CN110368492A - 一种异质结光热试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型光热化疗联合治疗试剂及其制备方法和应用，该制备方法，包括步骤：(1)制备硫化钨纳米片；(2)制备近红外二区响应的石墨烯量子点；(3)将硫化钨纳米片与近红外二区响应的石墨烯量子点在磷酸缓冲盐溶液(pH＝8.0)中剧烈搅拌，将混合液进行离心处理，去除未结合的石墨烯量子点，即得近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结光热试剂。本发明所制备的异质结光热试剂具有较好的骨肉瘤治疗效果和诱导间充质干细胞成骨分化的效果，并且该纳米光热制剂生物相容性高、无毒性、不产生污染；且其制备工艺简单、成本较低，适用于规模生产和临床医疗使用。

Description

一种异质结光热试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种异质结光热试剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着科学技术的进步，许多不治之症都得到了有效遏制，但癌症仍然是难以攻克的世界性难题。骨肉瘤是来源于骨组织的恶性肿瘤，尽管在过去的几十年里，现有的治疗恶性肿瘤的药物取得了巨大的进步，但对于传统的治疗手段如手术、放疗和化疗，通常会导致恶性肿瘤的频繁复发、肿瘤细胞转移和破坏免疫系统。因此，大量的研究人员正致力于对低毒性、高效性的治疗策略的探究和研发。其中，光热疗法(PTT)是恶性肿瘤微创治疗的一种主要治疗途径。对于PTT，肿瘤细胞在适当的光照射下，由治疗试剂产生的过高热杀死肿瘤细胞，并且对其他组织没有副作用，是一种理想的治疗方式。

对于一种理想的PTT试剂，需要同时满足在近红外区域消光系数高、光热转换效率高、细胞毒性低等特点。在过去的十年中，人们探索了大量的PTT材料，如碳纳米材料、金纳米粒子、二氧化钛和聚合物纳米粒子等。然而，其中金纳米粒子昂贵的成本和一些有机光热剂的高毒性严重影响了它们的使用，因此，对能够增强协同效应的光热治疗体系仍有待进一步研发。石墨烯量子点是一种新兴的零维(0D)纳米材料，具有独特的光学性质，极小的尺寸，优异的生物相容性和化学稳定性，在癌症治疗方面有很大的应用潜力。二维(2D)层状过渡金属硫化物因其优异的光电、电子传导性能和适中的带隙而被广泛研究。在众多的过渡金属硫化物中，二硫化钨(WS₂)由于具有较高的比表面积、合适的带隙、出色的光热性能和对近红光较强的捕获能力，被认为是一种有前途的近红外光学材料之一。然而，它们相当低的光热转换效率需要较高的激光照射功率密度来完成肿瘤的消融，这限制了它们的PTT应用。

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有自我更新和包括向成骨细胞、软骨细胞等多向分化的能力。在临床中可以用作骨组织工程的种子细胞、与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。此外，间充质干细胞在神经系统修复等其它方面具有长远的应用和发展前景。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种异质结光热试剂及其制备方法和应用。

本发明提供了一种异质结光热试剂的制备方法，其通过将具有近红外二区响应的石墨烯量子点负载在硫化钨表面制备出一种石墨烯量子点/硫化钨异质结，克服了硫化钨纳米片低的光热转换效率的缺点，且其制备工艺简单、成本较低，适用于规模生产和临床医疗使用。

本发明还提供了一种上述方法制备的石墨烯量子点/硫化钨异质结光热试剂，其具有高的光热转换效率、优良的肿瘤细胞靶向性和生物相容性，同时硫化钨纳米片和石墨烯量子点复合的异质结在近红外二区有很强的吸收，不仅可作为一种良好的光热治疗试剂并且可以作为一种成骨细胞诱导分化试剂。

本发明还提供了一种异质结光热试剂在制备骨肉瘤光热治疗用药物和促进间充质干细胞成骨分化用药物中的应用，本发明制备的纳米光热制剂具有较好的骨肉瘤治疗效果和诱导间充质干细胞成骨分化的效果，并且该纳米光热制剂生物相容性高、无毒性、不产生污染。

此外，根据之前的报道，温和的加热(高于正常值1.5-3.0℃)不仅可以大大增强细胞的增殖，而且还可促进人间充质干细胞(hMSCs)的成骨分化。然而，热疗刺激骨再生的早期研究和应用主要局限于直接加热和微波加热。因此，通过本发明双功能生物材料将近红外二区激光能量转换成热量可以选择性地杀死骨肉瘤细胞并同时修复大的骨缺损，使加速骨再生的高温疗法成为可能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种异质结光热试剂的制备方法，包括步骤：

