CN110368413A - 一种中药组合物及其在乳腺癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物及其用途。本发明提供了一种扶正固本的中药组合物，可降低血清中TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、IL‑17、PTHrP、RANKL、TGF‑β、IGF、PDGF的表达水平，提高血清中OPG的表达水平，通过调节上述多种细胞因子的表达，从而减缓乳腺癌细胞在骨环境中的生长，以及减轻乳腺癌骨转移后乳腺癌细胞所引起的骨破坏及破骨细胞活性。

Description

一种中药组合物及其在乳腺癌治疗中的用途

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种中药组合物及其在乳腺癌治疗中的用途。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年世界上大约有100万妇女被诊断为乳腺癌，且发病率呈逐年上升趋势。在我国每年新发乳腺癌病例约17万，已成为女性恶性肿瘤发病率第一位。尤其近年来我国乳腺癌发病率快速上升，已是我国女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道，高达65％～75％乳腺癌患者发生远处转移。其中，骨骼是最为常见的远处转移器官之一，乳腺癌转移患者中约有70％发生了骨转移。乳腺癌骨转移不仅可导致患者遭受贫血、骨折、截瘫、高血钙、疼痛和恶病质等痛苦，也是导致死亡率上升的重要原因，严重影响其生存期及生活质量。因此，探索具有防治或延缓乳腺癌骨转移、骨破坏的药物具有极为重要的临床意义。

现代医学研究表明，乳腺癌发生骨转移主要是由于乳腺癌细胞受到骨髓中一些细胞因子的吸引进入到骨组织中[如基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)]。在乳腺癌从原位组织脱落、进入血液、最终锚定在骨组织的这个过程，主要受到TGF-β、PI3K/AKT、BMP/SMAD、CXCL12(SDF-1) -CXCR4、p38MAPK、NF-kB、Wnt/β-catenin等信号通路的调控。当乳腺癌细胞锚定在骨组织后，它会分泌大量的细胞因子包括甲状旁腺相关蛋白(parathyroidhormone-related protein， PTHrP)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-11和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α) 等，这些细胞因子一方面通过刺激成骨细胞改变其RANKL/OPG的分泌比例，导致破骨细胞大量活化。另一方面，乳腺癌细胞还可以直接刺激破骨细胞活化。剧烈活化的破骨细胞导致大量的骨吸收，从而造成溶骨性损伤，而此时原本保存在骨基质中的一些生长因子如转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors， IGF-1)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等由于骨质的破坏而大量释放。被释放的这些生长因子反过来又能刺激肿瘤细胞的生长和迁移，导致其进一步恶化，形成了所谓的“恶性循环”(vicious cycle)(见图1)。

在乳腺癌患者长期的综合治疗中，中医药的作用已经得到广泛肯定。乳腺癌属中医“乳岩”范畴，中医学认为，冲任失调和脾肾亏虚为乳腺癌发病之本，气郁、痰浊、瘀血、热毒等为发病之标。正虚邪盛，邪毒走窜旁流，则导致乳腺癌发生转移复发，乳腺癌的发生及复发转移与机体正气不足有着密切的关系。若脾胃虚损则生化乏源，冲任两脉空虚，以致邪毒乘虚而入，正不胜邪而发为乳岩；乳腺癌经手术、放化疗后正气内虚，残余的癌毒未清，余毒盘踞于最虚之处，一旦正虚而制约无力则易余薪复燃、旁窜为患。祖国医学中并无乳腺癌骨转移癌的病名，但细究其临床表现，可能归属中医“骨瘤”、“骨痹”、“骨痛”的范畴。《灵枢·刺节真邪》中云：“虚邪之人于身也深，寒与热相搏，久留而内著，寒胜其热，则骨疼肉枯，热胜其寒，则烂肉腐肌为脓，内伤骨，为骨蚀。有所结，深中骨，气因于骨，骨与气并，日以益大，则为骨瘤”。《外科枢要》曰：“若劳伤肾水，不能荣骨而为肿瘤，名为骨瘤。夫瘤者，留也。随气凝滞，皆因脏腑受伤，气血和违”。骨为肾之体，肾藏精，主骨生髓，骨骼的生长发育和维持全都依靠肾精的滋养，肾精充足则骨髓充盈，骨骼健壮。脏腑虚损，肾精不足则生髓无源，骨失所养，致骨不生、不强、不坚，不荣则痛；体内癌毒邪气乘虚侵袭并留置深入于经筋骨骼之中，致脉络凝滞不通，不通则痛，故发为以骨痛为主要症状的骨转移癌。因此乳腺癌的转移和复发不仅仅局限于癌毒的旁窜过程，而更应注意到患者的整体以及和癌瘤之间的对抗情况，虽然多种因素可造成肿瘤的转移和复发，但与患者的正气虚弱有密切关系。因此，从扶正固本的中医角度入手，有望实现对乳腺癌骨转移的有效治疗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种中药组合物及其用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种中药组合物，按质量份数计，包括：黄芪28～32份、党参14～16份、茯苓8～10份、淫羊藿28～32份、补骨脂28～32份。

