CN104127808A - 治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗恶性肿瘤的中药制剂，由下列重量份数的原料药制备而成：黄芪10～20g，人参5～15g，夏枯草10～25g，甘草2～5g，莪术20～25g，半枝莲25～30g，干蟾5～10g，猫爪草15～20g，猪苓20～25g，水牛角20～25g，仙鹤草25～30g，这种治疗恶性肿瘤的中药制剂成本低、疗效好。

Description

治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，2002年恶性肿瘤发病人数约220万，死亡约160万，预计到2020年，我国癌症发病人数将达到300万，死亡220万；全球新发病例将达l500万，死亡1000万，使人类面临着防治恶性肿瘤新的挑战。现有治疗肿瘤手段有手术、化疗、放疗、生物疗法和中医中药等五大临床治疗方法。中医药治疗是我国治疗恶性肿瘤独特的手段之一，优势明显、疗效确切。它能增强机体免疫力，减少放化疗的毒副反应，加强放化疗效果，防止肿瘤治疗后复发与转移，在减轻癌症患者症状和痛苦，提高生存质量，延长寿命等方面起着极其重要的意义。

为此申请人于2007年2月1日申请了一项治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法发明专利，并于2011年6月1日获得授权，专利号为ZL2007100670450,该发明公开了一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法，该中药制剂由下列重量份数的原料药制备而成：夏枯草15～25份，仙鹤草15～25份，白花蛇舌草15～25份，半枝莲15～25份，黄药子10～20份，猪苓10～20份，苦参5～15份，猫爪草10～20份，海浮石10～20份，生晒参5～10份，生黄芪10～20份，灵芝3～7份，水牛角10～20份，羚羊角1～2份，野菊花5～15份，金钱草10～20份，莪术10～20份，干蟾皮3～7份，生甘草1～2份。本发明中药制剂具有扶正祛邪、散结消瘤之功效，主治消化系统、泌尿系统及脑胶体瘤等各型肿瘤，防止术后复发，增强化疗作用，减轻化疗、放疗之后的毒副作用，取得较好的疗效。但该发明专利的中药配方药味太多，导致成本太高，不利于推广应用；该中药配方还存在不合理之处，有待进一步改善。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、疗效好的治疗恶性肿瘤的中药制剂。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种治疗恶性肿瘤的中药制剂，由下列重量份数的原料药制备而成：黄芪10～20g，人参5～15g，夏枯草10～25g，甘草2～5g，莪术20～25g，半枝莲25～30g，干蟾5～10g，猫爪草15～20g，猪苓20～25g，水牛角20～25g，仙鹤草25～30g。

优选下列重量份数配比：黄芪20g，人参15g，夏枯草25g，甘草5g，莪术20g，半枝莲25g，干蟾10g，猫爪草15g，猪苓20g，水牛角20g，仙鹤草25g。

本发明治疗恶性肿瘤的中药制剂的型剂可以为颗粒剂。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种本发明颗粒剂的制备方法。

本发明颗粒制剂的制备方法是：

a.取莪术粉碎过20目筛，加12倍量水浸泡4小时，水蒸气蒸馏5小时，分取莪术油,加无水乙醇稀释后，在搅拌下滴加入到环糊精饱和溶液中，搅拌2小时，0-5℃冷冻24小时，过滤，低温干燥，干燥后密封，提取液备用，药渣转入c；

b.取人参、猪苓、黄芪、干蟾、水牛角、猫爪草、甘草加12倍量70％乙醇加热回流提取2小时，提取3次，2、3次分别用10倍、8倍量70％乙醇,合并提取液过滤，回收乙醇，药液备用,药渣转入c；

c.取仙鹤草、夏枯草、半枝莲及上述a、b药渣加10倍量水煮液提取1.0小时，提取3次，2、3次分别用8倍、8倍量水,合并提取液过滤，浓缩至相对密度约为1.2，醇沉24小时，回收乙醇，药液备用,弃去药渣；

将a、b、c三步提取液合并减压浓缩至1.2，减压干燥后粉碎，加入莪术油环糊精饱和物、辅料适量混合均匀制成颗粒剂。

本发明治疗恶性肿瘤的中药制剂对C6脑胶质瘤、S180肉瘤及H22肝癌具有明显的抗肿瘤作用，且与化药(环磷酰胺、司莫司汀)合用能增强化药的抑瘤作用，还具有改善化药引起的骨髓和免疫抑制等作用，起到增效减毒的疗效。其抗肿瘤作用机制为促进活化的巨噬细胞产生大量的NO，对肿瘤细胞产生细胞毒作用，同时能降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制肿瘤血管新生；抑制肿瘤细胞合成和分泌IGF-1，抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡；阻止肿瘤组织产生PGE2，解除其引起的免疫抑制，遏制肿瘤生长；调节体液免疫，增加机体免疫因子的释放，增强对肿瘤的抵抗作用；降低血液粘度，从而抵抗肿瘤侵袭转移。为临床治疗高尿酸血症提供了依据。

下面结合具体实施方式来进一步说明本发明药物的有益效果。

具体实施方式

制备实施例1

配方1：黄芪20g，人参15g，夏枯草25g，甘草5g，莪术20g，半枝莲25g，干蟾10g，猫爪草15g，猪苓20g，水牛角20g，仙鹤草25g。

a.取莪术20粉碎过20目筛但不能过40目，加12倍量水浸泡4小时，水蒸气蒸馏5小时，分取莪术油,加无水乙醇稀释后，在搅拌下滴加入到环糊精饱和溶液中，搅拌2小时，0-5℃冷冻24小时，过滤，低温干燥，干燥后密封，提取液备用，药渣转入c；

b.取人参15g、猪苓20g、黄芪20g、干蟾10g、水牛角20g、猫爪草15g、甘草5加12倍量70％乙醇加热回流提取2小时，提取3次，2、3次分别用10倍、8倍量70％乙醇,合并提取液过滤，回收乙醇，药液备用,药渣转入c。

c.取仙鹤草25g、夏枯草25g、半枝莲25及上述a、b药渣加10倍量水煮液提取1.0小时，提取3次，2、3次分别用8倍、8倍量水,合并提取液过滤，浓缩至相对密度约为1.2，醇沉24小时，回收乙醇，药液备用,弃去药渣；

