别为0％、0.01％、0.03％、0.06％、0.08％、0.10％的Tween 20，其中加入BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)和MTC，设置对照组和实验组(0和10μmol/L MTC)，检测体系的荧光强度，如图5B所示，当Tween 20占BR缓冲液百分比大于0.08％时，体系ΔF525/F670的值逐渐达到饱和，所以选择0.08％的Tween 20的浓度。
5、检测体系的金属离子及浓度的确定
在含0.08％的Tween 20的BR缓冲液(10mmol/L，pH 10)中设置浓度分别为0、1、10、20、50、100、200、500μmol/L的Mg2+和0、1、10、20、50、100μmol/L的Ca2+，其中加入BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)和MTC，设置对照组和实验组(0和10μmol/L MTC)，检测体系的荧光强度，如图6所示，镁离子在所设浓度范围内没有明显的荧光增强效果(图6A)，而Ca2+对体系荧光增强效果较明显(图6B)，当Ca2+的浓度为50μmol/L时，体系ΔF525/F670的值最高，所以选择浓度为50μmol/L的Ca2+。
实施例2标准浓度梯度曲线绘制
1、MTC标准浓度梯度曲线绘制(BSA-AuNCs+Tween20体系)
配制不同浓度的MTC溶液，与BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)分别加入到含0.08％Tween 20的10mmol/L，pH 10的BR缓冲溶液中，使反应溶液中的MTC浓度分别为0、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μmol/L，室温下反应30min后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度。如图7所示，随着MTC浓度的升高，体系在525nm处的荧光强度逐渐增强，而670nm处的荧光强度略有降低。利用荧光强度比F525/F670的差值(ΔF525/F670)绘制线性关系曲线图，由此，在1～200nmol/L的范围内，ΔF525/F670与ln(x)具有良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.0008ln(x)+0.0058，检测限低至0.88nmol/L，明显低于中国和欧盟对动物源性食品中规定的MRLs值(最低约225nmol/L)。
2、MTC标准浓度梯度曲线绘制(基于BSA-AuNCs+Tween20+钙离子体系)
配制不同浓度的MTC标准溶液，与BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+的10mmol/L，pH10的BR缓冲溶液中，使反应溶液中的MTC浓度分别为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、8、10、12、15、20μmol/L；室温下反应30min后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度。如图8所示，随着MTC浓度的升高，体系在525nm处的荧光强度逐渐增强，而670nm处的荧光强度略有降低。利用荧光强度比F525/F670的差值(ΔF525/F670)绘制线性关系曲线图，由此，MTC的线性回归方程为y＝0.0006ln(x)+0.0061，在MTC浓度在5.0～200nmol/L的范围内，ΔF525/F670具有良好的线性关系，且检出限为0.064nmol/L。利用钙离子的检测体系，MTC的检测灵敏度比只含Tween20的体系提高了10倍以上，说明本体系的检测具有高灵敏的特点。
3、DC标准浓度梯度曲线绘制(基于BSA-AuNCs+Tween20+钙离子体系)
配制不同浓度的DC标准溶液，与BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+的10mmol/L，pH10的BR缓冲溶液中，使反应溶液中的DC浓度分别为0、0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、12μmol/L；室温下反应30min后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度。如图8所示，随着DC浓度的升高，体系在525nm处的荧光强度逐渐增强，而670nm处的荧光强度略有降低。利用荧光强度比F525/F670的差值(ΔF525/F670)绘制线性关系曲线图，由此，DC的线性回归方程为y＝0.1951x+0.0003；在DC浓度在0.5～10nmol/L的范围内，ΔF525/F670具有良好的线性关系，且检出限为0.31nmol/L。利用钙离子的检测体系，DC检出限低至0.31nmol/L，说明本体系的检测具有高灵敏的特点。
4、三种不同检测体系对MTC和DC的影响比较
分别配制BR缓冲液、含0.08％Tween 20的BR缓冲液、含0.08％Tween20和50μmol/LCa2+的BR缓冲液，依次加入BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)、不同浓度的MTC或DC(0、5、10μmol/L)，室温下反应30min后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度，考察三种不同体系对MTC和DC影响。如图9所示，Tween 20对MTC的影响较明显，而对DC影响不是很明显，因此本方法使用的含Tween20(不含钙离子)的检测体系，在待测液中的TCs的浓度低于5μmol/L时，能将MTC与DC区分。Tween 20和Ca2+对本体系检测MTC和DC都有明显的影响。
实施例3常见抗生素的特异性实验