一实施例中：按质量份数计，包括：黄芪30份、党参15份、茯苓9份、淫羊藿30份、补骨脂30份。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种上述的中药组合物在制备治疗乳腺癌骨转移的药物中的用途。

一种上述的中药组合物在制备抑制乳腺癌骨转移后骨破坏的药物中的用途。

一实施例中：所述用途通过减轻溶骨性破坏实现。

一实施例中：所述用途通过抑制乳腺癌细胞在骨环境中的增殖生长实现。

一实施例中：所述用途通过抑制破骨细胞的生成和活化实现。

一实施例中：所述用途通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、TGF-β、IGF、PDGF的表达水平实现。

一实施例中：所述用途通过提高OPG的表达水平实现。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明依据扶正固本的根本治则，尤重脾肾，若脾肾不足，则先后天平衡失调，致使正气内虚，选取了具健脾补肾功效的中药，拟定基本方黄芪、党参、茯苓、淫羊藿、补骨脂。方中黄芪补中益气、升阳固表为君；党参补中益气、生津、养血为臣；茯苓健脾，淫羊藿温肾壮阳，补骨脂补肾助阳为佐。综合全方，一则补气健脾，使后天生化有源，气血同源，气生则血生，可缓解乳腺癌术后患者的气血亏损症状；一则温肾壮阳、强筋骨，防止或延缓了骨转移的发生。本发明同时进行了相关的实验验证，发现该扶正固本的中药组合物具有延缓乳腺癌骨转移、减轻骨破坏的作用，并提供了该扶正固本的中药组合物减轻骨破坏的作用及其机制，为中医药防治乳腺癌骨转移、骨破坏提供了依据。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1用于说明乳腺癌骨转移后引起的“恶性循环”(vicious cycle)。

图2为裸鼠胫骨内注射乳腺癌细胞后IVIS检测结果，A为各组小鼠胫骨内IVIS荧光图像， B为各组小鼠胫骨内乳腺癌IVIS荧光值的柱状图，由图可见唑来膦酸组和扶正固本组的IVIS 值均小于模型组，差异具有统计学意义(与模型组比较，**P＜0.01)。

图3为裸鼠胫骨内注射乳腺癌细胞后X-ray检测结果，A为各组小鼠胫骨X-ray图片，B 为各组小鼠胫骨骨破坏面积与胫骨总面积的比值同统计图，由图可见胫骨内注射乳腺癌细胞可引起明显的溶骨性破坏，唑来膦酸和扶正固本方药干预后，骨破坏的面积减小，与模型组比较具有统计学意义(与模型组比较，**P＜0.01)。

图4为裸鼠胫骨内注射乳腺癌细胞后TRAP染色检测结果，A为各组小鼠胫骨切片的TRAP 染色图片，B为各组小鼠胫骨TRAP+细胞数目的统计图，由图可见胫骨内注射乳腺癌细胞可引起明显的破骨细胞活化(TRAP+细胞数量明显增多)，唑来膦酸和扶正固本方药干预后，TRAP+ 细胞数量所有减少，与模型组比较具有统计学意义(与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001)。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

1实验材料

1.1试剂与药品TRAP染色试剂盒购自Sigma公司，细胞培养基DMEM、胰酶、胎牛血清、双抗购自Gibco公司，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、IGF ELISA 试剂盒购自ThermoFisher公司，PTHrP ELISA试剂盒购自默沙克(MSK)公司、PDGF ELISA 试剂盒购自R&D SYSTEMS公司，唑来膦酸注射液购自江苏正大天晴药业股份有限公司。扶正固本方(黄芪30g、党参15g、茯苓9g、淫羊藿30g、补骨脂30g)由厦门市中医院中药房提供。制备步骤如下：按重量份配比范围，称定黄芪、党参、茯苓、淫羊藿、补骨脂后，加入10 倍量水，浸泡40min，煎煮，煎煮2次，每次1h，合并水煎液，进行加热浓缩使药液浓度为2.96g 生药/ml。