将a、b、c三步提取液合并减压浓缩至1.2，减压干燥后粉碎，粉碎后加入莪术油环糊精包合物、甜菊甙、可溶性淀粉及乳糖，混合均匀后用95％乙醇制粒，45-55℃烘干，制成颗粒剂。

制备实施例2

配方2：黄芪10g，人参15g，夏枯草10g，甘草5g，莪术25g，半枝莲30g，干蟾10g，猫爪草20g，猪苓25g，水牛角25g，仙鹤草30g。

a.取莪术25g粉碎过20目筛但不能过40目，加12倍量水浸泡4小时，水蒸气蒸馏5小时，分取莪术油,加无水乙醇稀释后，在搅拌下滴加入到环糊精饱和溶液中，搅拌2小时，0-5℃冷冻24小时，过滤，低温干燥，干燥后密封，提取液备用，药渣转入c；

b.取人参15g、猪苓25g、黄芪10g、干蟾10g、水牛角25g、猫爪草20g、甘草5g加12倍量70％乙醇加热回流提取2小时，提取3次，2、3次分别用10倍、8倍量70％乙醇,合并提取液过滤，回收乙醇，药液备用,药渣转入c。

c.取仙鹤草30g、夏枯草10g、半枝莲30g及上述a、b药渣加10倍量水煮液提取1.0小时，提取3次，2、3次分别用8倍、8倍量水,合并提取液过滤，浓缩至相对密度约为1.2，醇沉24小时，回收乙醇，药液备用,弃去药渣；

将a、b、c三步提取液合并减压浓缩至1.2，减压干燥后粉碎，粉碎后加入莪术油环糊精包合物、甜菊甙、可溶性淀粉及乳糖，混合均匀后用95％乙醇制粒，45-55℃烘干，制成颗粒剂。

药效试验例

一、材料与仪器

动物

健康ICR小鼠，雌雄各半，体重18g～22g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2008-0033；健康雄性Wistar大鼠，体重130g～170g，由上海市西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2008-0016。

药品

瘤株

小鼠肉瘤S₁₈₀细胞株、小鼠肝癌H₂₂细胞株、大鼠胶质瘤C6细胞株均由浙江中医药大学生命科学院提供。

受试药

扶正消瘤提取物(FZXLF)，即本发明中药制剂，以水配制成浓度为含饮片量0.2g/ml、0.4g/ml、0.6g/ml(供小鼠试验用)，以及0.12g/ml、0.24g/ml、0.36g/ml的药液(供大鼠试验用)。

阳性对照药

注射用环磷酰胺(CTX)：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为09092321，用生理盐水配制成浓度为1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml，备用。

司莫司汀胶囊(Me-CCNU)，浙江瑞新药业股份有限公司，批号20100112，用蒸馏水配制成浓度为2.33mg/ml，备用。

试剂

血液分析试剂，批号5018，美国A Drew Scientific GrouP Co.；RPIM1640培养基：批号1285082，美国GIBCOBRL；超级新生牛血清：批号091025，杭州四季青生物工程材料研究所；骨蜡：批号CH5DZTM，美国强生。

大鼠TNF-α、IL-2、IFN-γ、VEGF、PGE₂、IGF-ⅠELISA检测试剂盒，批号均为09/2011，以上试剂盒均由美国R&D公司提供。

免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、补体(C3，C4)免疫透射比浊试剂盒，批号均为10/03/2011，以上试剂盒均由北京瑞格博科技发展有限公司提供。

NO试剂盒，批号20110119；NOS试剂盒(测分型)，批号20110214；考马斯亮蓝试剂盒，批号20110111。

绵羊红细胞(SRBC)悬液的制备：取绵羊血8ml，用生理盐水洗涤3次，每次2000rpm离心5min，弃上清液，再用生理盐水以1:5(V:V)稀释得20％的绵羊红细胞悬液20ml。

补体的制备：采集豚鼠血液，分离出血清并混合，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放入4oC冰箱30min，经常振荡，离心取上清液，分装-20oC保存。用时以生理盐水按1：8稀释。

主要仪器

HEMAVET950动物血液分析仪，A Drew Scientific GrouP Co.。

Power wave340酶标仪，美国Bio-TEK公司。

XHF-D高速分散器(内切式匀浆机)，宁波新芝生物科技股份有限公司。

Microc117离心机，Thermo。

JY10001型电子天平，上海民桥精密仪器有限公司。

Heraeus三气细胞培养箱，德国Heraeus公司。

SW-CJ-IF层流超净工作台，苏州安泰空气技术公司。

Olympus IX-70倒置荧光显微镜，日本Olympus公司。

ALC-H动物脑立体定位仪，上海奥尔科特生物科技有限公司。

ALC-IP微量注射泵，上海奥尔科特生物科技有限公司。

ALC-CED动物颅骨钻，上海奥尔科特生物科技有限公司。

统计学处理

计量资料数据结果以表示，组间差异采用t-test。P<0.05为有统计学意义。

二、方法与结果

(一)本发明中药制剂单用及与环磷酰胺合用对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.实验方法

1.1本发明中药制剂单用对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.1.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分为6组：正常对照组、模型对照组、CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)组，每组12只。

1.1.2模型制备

取肝癌H₂₂细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1：4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，除正常对照组外，其余每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下。

1.1.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠。CTX组按20mg·kg^-1腹腔注射给予环磷酰胺溶液。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的蒸馏水，每日1次，连续14d，灌胃体积为0.1mL/10g体重。

1.1.4指标测定

⑴一般肿瘤指标：①抑瘤率：末次给药后，动物处死，剥取瘤体组织称重，并计算抑瘤率，抑瘤率(％)＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

②生命延长率：记录各组小鼠死亡时间，即存活时间，计算生命延长率。生命延长率(％)＝(1-给药组平均生存天数/对照组平均生存天数)×100％。

⑵免疫指标：末次给药后，动物处死，剥取脾和胸腺组织称重，计算脾指数、胸腺指数，脏器指数(‰)＝脏器指数＝脏器重量/体重×1000‰。并检测T淋巴细胞增殖率。

1.2本发明中药制剂与环磷酰胺合用对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.2.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分成14组，共三批实验。其中正常对照组、模型对照组共用。

①第一批分正常对照组、模型对照组、CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组，每组10只；

②第二批分为CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组，每组10只；

③第三批分为CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF低剂量(2.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组，每组10只。

1.2.2模型制备

取肝癌H₂₂细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1：4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，除正常对照组外，其余每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下。