(1)制备硫化钨纳米片

S11、将适量的硫化钨粉末分散在过量的硫酸溶液中，并于80-100℃反应15-30h；

S12、将反应液进行离心处理，收集的产物用去离子水洗涤数次以除去残留的H₂SO₄，并将洗涤后的产物分散到去离子水中超声处理1-3h，再对分散液进行离心处理，收集硫化钨纳米片；

S13、将收集的硫化钨纳米片分散在20mL去离子水中，备用；

(2)制备近红外二区响应的石墨烯量子点

S21、将适量1,3,6–三硝基芘和聚乙烯亚胺分别加入水中，混合均匀；

S22、将混合后的悬浮液于220-250℃的温度下加热5分钟，冷却至室温；

S23、将冷却后的悬浮液采用微孔滤膜过滤去除其中的不溶性残渣；

S24、将所得的滤液用分子量为3500的透析袋透析两天，获得近红外二区响应的石墨烯量子点；

(3)制备近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结

S31、将步骤(1)制备的硫化钨纳米片与步骤(2)制备的近红外二区响应的石墨烯量子点在磷酸缓冲盐溶液(pH＝8.0)中剧烈搅拌24h，以将红外二区响应的石墨烯量子点沉积在硫化钨纳米片的表面；

S32、将混合液进行离心处理，去除未结合的石墨烯量子点，即得近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结光热试剂。

进一步地，步骤S11中所述硫化钨粉末在使用前置于研磨机中，以400r/min研磨2h。

进一步地，步骤S11中所述硫化钨粉末与所述硫酸的摩尔比用量为1:1.0-2.0。

进一步地，步骤S11中所述硫酸采用浓度大于或等于70wt％的硫酸溶液。

进一步地，步骤S11中所述反应温度为90℃，反应时间为24h。

进一步地，步骤S12中先将反应液以8000r/min离心收集所制备的产物，并用去离子水洗涤数次以除去残留的H₂SO₄；然后将洗涤后的产物分散至去离子水中超声2h；再将分散液以8000r/min离心收集硫化钨纳米片，分散在去离子水中。

进一步地，步骤S21中所述1,3,6–三硝基芘与所述聚乙烯亚胺的摩尔比用量为1:1.0-2.0，所述聚乙烯亚胺的分子量为8000-12000。

进一步地，步骤S22中将所述悬浮液转移至微波反应器中，于230℃的温度下加热5分钟，然后自然冷却到室温。

进一步地，步骤S23中所述微孔滤膜的孔径为0.1-0.3mm。

进一步地，步骤S31中所述硫化钨纳米片与所述近红外二区响应的石墨烯量子点的质量比为5-6：1。

进一步地，步骤S31中所述述红外二区响应的石墨烯量子点在所述磷酸缓冲盐溶液中的浓度为400μg/mL；所述硫化钨纳米片在所述磷酸缓冲盐溶液中的浓度为200μg/mL。

本发明的第二个方面是提供一种如上述所述方法制备的异质结光热试剂。

本发明的第三个方面是提供一种如上述所述异质结光热试剂在制备骨肉瘤光热治疗用药物和促进间充质干细胞成骨分化用药物中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的异质结光热试剂具有较好的骨肉瘤治疗效果和诱导间充质干细胞成骨分化的效果，并且该纳米光热制剂生物相容性高、无毒性、不产生污染；且其制备工艺简单、成本较低，适用于规模生产和临床医疗使用；此外，该异质结光热试剂在骨肉瘤光热治疗和促进间充质干细胞成骨分化的应用，具有较好的骨肉瘤治疗效果和诱导间充质干细胞成骨分化的效果。

附图说明

图1中a)硫化钨纳米片的TEM图片；b)硫化钨纳米片的HRTEM图片；c)石墨烯量子点/硫化钨异质结的HRTEM图片；

图2中a)硫化钨纳米片的X射线衍射图谱；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结的X射线衍射图谱；

图3为石墨烯量子点/硫化钨异质结的XPS总谱和高分辨谱；

图4为不同浓度石墨烯量子点/硫化钨异质结在功率密度分别为0.2W cm^-2和0.6Wcm^-2的808nm和1064nm激光照射下的温度变化；

图5中a)石墨烯量子点/硫化钨异质结对骨肉瘤细胞(MG-63)存活率的影响；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结在1064nm激光器下以0.6W cm^-2功率密度光照5分钟条件下对骨肉瘤细胞(MG-63)存活率的影响；