1.2实验动物裸鼠(6～8周龄)购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于SPF 级动物中心。

1.3细胞株人乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc购买于中国科学院上海细胞研究所。

2方法

2.1细胞培养

人乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc以10％FBS的细胞培养液DMEM，置于5％CO₂ 37℃培养箱培养，每2～3天换液一次，待细胞生长至80％～90％，采用0.25％胰酶消化，传代培养。造模当天，采用0.25％胰酶消化培养皿中的MDA-MB-231-luc细胞，收集细胞悬液，经800rpm离心5min后，将沉淀细胞用PBS洗2遍，血细胞计数器计数，采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/μl细胞悬液，置于冰上备用。

2.2胫骨内注射乳腺癌细胞建立乳腺癌骨破坏动物模型

选取6～8周龄雌性裸鼠40只，每笼5只，饲养于SPF级动物中心，每三天清理鼠笼一次，直至实验结束。购买到的裸鼠在动物中心适应性饲养3天，确认其无烈性传染病，并基本适应新的饲养环境后，开始下一步实验。将裸鼠置于超净工作台中，采用2.5％的阿弗丁0.3～ 0.4ml/20g麻醉。待裸鼠麻醉后，沿髌骨前方作约1cm～2cm纵形皮肤切口，沿髌韧带边缘作 1cm切口，暴露胫骨上缘。采用显微注射器(规格：26G)向胫骨内注射4×10⁴个萤光素酶标记的MDA-MB-231-luc人乳腺癌细胞(总体积20μl)，缝合切口，将裸鼠置于37℃恒温板上，待裸鼠苏醒后放回饲养笼中。空白对照组仅注射20μl PBS。

2.3动物分组及给药

除空白对照组外，其他裸鼠在荷瘤3天后，根据体重排序，采用随机数字表法将裸鼠分为 3组，分别为模型组、唑来膦酸组和扶正固本方组，每组10只裸鼠。其中，扶正固本方组(黄芪30g、党参15g、茯苓9g、淫羊藿30g、补骨脂30g)每天灌胃，灌胃剂量为1mL/只，以体表面积换算所得剂量组药汤剂[计算方法：小鼠的给药量(mg/kg)＝成人剂量(mg/kg)×(人的转换因子/小鼠的转换因子)]；唑来膦酸组皮下注射唑来膦酸，0.2mg/kg体重，均每周给药 3次，空白对照组和模型组每天只灌胃相应剂量的生理盐水，连续给药28天。观察裸鼠外观及行为，拍照并记录其体重变化。IVIS动物活体荧光成像系统定时监测裸鼠体内肿瘤的生长情况。

2.4小鼠活体成像

根据裸鼠的体重，侧腹腔注射相应剂量的Luciferase-D荧光底物，5min后将裸鼠置于麻醉箱气体麻醉。将麻醉好的裸鼠置于-200动物活体荧光成像系统中荧光成像，观察肿瘤的大小，比较组间差异。

2.5小鼠X线检查

为观察乳腺癌引起的骨质破坏程度，采用阿弗丁麻醉裸鼠后，将裸鼠置于柯达X线成像系统中，拍照观察乳腺癌骨转移或骨内注射后引起的骨质破坏面积百分比(骨质破坏面积百分＝骨破坏面积÷胫骨骨质总面积×100％)，比较组间差异。

2.6血清ELISA检测

于末次给药后2h，用剪镊快速摘除眼球取血，收集各组裸鼠的血液放入促凝管中，4℃下静置1h，室温3000rpm离心5min，分离血清，采用ELISA阵列试剂盒检测裸鼠血液中TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、OPG、TGF-β、IGF、PDGF细胞因子的表达水平，以空白对照组为基础值计算给药后裸鼠血液中以上细胞因子的表达改变。具体操作根据ELISA试剂盒说明书进行。

2.7胫骨TRAP染色

麻醉处死裸小鼠，取出胫骨经4％多聚甲醛固定24h后，经0.5M的EDTA脱钙10天，再经梯度乙醇、二甲苯、石蜡浸泡(即脱水至蜡处理)，石蜡包埋，切成4μM厚度切片，挑选包含骨髓腔的胫骨切片，按常规脱蜡至水后，采用TRAP染色试剂盒进行组织染色。