1.2.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠，同时对各组小鼠注射相对的不同剂量CTX进行联用。CTX组按20、15、10mg·kg^-1腹腔注射给予环磷酰胺溶液。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的水，每日1次，连续14d，灌胃体积为0.1mL/10g体重。

1.2.4指标测定

⑴一般肿瘤指标：抑瘤率、生命延长率。

⑵免疫指标：脾指数、胸腺指数。

2.实验结果

2.1本发明中药制剂单用对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.1.1对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤抑制的影响

与模型对照组相比，FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)对H₂₂实体瘤的瘤重均有抑制作用(P<0.05～0.01)，最大抑制率为32.37％。模型对照组脾指数、胸腺指数均升高，提示肿瘤可以使免疫器官代偿性肥大，FZXLF(2g·kg^-1)能降低脾指数(P<0.05～0.01)。结果见表1-1。

表1-1 FZXLF对小鼠肝癌H₂₂生长的抑制作用(n＝12，)

与正常对照组相比：^△P<0.05^△△P<0.01与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.1.2对H₂₂荷瘤小鼠生命延长率的影响

与模型对照组相比，FZXLF各给药组均有延长生存时间的趋势，各给药组生命延长率为7.69％～22.49％，呈现出一定的剂量相关性。结果见表1-2。

表1-2 FZXLF对H₂₂荷瘤小鼠腹水瘤的生命延长率的影响(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.1.3对H₂₂荷瘤小鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响

与正常对照组比较，模型对照组肿瘤小鼠T淋巴细胞加PHA刺激前后OD差值、OD增殖率显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，FZXLF三个剂量(6.0g·kg^-1、4.0g·kg^-1、2.0g·kg^-1)具有提高小鼠T淋巴细胞增值的趋势，其中4.0g·kg^-1、2.0g·kg^-1能明显升高PHA刺激前后OD差值；6.0g·kg^-1能升高OD增殖率(P<0.05～0.01)。结果见表1-3。

表1-3 对H₂₂荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响(n＝12，)

与正常对照组比较：^△P<0.05^△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.2本发明中药制剂与环磷酰胺合用对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.2.1FZXLF联用CTX对H₂₂荷瘤小鼠抑瘤作用的影响

与模型对照组相比，FZXLF三个剂量(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)分别与CTX(20mg·kg^-1)合用，小鼠瘤重下降都具有显著性差异；其中CTX+FZXLF(0.02+6.0g·kg^-1)组瘤重下降较单用CTX组明显，且抑瘤率有较大幅度的提高，抑瘤率为45.99％；各给药组脾指数均升高(P<0.05～0.01)。相比于单用CTX组，合并用药能升高脾指数(P<0.01)，其中CTX+FZXLF(0.02+6.0g·kg^-1)还能升高胸腺指数(P<0.05)。结果见表1-4。

表1-4 化药合用对H₂₂荷瘤小鼠生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与CTX组比较：^#P<0.05^##P<0.01

与模型对照组相比，FZXLF(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)三个剂量分别与CTX(15mg·kg^-1)合用，瘤重下降呈显著性差异(P<0.05～0.01)，与单用CTX相比较，6.0g·kg^-1合并CTX对瘤重下降更明显(P<0.05)，抑瘤率为59.38％，提升20.72％；2.0g·kg^-1合并CTX抑瘤率为53.12％，提升14.46％。相比于单用化疗药组，6.0g·kg^-1、4.0g·kg^-1合并CTX组脾指数升高。结果见表1-5。

表1-5 化药合用对H₂₂荷瘤小鼠生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与CTX组比较：^#P<0.05^##P<0.01

与模型对照组相比较，FZXLF(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)三个剂量分别与CTX(10mg·kg^-1)合用，瘤重下降呈统计学意义(P<0.05～0.01)。与单用CTX相比较，6.0g·kg^-1合并CTX抑瘤率最明显(P<0.05)，三剂量组抑瘤率分别为65.96％、55.25％、43.16％；FZXLF6.0、2.0g·kg^-1合并CTX组脾指数升高(P<0.05～0.01)。结果见表1-6。

表1-6 化药合用对H₂₂荷瘤小鼠生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与CTX组比较：^#P<0.05^##P<0.01

不同剂量CTX组对H₂₂小鼠抑制率、脾指数、胸腺指数之间无明显的差异，说明CTX对肿瘤小鼠的抑制作用恒定，对于在0.01～0.02g·kg^-1浓度之间无明显的差异。结果见表1-7。

表1-7 不同剂量CTX组对H₂₂荷瘤小鼠生长的影响

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与CTX组比较：^#P<0.05^##P<0.01

2.2.2FZXLF联用CTX对H₂₂荷瘤小鼠生命延长率的影响

与模型对照组相比，FZXLF三个剂量(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)组合并CTX(20mg·kg^-1)均能提高小鼠生存时间，其中6.0g·kg^-1合用CTX对H₂₂荷瘤小鼠生命延长率具有显著性差异(P<0.05)，各剂量组对小鼠生命延长率为15.94％～28.26％。结果见表1-8。

表1-8 FZXLF对H₂₂荷瘤小鼠生命延长率的影响(n＝8，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

3.小结

单用本发明中药制剂FZXLF体内实验表明，FZXLF对H22、S180肿瘤小鼠均有抑制肿瘤生长的作用，降低肿瘤重量，而且能够延长小鼠的生存时间；还稍有提高脾指数、胸腺指数和T淋巴细胞增殖能力，可能具有提高荷瘤小鼠的免疫功能作用。通过本实验观察FZXLF与化疗药物CTX联合应用对抗小鼠H₂₂实体瘤的影响，结果发现，FZXLF与CTX10mg·kg^-1合并给药对于治疗H₂₂效果最好；对于脾指数、胸腺指数有一定的升高作用，提示可能有改善免疫功能的作用。

(二)本发明中药制剂单用及与环磷酰胺合用对S₁₈₀荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.实验方法

1.1本发明中药制剂单用对S₁₈₀荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.1.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分为6组：正常对照组、模型对照组、CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)组，每组12只。

1.1.2模型制备

取肉瘤S₁₈₀细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1：4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，除正常对照组外，其余每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下。

1.1.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠。CTX组按20mg·kg^-1腹腔注射给予环磷酰胺溶液。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的蒸馏水，每日1次，连续14d，灌胃体积为0.1mL/10g体重。