图6中a)不同浓度的石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液的CT成像图；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液的HU值；c)石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液静脉注射前后在小鼠体内CT成像图；

图7为肿瘤治疗期间肿瘤体积的变化，通过静脉注射生理盐水(saline)、石墨烯量子点/硫化钨异质结，用808nm和1064nm激光器分别在0.2W cm^-2和0.6W cm^-2功率密度的条件下照射肿瘤部位5分钟。肿瘤体积每隔一天测量一次；

图8为不同样品诱导处理14天后茜素红染色效果图和矿化结节率量化图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

一种异质结光热试剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备硫化钨纳米片的方法：

S11、取200mg硫化钨粉末置于研磨机中以研磨2h，转速为400r/min，然后取球磨的40mg硫化钨粉末分散在40mL硫酸中，在90℃下反应24h；

S12、以8000r/min离心收集所制备的产物并用去离子水洗涤数次以除去残留的H₂SO₄，最后将离心收集的产物分散到40mL去离子水中超声2h；

S13、最后将分散液以8000r/min离心收集硫化钨纳米片，分散在20mL去离子水中，备用；

(2)制备近红外二区响应的石墨烯量子点：

S21、将0.025mg的1,3,6–三硝基甲苯、0.4mg聚乙烯亚胺分别加入含有10mL的水的烧杯中，通过超声振荡，混合均匀；

S22、将混合后的悬浮液转入微波反应器中，于230℃反应5min，自然冷却至室温；

S23、将冷却后的混合液用0.22mm孔径的微孔滤膜过滤去除混合液中不溶性残渣；

S24、将所得的滤液用分子量为3500DA的透析袋，透析两天，制备获得近红外二区响应的石墨烯量子点；

(3)制备近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结：

S31、将上述步骤(1)制备获得的硫化钨纳米片(200μg/mL)与步骤(2)获得的近红外二区响应的石墨烯量子点(400μg/mL)在磷酸缓冲盐溶液(pH＝8.0)中剧烈搅拌24小时；

S32、将混合液以7000r/min离心5min，去除未结合的石墨烯量子点，制得近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结光热试剂。

实施例2

(1)石墨烯量子点/硫化钨异质结的体外CT成像：

对于体外CT成像，将石墨烯量子点/硫化钨异质结稀释成不同的浓度(0，0.625，1.25，2.5，5，10mg mL^-1)转移到0.5mL的离心管中，进行CT拍照成像(图6a)。

(2)石墨烯量子点/硫化钨异质结的体内CT成像：

对于体内CT成像，建立骨肉瘤(MG-63)荷瘤小鼠模型，待肿瘤体积达到500mm³左右时，给小鼠静脉注射200μL浓度为1.0mg mL^-1的石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液，分别在0h和24h时拍照，观察小鼠肿瘤部位的CT成像效果(图6c)。

实施例3

(1)石墨烯量子点/硫化钨异质结体外光热特性：

将石墨烯量子点/硫化钨异质结稀释成不同的浓度(0，0.3，0.4，0.5，0.6mg mL^-1)，然后转移1.0mL的溶液至1.5mL的离心管中，分别用808nm和1064nm的激光器以0.2W cm^-2和0.6W cm^-2的功率密度照射5分钟，去离子水用作对照组，每隔30s用红外热成像仪记录温度的变化(图4)。

(2)石墨烯量子点/硫化钨异质结体内光热治疗性能评估：

给3-5周的雌性裸鼠腋窝处皮下种植100μL(100万)的骨肉瘤细胞(MG-63)，待肿瘤体积长到100mm³时，将裸鼠分为5组(每组5只)：(1)生理盐水、(2)石墨烯量子点/硫化钨异质结、(3)生理盐水+光照(0.6W cm^-2、1064nm)、(4)石墨烯量子点/硫化钨异质结+光照(0.2Wcm^-2、808nm)、(5)石墨烯量子点/硫化钨异质结+光照(0.6W cm^-2、1064nm)。分别给荷瘤小鼠静脉注射(200μL)，每隔一天测量肿瘤的体积大小并且每天记录裸鼠的体重(图6)。