2.8统计方法

SPSS19.0For Windows软件进行统计。计量资料数据均以均数±标准差表示。先对各组数值变量进行正态性检验，不服从正态分布的数据采用非参数检验。服从正态分布的数据，进一步检验方差齐性。方差齐时多组数据间的比较采用单因素方差分析和LSD-t法检验。方差不齐时，多组数据间的比较采用Welch检验和Dunnett's T3法检验。

3结果

3.1扶正固本方对乳腺癌在骨环境中生长的影响

根据各组裸鼠胫骨内乳腺癌细胞的荧光值情况，绘制乳腺癌细胞的生长柱状图(见图2B)，与模型组比，扶正固本组和唑来磷酸组对乳腺癌细胞在骨环境中的生长均产生不同程度的抑制作用。

3.2扶正固本方对乳腺癌诱导骨破坏的影响

根据各组裸鼠胫骨X-ray检测结果，绘制骨破坏程度的柱状图(见图3B)，与模型组比，扶正固本组和唑来磷酸组可减轻乳腺癌细胞引起的骨破坏。

3.3扶正固本方对胫骨破骨细胞活性的表达影响

根据各组裸鼠胫骨切片的TRAP染色检测结果，绘制TRAP阳性细胞数目的柱状图(见图 4B)，与模型组比，扶正固本组和唑来磷酸组对乳腺癌细胞引起的破骨细胞活化均有不同程度的抑制作用。

3.4扶正固本方对小鼠血清中细胞因子的表达影响

ELISA结果显示，扶正固本组炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达水平明显低于模型组，比较具有统计学意义(*P＜0.05或**P＜0.01)(表1)。表2结果显示，扶正固本组的PTHrP、RANKL(促破骨细胞形成因子)的表达水平低于模型组(*P＜0.05)；而OPG(抑制破骨细胞形成因子)的表达上升，与模型组比较具有统计学意义(**P＜0.01)。扶正固本组血清中细胞生长因子TGFβ、IGF、PDGF的表达低于模型组，比较具有统计学意义(*P ＜0.05)(表3)。

表1各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17表达情况

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表2各组小鼠血清中PTHrP、RANKL、OPG表达情况

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表3各组小鼠血清中TGFβ、IGF、PDGF表达情况

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

4讨论

乳腺癌骨转移属中医“骨蚀”、“骨瘤”、“骨痹”、“骨疽”等范畴，骨转移癌局部肿块坚硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不变、面色晦暗等临床特征；其发生、发展与中医的肾和脾关系密切。《医经精义》曰：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也”。脾肾为互济之脏，肾虚久不复，火不生土，必伤脾阳。《素问·五脏生成篇》云：“肾之合骨也，其荣在发，其主脾也”，说明脾肾对骨的充养具有重要作用。扶正固本方由黄芪、党参、茯苓、淫羊藿、补骨脂组成，具有益气健脾、补肾壮骨的作用。

正常的骨代谢是通过成骨细胞的成骨作用与破骨细胞的骨吸收作用进行调节，从而保持一种动态平衡。当乳腺癌骨转移后，乳腺癌细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨基质细胞共同参骨微环境的改造。19世纪英国Paget提出的“土壤和种子”学说已得到广泛认可，认为靶器官内适宜血液中播散的肿瘤细胞生存微环境是肿瘤发生的必要条件。目前许多研究证据表明，肿瘤转移取决于骨微环境提供的生长支持和癌细胞对这一环境的适应能力。骨微环境包括细胞外基质和细胞，如成骨细胞、破骨细胞、基质细胞、内皮细胞、造血细胞等，这些细胞可以产生多种因子，促进肿瘤细胞生长和骨转移进程，而乳腺癌细胞也释放多种因子并与微环境内细胞相互作用，进而造成对骨结构的破坏。

首先，乳腺癌细胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎症因子，一方面刺激成骨细胞分泌RANKL，另一方面刺激单核细胞融合成破骨细胞。其中IL-6在诱导肿瘤细胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨细胞生成、抑制成骨细胞分化中具有重要作用；IL-1β能够直接刺激破骨细胞的增殖，增强其活性，促进乳腺癌骨转移骨质吸收。TNF-α可以刺激IL-1β、IL-6的产生，从而促进恶性肿瘤细胞增殖，并抑制其凋亡，还可以抑制间充质干细胞增殖，促进成熟的成骨细胞凋亡，加速骨转移灶骨质破坏。因此抑制骨转移灶中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达，可减轻骨损伤、保护骨组织。本发明中，扶正固本方对组骨组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均明显低于模型组，提示扶正固本方可减少骨转移癌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的分泌，从而减轻促炎因子介导的骨损伤以及肿瘤细胞的增殖。