1.1.4指标测定

⑴一般肿瘤指标：抑瘤率、生命延长率。

⑵免疫指标：脾指数、胸腺指数、T淋巴细胞增殖率。

1.2本发明中药制剂与环磷酰胺合用对S₁₈₀荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

1.2.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分成14组，共三批实验。其中正常对照组、模型对照组共用。

①第一批分正常对照组、模型对照组、CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)+CTX(20mg·kg^-1)组，每组10只；

②第二批分为CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)+CTX(15mg·kg^-1)组，每组10只；

③第三批分为CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF(6.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组、FZXLF低剂量(2.0g·kg^-1)+CTX(10mg·kg^-1)组，每组10只。

1.2.2模型制备

取肉瘤S₁₈₀细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1：4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，除正常对照组外，其余每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下。

1.2.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠，同时对各组小鼠注射相对的不同剂量CTX进行联用。CTX组按20、15、10mg·kg^-1腹腔注射给予环磷酰胺溶液。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的水，每日1次，连续14d，灌胃体积为0.1mL/10g体重。

1.2.4指标测定

⑴一般肿瘤指标：抑瘤率、生命延长率。

⑵免疫指标：脾指数、胸腺指数。

2.实验结果

2.1本发明中药制剂单用对S₁₈₀荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.1.1对S₁₈₀荷瘤小鼠肿瘤抑制的影响

与模型对照组相比，FZXLF(4.0g·kg^-1、6.0g·kg^-1)能降低S₁₈₀腹水瘤小鼠瘤重(P<0.05～0.01)，低剂量组具有一定的抑制趋势，最大抑制率为33.10％。结果见表2-1。

表2-1 FZXLF对小鼠肉瘤S₁₈₀生长的抑制作用(n＝12，)

与正常对照组相比：^△P<0.05^△△P<0.01与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.1.2对S₁₈₀荷瘤小鼠生命延长率的影响

与模型对照组相比，FZXLF各剂量均有延长生存时间的趋势，生命延长率为12.27％～16.56％。结果见表2-2。

表2-2 FZXLF对S₁₈₀荷瘤小鼠腹水瘤的生命延长率的影响(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.1.3对S₁₈₀荷瘤小鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响

与正常对照组比较，模型对照组肿瘤小鼠T淋巴细胞加PHA刺激前后OD差值、OD增殖率显著降低(P<0.05)；与模型对照组比较，FZXLF三个剂量(6.0g·kg^-1、4.0g·kg^-1、2.0g·kg^-1)均有提高小鼠T淋巴细胞增殖的趋势，其中高剂量能明显提高T淋巴细胞OD增值率(P<0.05)。结果见表2-3。

表2-3 对S₁₈₀荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响(n＝12，)

与正常对照组比较：^△P<0.05^△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.2本发明中药制剂与环磷酰胺合用对S₁₈₀荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.2.1FZXLF联用CTX对S₁₈₀荷瘤小鼠抑瘤作用的影响

相比于模型对照组，FZXLF三个剂量组(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)与CTX(20mg·kg^-1)合用，小鼠瘤重均下降(P<0.05～0.01)；与单用CTX组相比，抑瘤率明显增加，抑瘤率分别为58.19％、41.49％、38.57％；各给药组胸腺指数均减少(P<0.01)。与单用CTX组相比，FZXLF6.0g·kg^-1合并CTX能升高脾指数。结果见表2-4。

表2-4 化药合用对小鼠腹水瘤S₁₈₀生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与化疗组比较：^#P<0.05^##P<0.01

与模型对照组比较，FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)与CTX(15mg·kg^-1)合用，小鼠瘤重显著下降(P<0.05～0.01)；相比于单用CTX组，6.0g·kg^-1抑瘤率显著增加，抑瘤率为59.36％；各给药组胸腺指数均减少(P<0.05～0.01)。与单用CTX组相比，FZXLF(2.0g·kg^-1)合用CTX能升高脾指数。结果见表2-5。

表2-5 化药合用对小鼠腹水瘤S₁₈₀生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与化疗组比较：^#P<0.05^##P<0.01

与模型对照组相比，FZXLF(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)与CTX(10mg·kg^-1)合用，小鼠瘤重均下降，其中6.0g·kg^-1合并CTX组下降明显；脾指数显著升高，胸腺指数降低(P<0.05～0.01)。结果见表2-6。

表2-6 化药合用对小鼠腹水瘤S₁₈₀生长的抑制作用(n＝10，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01与化疗组比较：^#P<0.05^##P<0.01

提示可能CTX在0.01～0.02之间对肿瘤小鼠的抑制作用无明显区别。结果见表2-7。

表2-7 不同剂量CTX组对S₁₈₀小鼠生长的影响

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.2.2FZXLF联用CTX对S₁₈₀荷瘤小鼠生命延长率的影响

与模型对照组相比，FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)合并CTX(20mg·kg^-1)提高延长肿瘤小鼠生命(P<0.05～0.01)，生命延长率为20.45％～43.18％。结果见表2-8。

表2-8 FZXLF对腹水瘤S₁₈₀小鼠生命延长率的影响(n＝8，)

与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

3.小结

单用本发明中药制剂FZXLF体内实验表明，对S₁₈₀肿瘤小鼠均有抑制肿瘤生长的作用，降低肿瘤重量，而且能够延长小鼠的生存时间；还稍有提高脾指数、胸腺指数和T淋巴细胞增殖能力，可能具有提高荷瘤小鼠的免疫功能作用。

通过本实验观察本发明中药制剂FZXLF与化疗药物CTX联合应用对抗小鼠S₁₈₀实体瘤的影响，结果发现，FFZXLF与CTX20mg·kg^-1合并给药对于治疗S₁₈₀效果最好；对于脾指数、胸腺指数有一定的升高作用，提示可能有改善免疫功能的作用。

(三)本发明中药制剂单用及与司莫司汀合用对C6荷瘤大鼠的抗肿瘤作用研究

1.实验方法

1.1动物分组

雄性Wistar大鼠，随机分为8组：模型对照组、FZXLF(1.2g·kg^-1)组、FZXLF(2.4g·kg^-1)组、FZXLF(3.6g·kg^-1)组、FZXLF+ME-CCNU(1.2g·kg^-1+23.3mg·kg^-1)组、FZXLF+Me-CCNU(2.4g·kg^-1+23.3mg·kg^-1)组、FZXLF+ME-CCNU(3.6g·kg^-1+23.3mg·kg^-1)组，Me-CCNU(23.3mg·kg^-1)组，每组10只。另设正常对照组6只，假手术组8只。