向含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+的BR缓冲液中加入BSA-AuNCs(体积占总体积的5％)，再分别加入MTC、DC、TC、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、米诺环素(MIN)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NORF)、罗红霉素(ROX)、磺胺甲恶唑(SMX)(其中，DC和MTC的浓度为5μmol/L，其他抗生素浓度均为10μmol/L)，反应30min后，检测其荧光强度。
如图10所示，除TCs(MTC、DC、TC、CTC、OTC、MIN)外其他常见抗生素对该体系几乎没有干扰，相比于其他TCs，只有含MTC和DC时的ΔF525/F670的值最高，表明该体系对MTC具很好的选择性。
实施例4实际水样MTC的回收率实验
选取五种水样类型，采用只含Tween20的检测体系对实际水样中的MTC进行回收率实验：河水采样于南京林业大学紫湖溪；湖水采样于玄武湖和洪泽湖；矿泉水选取常见的瓶装饮用水农夫山泉品牌；自来水采样于南京林业大学自来水管道；以及实验室用超纯水。设定2μmol/L、4μmol/L为最终加标后各水样测量的MTC浓度，利用荧光光谱仪测量各水样样品的荧光强度，以超纯水作为对照组，重复三组实验。
如表1所示，此方法对矿泉水、自来水、河水、湖水等5种水样中的MTC的加标回收率较高，均分布在97％～108％之间，表明该体系在实际样本中对MTC的检测具有准确性和可靠性，可适用于各种环境中MTC的定性高灵敏检测。
表1不同水样的来源与回收率
Figure BDA0003585598570000091

Claims (10)

1.一种简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，采用荧光光谱仪测定加有荧光探针BSA-AuNCs、表面活性剂的待测溶液的荧光强度，与BSA-AuNCs的荧光强度相比，如670nm处的红色荧光有降低，525nm处的绿色荧光强度有增强，则待测溶液含有MTC和/或DC成分。
2.根据权利要求1所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，在待测定体系中加入的表面活性剂为Tween 20。
3.根据权利要求2所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，Tween 20的浓度为0.08％。
4.根据权利要求1所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，还在待测定体系中加入Ca2+。
5.根据权利要求1或4所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，在待测定体系中加入Ca2+的浓度为50μmol/L。
6.权利要求4所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，步骤如下：
1)荧光探针BSA-AuNCs的制备；
2)MTC/DC标准浓度梯度曲线绘制；
配制不同浓度的MTC或DC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+的10mmol/L，pH 10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图；MTC的线性回归方程为y＝0.00061n(x)+0.0061；DC的线性回归方程为y＝0.1951x+0.0003；
3)待测体系的检测；
采用与步骤2)相同的检测方法测定待测体系的ΔF525/F670值，用步骤2)的曲线计算出待测体系中的MTC和/或DC的浓度。
7.根据权利要求6所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，MTC的线性浓度范围为5.0～200nmol/L，检出限为0.064nmol/L。
8.根据权利要求6所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，DC的线性浓度范围为0.5～10nmol/L；检出限为0.31mol/L。
9.根据权利要求1-4任一项所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，控制待测定体系的pH值为10。
10.权利要求1-4任一项所述的简单快速检测美他环素和/或强力霉素的方法，其特征在于，步骤如下：
1)荧光纳米材料BSA-AuNCs的制备；
2)标准浓度梯度曲线绘制；
A)基于Tween20和BSA-AuNCS检测MTC的曲线
配制不同浓度的MTC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20的10mmol/L，pH 10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图，线性回归方程为y＝0.0008ln(x)+0.0058；
B)基于Tween20、钙离子和BSA-AuNCS检测MTC或DC的曲线
配制不同浓度的MTC或DC溶液，分别加入到含0.08％Tween 20和50μmol/L Ca2+，pH 10的BR缓冲溶液中，室温下反应后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度；利用荧光强度比F525/F670的差值ΔF525/F670绘制线性关系曲线图；MTC的线性回归方程为y＝0.00061n(x)+0.0061；DC的线性回归方程为y＝0.1951x+0.0003；
3)待测体系的检测；
采用与步骤2)相同的检测方法测定待测体系的ΔF525/F670值，用步骤2)的曲线计算出待测体系中的MTC或DC的浓度。
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