其次，乳腺癌细胞产生的PTHrP是主要的破骨细胞激活因子。在肿瘤骨转移的过程中，起到促进骨转移的作用。PTHrP刺激成骨细胞或基质细胞产生RANKL(核因子κB受体活化因子配体)，RANKL通过未成熟破骨细胞表面的RANK信号系统，刺激转录因子起始转录，导致未成熟的破骨细胞分化为成熟的破骨细胞；并且同时抑制OPG(骨保护素)的合成。OPG是RANKL的无功能受体，它能与破骨细胞表面的RANK竞争性结合RANKL，在体内、体外情况下均能抑制破骨细胞成熟和活化。目前认为RANKL/OPG的比例是破骨细胞活性的决定因素之一。成骨细胞和破骨细胞之间失去平衡，促进骨吸收作用。在骨转移过程中，OPG的表达量会很低，PTHrP和RANKL的表达量增加，这样就促使骨转移后骨破坏的发生。而当促进或抑制相关调节因子的产生时，就能够在一定程度上抑制骨的转移。本实验通过ELISA法检测，发现扶正固本方对破骨细胞形成的相关调节因子产生了调控作用，可促进OPG的表达，抑制PTHrP、RANKL的表达，从而抑制破骨细胞的形成。

再者，TGF-β、IGF、PDGF(血小板衍生生长因子)等细胞生长因子是调控乳腺癌骨转移发生、发展的重要因素。TGF-β是骨代谢中关键的信号因子，在肿瘤转移过程中能帮助瘤细胞逃避免疫监控，有利于乳腺癌骨转移的发生，并可促进破骨细胞的增殖和分化；骨是TGF-β的主要存储场所，骨转移溶骨破坏可释放大量TGF-β，且乳腺癌细胞直接分泌TGF-β，TGF-β通过调控TGF-β/Smads信号通路，调控破骨细胞活性的主要介导因子PTHrP等的表达，加速骨质流失；抑制TGF-β及PTHrP的表达，可截断骨损伤恶性循环，减少骨损伤。在破骨细胞的骨吸收中，骨中IGF-1的释放能刺激乳腺癌细胞增殖与趋化，并抑制其凋亡。MDA-MB-231细胞中的IGF-1受体的过表达显著增加骨转移率，而乳腺癌骨转移细胞的有丝分裂增加，凋亡减少。低表达IGF-1受体则相反。破骨细胞的骨吸收导致骨中IGF-1的释放，在刺激细胞增殖和趋化作用以及抑制转移乳腺癌细胞的凋亡中发挥重要作用，导致骨转移的发生。ELISA结果显示，扶正固本方可减少小鼠血清中细胞生长因子TGFβ、IGF、PDGF的表达水平。

5结论

本实施例研究结果表明，本发明的扶正固本的中药组合物可通过降低炎症因子(TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-17)、细胞生长因子(TGFβ、IGF、PDGF)以及促破骨细胞因子(PTHrP、RANKL) 的表达，增加OPG的表达，从而减缓乳腺癌细胞在骨环境中的生长，以及减轻乳腺癌细胞所引起的骨破坏。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种中药组合物，其特征在于：按质量份数计，包括：黄芪28～32份、党参14～16份、茯苓8～10份、淫羊藿28～32份、补骨脂28～32份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：按质量份数计，包括：黄芪30份、党参15份、茯苓9份、淫羊藿30份、补骨脂30份。

3.一种权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗乳腺癌骨转移的药物中的用途。

4.一种权利要求1或2所述的中药组合物在制备抑制乳腺癌骨转移后骨破坏的药物中的用途。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述用途通过减轻溶骨性破坏实现。

6.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述用途通过抑制乳腺癌细胞在骨环境中的增殖生长实现。

7.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述用途通过抑制破骨细胞的生成和活化实现。

8.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述用途通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、TGF-β、IGF、PDGF的表达水平实现。

9.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述用途通过提高OPG的表达水平实现。