实施例4

(1)人间充质干细胞的培养与诱导

将hMSCs置于基础培养基中培养，每隔三天换液一次吗，直至细胞融合度达到80％-90％时，按照1：3的比例扩增；孵育24小时后，用成骨诱导培养基替代基础培养基，我们使用骨诱导培养基作为阴性对照，将细胞分成5组：(a)对照；(b)硫化钨纳米片；(c)石墨烯量子点/硫化钨异质结；(d)硫化钨纳米片+激光；(e)石墨烯量子点/硫化钨异质结+激光。

(2)茜素红染色和定量分析

对于茜素红S(ARS)染色，用PBS洗涤细胞两次，然后在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟。之后，将细胞与0.1％茜素红溶液在室温下孵育10分钟，用PBS洗涤两次并使用光学显微镜观察(图8)。将样品风干并用10％的氯化十六烷基吡啶洗脱ARS染色。然后将来自每个孔的溶液转移到96孔板中，用分光光度计在570nm的吸光度波长下读取吸光度。对于每个处理组，重复实验三次。

将上述实施例中所制得的光热治疗试剂经仪器检测进行表征、MTT法测定其细胞毒性、在体内通过静脉注射方式治疗肿瘤和诱导干细胞分化等相关实验，其结果如下：

如图1所示，a)硫化钨纳米片的TEM图片；b)硫化钨纳米片的HRTEM图片；c)石墨烯量子点/硫化钨异质结的HRTEM图片；由图1可知，得到的硫化钨纳米片为二维片层结构，其平均粒径为100～200nm，在水相中有较好的分散性；在高倍电镜观察下，其具有明显的晶格条纹；石墨烯量子点/硫化钨异质结的HRTEM图显示，直径约10nm的石墨烯量子点分布在硫化钨纳米片表面。

如图2所示，a)硫化钨纳米片的X射线衍射图谱；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结的X射线衍射图谱；由图2可知，X射线衍射图谱显示制备的硫化钨纳米片具有六方结构；石墨烯量子点/硫化钨异质结的X射线衍射图谱显示负载上石墨烯量子点后，在21.2°左右出现了一个碳峰，其余的硫化钨纳米片的峰位置保持不变，证明石墨烯量子点成功负载到硫化钨纳米片上。

如图3所示，为石墨烯量子点/硫化钨异质结的XPS总谱和高分辨谱；由图3可知，单纯的硫化钨纳米片具有W 4f，S 2p信号，而石墨烯量子点/硫化钨异质结的XPS图谱中存在W4f，S 2p，C 1s，N 1s和O 1s的信号。在高分辨N 1s光谱中，400.1eV和398.6eV处的两个峰分别证实存在石墨N和吡咯N；C 1s光谱中，观察到284.4,285.7和287.1eV的三个峰，分别代表C-C，C-N和C-OH峰；在高分辨O 1s光谱中，在530.9eV处显示出羟基的强信号。

如图4所示，为不同浓度石墨烯量子点/硫化钨异质结在功率密度分别为0.2W cm^-2和0.6W cm^-2的808nm和1064nm激光照射下的温度变化；由图4可知，随着石墨烯量子点/硫化钨异质结浓度的增加，在相同功率照射下，石墨烯量子点/硫化钨异质结的温度也不断地增加；在用808nm激光以0.2W cm^-2的功率照射下，石墨烯量子点/硫化钨异质结溶液在5分钟内上升了26.6℃，在用1064nm激光以0.6W cm^-2的功率照射下，石墨烯量子点/硫化钨异质结溶液在5分钟内上升了24.5℃。

如图5所示，a)石墨烯量子点/硫化钨异质结对骨肉瘤细胞(MG-63)存活率的影响；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结在1064nm激光器下以0.6W cm^-2功率密度光照5分钟条件下对骨肉瘤细胞(MG-63)存活率的影响；由图5可知，在没有1064nm激光照射下，当浓度高达600μg mL^-1时，石墨烯量子点/硫化钨异质结没有表现出明显的细胞毒性；在用1064nm激光照射后，石墨烯量子点/硫化钨异质结表现出明显的毒性，细胞死亡率高达94％。

如图6所示，a)不同浓度的石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液的CT成像图；b)石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液的HU值；c)石墨烯量子点/硫化钨异质结分散液静脉注射前后在小鼠体内CT成像图；由图6可知，随着石墨烯量子点/硫化钨异质结溶液浓度的增加，体外的CT成像的信号也越来越强，CT值确定为线性函数，斜率为23HU L/g。对于体内CT成像，在0h时小鼠肿瘤处没有明显的CT信号，在静脉注射试剂24h后，小鼠肿瘤部位有较强的CT信号，表明石墨烯量子点/硫化钨异质结具有较好的被动靶向效果。