1.2模型制备

1.2.1细胞培养

⑴细胞培养及传代C6胶质瘤细胞在含10％FCS、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的DMEM完全培养基中，5％CO₂、37℃、饱和湿度条件下培养瓶中单层培养；每日显微镜观察细胞生长情况；隔日半量更换培养液；细胞呈成纤维细胞型半贴壁生长。细胞呈对数生长期时，倾出瓶中培养液，D-hanks液清洗1～2次，加入培养基1～2ml，用吸管反复轻轻吹打半贴壁细胞，使其形成细胞悬液，以合适的浓度接种于新的培养瓶中。

⑵细胞收集细胞呈对数生长期时，倾出瓶中培养液，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗，用吸管反复轻轻吹打半贴壁细胞，使细胞悬浮，移入离心管，1100r/min低速离心5分钟，快速倾去上清，加入5倍以上体积的PBS，吸管轻轻吹打均匀，1100r/min低速离心5分钟，倾出上清；如此漂洗2次后，加入定量PBS，吹打均匀。

⑶细胞计数取一滴细胞悬液滴入血球计数板的细胞计数池中，静置沉降1分钟，低倍镜下计数四大中格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为1，细胞总数按以下公式计算：细胞总数＝(四大中格细胞数/4)×l0000×细胞悬液总量(ml)。

⑷细胞冻存取对数生存期细胞，常规方法制备细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，1100r/min低速离心5分钟，快速倾去上清，加入细胞冻存液，吸管轻轻吹打，重新悬浮细胞，分装至冻存管，盖拧紧，记号笔作好标记，冻存。

⑸细胞活力检测取10μl细胞悬液，用PBS选择合适倍比稀释，加入台盼蓝染液混匀，取样，计数板下观察、计数100～200个细胞，活细胞圆形透明，死细胞蓝染，拒染活细胞>95％。

1.2.2动物模型制备^]

⑴麻醉和鼠颅固定：Wistar大鼠称重，按45mg·kg^-1体重腹腔注射浓度为3％戊巴比妥钠溶液麻醉后，术区剃毛，碘酒消毒、酒精脱碘各三遍，手术过程中注意保温。用脑立体定位仪固定大鼠头部，鼠颅依靠两耳棒及切牙钩三点固定。在向外耳道内插入耳棒时，鼠眼球向外凸出。一旦进入鼓膜环沟内，穿破鼓膜，则会发出轻微的“嘭”声响，同时出现眨眼反射，眼球不再凸出，说明耳棒进位正确。固定左、右侧耳棒，拧紧耳棒固定旋扭。接着，用定位仪上的切牙钩，钩住大鼠的切牙，要钩至牙根部，并固定之。鼠颅前固定点的正确与否，决定着鼠颅固定的前仰度是否合适。至此，鼠头应平稳地固定于立体定位仪上。

⑵靶点定位：大鼠头部正中纵向切口，用止血钳将头部皮肤左右分开，以刀片刮去颅盖骨膜，暴露颅骨，以大鼠颅顶的前囟点为定点，当微量注射器的针尖对准此点时，读取立体定位仪三维坐标上标尺数值，此数值即是“0”点坐标。靶点定位：大鼠右侧大脑尾状核，坐标为前囟中点前1.0mm，正中矢状线右侧旁开3.0mm处，然后，在此点用铅笔作一标记。用颅钻在靶点钻孔一枚，勿伤及硬脑膜，直径1.0mm。将注射器及其针头移至骨孔，核对骨孔的准确度，修正骨孔。

⑶细胞注射：用微量注射器吸取10μl细胞悬液，使其达到2×10⁶个细胞，垂直刺入硬脑膜6mm，退针1mm(距硬脑膜下5.0mm)，微量注射泵将细胞悬液以1μl/min的速度注入靶区，注射时间为10min，留针5min，使细胞充分沉积，避免返流。将针缓慢拔出之后，用骨蜡封闭骨孔，生理盐水冲洗手术部位，缝合皮肤后消毒皮肤，待大鼠苏醒之后单笼饲养。假手术组以PBS代替细胞悬液进行同样操作。术后三天腹腔注射青霉素预防感染。

1.3给药方法

本发明中药制剂各剂量组每日灌胃给药，连续14日。Me-CCNU组每周给药一次。给药容积均为1ml/100g。假手术组、模型组和正常对照组每日给予等体积的蒸馏水。

1.4指标测定

1.4.1肿瘤相关指标

⑴抑瘤率：末次给药后下腔静脉取血，处死大鼠，取脑，-20℃冷冻10分钟，沿注射针孔冠状切开，游标卡尺测定肿瘤长径(a)、短径(b)，按以下公式计算肿瘤体积及抑瘤率。肿瘤体积＝(a×b²)/2，抑瘤率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

⑵肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺素E₂(PGE₂)、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)、一氧化氮合成酶(NOS)含量：取瘤块制成10％组织匀浆，检测肿瘤组织VEGF、PGE₂、IGF-Ⅰ含量，NOS活性。

⑶血清一氧化氮(NO)、NOS含量：末次给药后下腔静脉取血，分离血清。测NO含量、NOS活性。

1.4.2免疫相关指标

⑴血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)含量：末次给药后下腔静脉取血，分离血清，测定TNF-α、IL-2、IFN-γ含量。

⑵血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)及补体C3，C4含量：末次给药后下腔静脉取血，分离血清。测定血清IgG、IgA、IgM及补体C3，C4、TNF-α、IL-2、IFN-γ、NO含量，NOS活性。

⑶血液流变学测定：末次给药后后下腔静脉取血，血流变仪测定低、中、高切变率下全血粘度及血浆粘度。

2.实验结果

2.1对脑胶质瘤大鼠肿瘤及相关指标的影响

2.1.1对脑胶质瘤大鼠肿瘤体积及抑瘤率的影响

与模型组相比，本发明中药制剂FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1对肿瘤体积均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为43.10％、53.13％、54.66％；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用对脑胶质瘤大鼠肿瘤体积均有明显的抑制作用(P<0.01)，抑制率分别为70.41％、70.60％、70.95％，能增强Me-CCNU的抑瘤作用。提示FZXLF单用即对C6脑胶质瘤有显著的抑制作用，与Me-CCNU合用能增强Me-CCNU抑瘤作用，有协同增效作用。结果见表3-1。

表3-1 对抑瘤率的影响

与C6脑胶质瘤组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.1.2对脑胶质瘤大鼠血清NO、TNOS、iNOS含量的影响

①与正常对照组相比，假手术组血清NO含量升高。与假手术组相比，模型组血清NO含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1单用及与Me-CCNU合用均能显著升高NO含量，Me-CCNU组NO含量显著降低(P<0.01)。②与正常对照组相比，假手术组血清TNOS含量略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清TNOS含量显著降低。与模型组相比，FZXLF3.6g·kg^-1组、FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组、Me-CCNU组血清TNOS含量均升高(P<0.01)。③各组iNOS含量无明显差异。结果见表3-2。

表3-2 血清NO、TNOS、iNOS含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.1.3对脑胶质瘤大鼠瘤组织TNOS、iNOS含量的影响

①与模型组相比，FZXLF1.2g·kg^-1与Me-CCNU合用组iNOS含量显著降低(P<0.01)，FZXLF2.4、3.6/g·kg^-1与Me-CCNU合用组iNOS含量有降低趋势(P>0.05)，作用较Me-CCNU组强。②各组组织TNOS含量无明显变化。结果见表3-3。

表3-3 对肿瘤组织TNOS、iNOS含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.1.4对脑胶质瘤大鼠肿瘤组织IGF-Ⅰ、PGE₂、VEGF含量的影响

①与正常对照组相比，假手术组组织IGF-Ⅰ含量略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组肿瘤组织IGF-Ⅰ含量明显升高(P<0.05)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1，FZXLF1.2、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用能降低肿瘤组织IGF-Ⅰ含量(P<0.05～0.01)。②与正常对照组相比，假手术组PGE₂含量无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组肿瘤组织PGE₂含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1，FZXLF1.2、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用能降低肿瘤组织PGE₂含量(P<0.05)。③与正常对照组相比，假手术组肿瘤组织VEGF含量无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组肿瘤组织VEGF含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组肿瘤组织VEGF含量明显降低(P<0.05～0.01)。结果见表3-4。

表3-4 对肿瘤组织IGF-Ⅰ、PGE₂、VEGF含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.2对免疫指标的影响

2.2.1对脑胶质瘤大鼠血清IgG、IgA、IgM含量的影响

①与正常对照组相比，假手术组血清IgG含量无明显变化。与假手术组相比，模型组血清IgG含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1组，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清IgG含量显著降低(P<0.01)。②与正常对照组相比，假手术组血清IgA含量略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IgA有降低趋势(P>0.05)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组血清IgA均显著升高(P<0.01)。③各组血清IgM无明显差异。结果见表3-5。

表3-5 对C血清IgG、IgA、IgM含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.2.2对脑胶质瘤大鼠血清IgG、IgA、IgM比例的影响

①与正常对照组相比，假手术组血清总Ig含量略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清总Ig含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1组，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清总Ig含量显著降低(P<0.01)。②与正常对照组相比，假手术组血清IgG比例无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IgG比例显著升高(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF3.6g·kg^-1，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清IgG比例显著降低(P<0.01)。③与正常对照组相比，假手术组血清IgA比例略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IgA比例显著降低(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF3.6g·kg^-1组，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清IgA比例显著升高(P<0.01)。④与正常对照组相比，假手术组血清IgM比例略有升高(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IgM比例显著降低(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1，FZXLF2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清IgM比例显著升高(P<0.01)。提示：脑胶质瘤发生时体内免疫环境有较复杂的改变，FZXLF对模型动物有一定的免疫增强作用。结果见表3-6。

表3-6 对血清Ig比例的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.2.3对脑胶质瘤大鼠血清补体C3、C4含量的影响

与正常对照组相比，假手术组血清补体C3含量略有降低(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清补体C3含量无明显变化(P>0.05)。与模型组相比，FZXLF1.2g·kg^-1，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组血清补体C3含量均明显升高(P<0.05～0.01)。各组血清补体C4含量无明显变化。提示：FZXLF有一定激活补体系统的作用。结果见表3-7。

表3-7 对血清补体C3、C4含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.2.4对脑胶质瘤大鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的影响

①与正常对照组相比，假手术组血清TNF-α含量无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清TNF-α含量降低(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能升高血清TNF-α含量(P<0.01)。②与正常对照组相比，假手术组血清IL-2含量略有上升(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IL-2含量降低(P<0.05)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能升高血清IL-2含量(P<0.05～0.01)。③与正常对照组相比，假手术组血清IFN-γ含量无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组血清IFN-γ含量降低(P<0.01)。与模型组相比，FZXLF1.2、2.4·kg^-1，FZXLF2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组血清IFN-γ升高(P<0.05～0.01)。结果见表3-8。

表3-8 对血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

2.3对脑胶质瘤大鼠血液流变学的影响

2.3.1对脑胶质瘤大鼠全血粘度的影响

①与正常对照组相比，假手术组全血粘度无明显变化。与假手术组相比，模型组低切下全血粘度明显升高(P<0.05)。与模型组相比，FZXLF3.6g·kg^-1，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用及Me-CCNU单用能明显降低低切下全血粘度(P<0.05)。②各组血浆粘度没有明显差异。结果见表3-9。

表3-9 对血液流变学的影响

与正常对照组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与假手术组相比：^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组相比:*P<0.05，**P<0.01

3.小结

综上所述，本发明中药制剂FZXKF1.2、2.4、3.6g·kg^-1对C6大鼠脑胶质瘤均有明显的抑制作用，作用机制可能为：①能促进活化的巨噬细胞产生大量的NO，从而对肿瘤细胞产生强大的细胞毒作用，同时能降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制肿瘤血管新生，对肿瘤生长产生强大的抑制作用；②抑制脑胶质瘤细胞合成和分泌IGF-1，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；③阻止肿瘤组织产生PGE₂，从而解除PGE₂引起的免疫抑制，遏制脑胶质瘤生长；④调节体液免疫，增加机体免疫因子的释放，从而增强荷瘤大鼠对肿瘤的抵抗作用；⑤降低荷瘤大鼠血液粘度，从而抵抗肿瘤侵袭转移。