如图7所示，为肿瘤治疗期间肿瘤体积的变化，通过静脉注射生理盐水(saline)、石墨烯量子点/硫化钨异质结，用808nm和1064nm激光器分别在0.2W cm^-2和0.6W cm^-2功率密度的条件下照射肿瘤部位5分钟；肿瘤体积每隔一天测量一次。由图7可知，给小鼠静脉注射石墨烯量子点/硫化钨异质结后，用1064nm激光器在0.6W cm^-2功率下治疗5分钟，观察肿瘤在第二天消除，并且在18天内不再复发，而注射生理盐水组，石墨烯量子点/硫化钨异质结组，生理盐水+1064nm激光治疗组肿瘤不断增长，没有抑制作用。在18天的治疗期间，小鼠的体重基本保持不变。

如图8所示，为不同样品诱导处理14天后茜素红染色效果图和矿化结节率量化图。由图8可知，茜素红染色后，在1064nm激光照射下用石墨烯量子点/硫化钨异质结处理的hMSCs显示出高度致密的矿化结节网络，显著高于未加激光的石墨烯量子点/硫化钨异质结和硫化钨纳米片，表明石墨烯量子点/硫化钨异质结可以在1064nm激光照射下促进hMSCs的成骨分化。此外，在用或不用激光照射的硫化钨纳米片处理的hMSCs中未观察到矿化结节的显著变化，表明如果没有石墨烯量子点，则不能达到促进成骨分化所需的温度。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备硫化钨纳米片

S11、将适量的硫化钨粉末分散在过量的硫酸溶液中，并于80-100℃反应15-30h；

S12、将反应液进行离心处理，收集的产物用去离子水洗涤数次以除去残留的H₂SO₄，并将洗涤后的产物分散到去离子水中超声处理1-3h，再对分散液进行离心处理，收集硫化钨纳米片；

S13、将收集的硫化钨纳米片分散在20mL去离子水中，备用；

(2)制备近红外二区响应的石墨烯量子点

S21、将适量1,3,6–三硝基芘和聚乙烯亚胺分别加入水中，混合均匀；

S22、将混合后的悬浮液于220-250℃的温度下加热5分钟，冷却至室温；

S23、将冷却后的悬浮液采用微孔滤膜过滤去除其中的不溶性残渣；

S24、将所得的滤液用分子量为3500的透析袋透析两天，获得近红外二区响应的石墨烯量子点；

(3)制备近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结

S31、将步骤(1)制备的硫化钨纳米片与步骤(2)制备的近红外二区响应的石墨烯量子点在磷酸缓冲盐溶液(pH＝8.0)中剧烈搅拌24h，以将红外二区响应的石墨烯量子点沉积在硫化钨纳米片的表面；

S32、将混合液进行离心处理，去除未结合的石墨烯量子点，即得近红外二区响应的石墨烯量子点/硫化钨异质结光热试剂。

2.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述硫化钨粉末在使用前置于研磨机中，以400r/min研磨2h。

3.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述硫化钨粉末与所述硫酸的摩尔比用量为1:1.0-1.5；所述硫酸采用70wt％的硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S12中先将反应液以8000r/min离心收集所制备的产物，并用去离子水洗涤数次以除去残留的H₂SO₄；然后将洗涤后的产物分散至去离子水中超声2h；再将分散液以8000r/min离心收集硫化钨纳米片，分散在去离子水中。

5.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S21中所述1,3,6–三硝基芘与所述聚乙烯亚胺的摩尔比用量为1:1.0-2，所述聚乙烯亚胺的分子量为8000-12000。

6.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S23中所述微孔滤膜的孔径为0.1-0.3mm。

7.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S31中所述硫化钨纳米片与所述近红外二区响应的石墨烯量子点的质量比为5-6：1。

8.根据权利要求1所述的异质结光热试剂的制备方法，其特征在于，步骤S31中所述近红外二区响应的石墨烯量子点在所述磷酸缓冲盐溶液中的浓度为400μg/mL；所述硫化钨纳米片在所述磷酸缓冲盐溶液中的浓度为200μg/mL。

9.一种如权利要求1-8任一项所述方法制备的异质结光热试剂。

10.一种如权利要求9所述异质结光热试剂在制备骨肉瘤光热治疗用药物和促进间充质干细胞成骨分化用药物中的应用。