本发明中药制剂FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与化疗药Me-CCNU合用，能增强Me-CCNU的抗肿瘤作用，同时改善Me-CCNU引起的免疫抑制及血清NO生成减少，降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制脑胶质瘤细胞合成和分泌IGF-1，阻止肿瘤组织产PGE₂，增加机体免疫因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的释放，对Me-CCNU抗肿瘤有减毒增效作用。

(四)本发明中药制剂单用对CTX致骨髓抑制的荷瘤小鼠血液学的作用研究

1.实验方法

1.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分为5组：正常对照组、模型对照组、FZXLF(6.0g·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)组，每组10只。

1.2模型制备

1.2.1肿瘤接种：取肝癌H₂₂细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1:4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下^[4]。

1.2.2白细胞减少模型：除正常对照组外，各组动物注射50mg·kg^-1CTX，1次/d，连续7天。

1.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的水，每日1次，连续7d，灌胃体积0.1mL/10g体重。

1.4指标测定

血液学指标：动物血液分析仪检测血中红细胞数量(RBC)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、血小板数量(PLT)、白细胞数量(WBC)。

2.实验结果：与正常对照组比较，模型对照组小鼠的WBC、MCH、PLT均出现下降(P<0.05)；与模型对照组比较，FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)能升高WBC、PLT，4.0g·kg^-1可升高MCH(P<0.05～0.01)。结果见表4-1。

表4-1 对小鼠红细胞、白细胞、平均血红蛋白、血小板的影响(n＝10)

与正常对照组比较：^△P<0.05^△△P<0.01与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

3.小结

本发明中药制剂FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)能够拮抗CTX所造成的血小板和白细胞下降作用，提示FZXLF可以改善放化疗引起的骨髓造血损伤，提高造血功能。

(五)本发明中药制剂单用对CTX致免疫抑制的荷瘤小鼠免疫功能的作用研究

1.实验方法

1.1动物分组

ICR小鼠，雌雄各半。随机分为5组：正常对照组、模型对照组、FZXLF(6.0g·kg^-1)组、FZXLF(4.0g·kg^-1)组、FZXLF(2.0g·kg^-1)组，每组10只。

1.2模型制备

1.2.1肿瘤接种：取肝癌H₂₂细胞腹腔内接种8天的ICR小鼠，无菌条件下用5mL注射器取吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，用生理盐水1:4倍稀释，得到约1.0×10⁶个/ml的瘤株稀释液，每只小鼠0.1mL接种左前肢腋窝皮下。

1.2.2免疫抑制模型：第4d后，除正常对照组外，各组动物注射50mg·kg^-1CTX，隔日注射，连续3天。

1.2.3免疫反应制备：第10d后，除正常对照组外，其余各组小鼠iP.20％SRBC0.2mL进行免疫，免疫3天。

1.3给药方法

本发明中药制剂FZXLF各给药组分别按6.0g·kg^-1、4.0gkg^-1、2.0g·kg^-1灌胃给予肿瘤小鼠。正常对照组、模型对照组均灌相应体积的水，每日1次，连续14d，灌胃体积为0.1mL/10g体重。

1.4指标测定

1.4.1血清溶血素：在末次给药后第2天，摘除眼球取血于离心管内，放置1h，离心2000r·min^-1，10min，收集血清，用生理盐水做200倍稀释；取稀释的血清1mL、10％SRBC0.5ml、1:8稀释的补体0.5mL混合于试管中，对照管以生理盐水代替血清。所有试管在37℃水浴1h(中间摇动1次)，冰浴终止反应，离心3000r·min^-1，10min，取上清液1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％SRBC0.25mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于波长540nm处以对照管做空白，分别测定各管光密度值，按下面公式计算半数溶血值(HC50)。

HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×血清稀释倍数。

1.4.2抗体形成细胞：在末次给药后第2天，取脾，按15mg·mL^-1制成脾细胞悬液，每管依次加入脾细胞悬液、0.2％SRBC、1:8豚鼠血清各0.5mL，混匀，以生理盐水代替豚鼠血清作空白对照，所有试管在37℃水浴1h，冰浴终止反应，离心3000r·min^-1，10min，取上清液。用酶标仪于波长413nm测吸光度值。

2.实验结果

2.1对免疫功能低下小鼠血清溶血素的影响

与正常对照组比较，CTX可以明显抑制机体的免疫功能，肿瘤小鼠血清溶血素水平(HC₅₀)显著降低(P<0.01)；与模型对照组比较，FZXLF三个剂量组(6.0g·kg^-1、4.0g·kg^-1、2.0g·kg^-1)均有提高小鼠血清溶血素含量的趋势。结果见表5-1。

表5-1 对免疫功能低下小鼠血清溶血素的影响

与正常对照组比较：^△P<0.05^△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

2.2对免疫功能低下小鼠抗体形成细胞的影响

与正常对照组比较，CTX可以明显抑制机体的免疫功能，抗体形成细胞生成的水平降低(P<0.05)；与模型对照组比较，FZXLF三个剂量组(6.0g·kg^-1、4.0g·kg^-1、2.0g·kg^-1)均有提高小鼠T淋巴细胞增殖的趋势，呈剂量正相关关系，其中高剂量组升高明显。结果见表5-2。

表5-2 对免疫功能低下小鼠抗体形成细胞的影响

注：与正常对照组比较：^ΔP<0.05^ΔΔP<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05**P<0.01

3.小结

本实验研究FZXLF三个不同剂量组对环磷酰胺所致的免疫功能低下血清溶血素、抗体形成细胞水平的影响。结果表明FZXLF三个不同剂量组对CTX免疫抑制小鼠的血清溶血素有升高趋势，其中高剂量组具有统计学意义；能提高CTX免疫抑制小鼠的抗体形成细胞，与剂量呈一定程度的正相关。说明FZXLF具有升高血清溶血素、抗体形成细胞的趋势，从而起到了增强肿瘤小鼠的免疫力而抑制肿瘤的生长。

三、分析与讨论

(一)本发明中药制剂对S₁₈₀及H₂₂荷瘤小鼠的影响

1.对H₂₂、S₁₈₀荷瘤小鼠抗肿瘤的分析

本实验主要观察灌胃给药后，研究本发明中药制剂FZXLF不同剂量对H₂₂、S₁₈₀荷瘤小鼠的影响。由实验结果可看出FZXLF对H₂₂实体瘤、S₁₈₀腹水瘤瘤重都具有抑制作用，与上述体重变化相对应，对H₂₂实体瘤最高抑制率为32.37％，对S₁₈₀腹水瘤的最高抑制率为33.10％，抑制率相当但均不高，同时一定程度上能延长小鼠的生存时间。FZXLF三个给药组对荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数无明显的影响，但与阳性组比较，对荷瘤小鼠均有升高作用，提示单用FZXLF对免疫器官的影响不大，但相比与化疗药，其有改善免疫的功能。总体而言，FZXLF对两种肿瘤均具有抑制作用，相比于化疗药，可能还具有提高免疫功能的作用。

2.对荷瘤小鼠生命延长率的分析

生命延长率是验证一种药物是否有效的一个药效学的整体评估指标。实验期间逐日记录动物的死亡情况。对照组动物通常在2～3周内全部死亡，个别存活时间太长需剔除，但各组相应地剔除一只。如在给药期间给药组动物于7日内死亡超过20％，表示实验失败。如对照组内20％动物存活4周以上，实验亦应作废，治疗组观察时间一般为50d左右。分别记录对照组和各给药组平均生存时间，以生命延长率为其评价标准。

药物对荷瘤小鼠存活期的影响，有着直接抑瘤和减毒两方面的意义。很多中药都有文献报道有延长荷瘤小鼠存活期的作用。本实验中FZXLF各剂量组与模型对照组相比，均有延长H₂₂、S₁₈₀肿瘤小鼠存活天数的趋势，6.0g/kg对两种肿瘤模型的作用最佳，其中对H₂₂最高生命延长率为27.22％，对S₁₈₀为16.56％。

3.对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的分析

淋巴细胞增殖活性的检测在评价细胞免疫功能中具有重要意义。MTT法是通过颜色反应观察细胞代谢活化的程度，直接检测活性细胞的比例。利用该法可反映从受试机体分离的淋巴细胞、或体外培养的受试淋巴细胞受特异性刺激时的增殖情况。又因为该法排除形态观察法的主观差异性，避免同位素掺入法的不稳定性和放射性污染，具有大量样本快速检测的优点，所以可用于检测外源性受试物在体内和体外试验中对淋巴细胞增殖功能的影响及剂量--效应和时间--效应关系的观察，从而评价受试物对淋巴细胞或机体免疫功能的作用。

本实验检测结果显示，FZXLF(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)对H₂₂、S₁₈₀荷瘤小鼠均具有提高脾T淋巴细胞转化增殖的能力，提示可能具有增强免疫的功效，其中FZXLF(6.0g·kg^-1)对H₂₂、S₁₈₀荷瘤小鼠的增殖率具有统计学差异，其他给药组具有升高趋势，说明FZXLF可能存在剂量正相关性，有待进一步研究。

综上所述可知，对于H₂₂荷瘤小鼠：相比于单用的化疗组，FZXLF(6.0、4.0、2.0g·kg^-1)三个剂量合用不同剂量CTX(10、15、20mg·kg^-1)瘤重明显下降，抑瘤率显著升高，其中以联用CTX10mg·kg^-1效果最为明显；各给药组均具有升高脾指数、胸腺指数的作用。不同剂量CTX之间对于H₂₂小鼠的影响无明显差异，故随着FZXLF与CTX的联用，抑制肿瘤的生长明显升高，提示可能是因为FZXLF可以与CTX合用产生增效的作用。6.0g·kg^-1还能延长小鼠生存时间，提示在这个剂量下，FZXLF可能还具有一定的解毒功效。

对于S₁₈₀荷瘤小鼠：FZXLF三个剂量组与不同剂量CTX(10、15、20mg·kg^-1)合用可以看出，FZXLF合并CTX(20mg·kg^-1)抑瘤效果明显最好，其中FZXLF6.0g·kg^-1合并CTX(15、20mg·kg^-1)能下降瘤重，升高抑瘤率(P<0.05)；各合并给药组相比于化疗组，有升高脾指数、胸腺指数的作用，说明对于肿瘤小鼠免疫器官有很好的改善作用。不同剂量的CTX之间对于S₁₈₀小鼠的影响无明显差异，故随着FZXLF与CTX的联用，抑制肿瘤的生长明显升高，提示可能是因为FZXLF可以与CTX合用产生增效的作用。6.0、4.0g·kg^-1还能延长小鼠生存时间，提示FZXLF4.0～6.0g·kg^-1的剂量可能还具有一定的解毒功效。

4.对荷瘤小鼠血液学的分析

放化疗引起的骨髓造血抑制，其骨髓病理改变主要表现为造血总面积减少，红髓被脂肪组织所替代或间质水肿；造血细胞单位面积内细胞数减少；基质水肿、出血、细胞外溢；脂肪组织比例明显增多，可见液性脂肪坏死区及坏死细胞；非造血细胞相对增加。CTX是通过DNA为靶点杀伤肿瘤细胞的，对肿瘤细胞和正常细胞没有选择性，因此在杀伤肿瘤细胞的同时，导致增殖旺盛的骨髓造血细胞DNA结构破坏或阻止DNA合成，引起骨髓造血功能损伤，主要表现为外周血白细胞总数，血小板数，骨髓有核细胞数，骨髓白细胞系淋巴细胞数显著减少，血红蛋白含量降低。

本实验肿瘤H₂₂模型小鼠白细胞总数、血小板数、平均血红蛋白均显著下降，而FZXLF(6.0、4.0g·kg^-1)给药组能够拮抗CTX所造成的血小板和白细胞下降作用，提示FZXLF可以改善放化疗引起的骨髓造血损伤，提高造血功能。

5.总结

本发明中药制剂由人参、半枝莲、莪术、夏枯草等11味中药组成。现代药理研究表明，人参(Panax ginseng C.A.Mey)，为五加科多年牛草本植物，主要活性成分为人参皂苷和人参多糖，性甘、微苦；微温、有大补元气、补气益肺、生津止渴、安神益之功效。半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)，又名狭叶韩信草，具有良好的抗肿瘤活性，其主要功能为清热解毒，利尿消肿，止血化瘀等，研究表明可提高小鼠溶血素水平，抑制S₁₈₀荷瘤小鼠肿瘤的生长。莪术Rhizoma Curcumae Curcuma zedoaria(Berg.)Rosc，辛、苦，性温，归肝、脾经，具行气破血、消积止痛之效，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎止痛、增强免疫等药理作用^[13]。另外对于其他成分夏枯草等也均有文献报道在提高免疫、预防和治疗肿瘤方面具有较好的药理活性。

(二)本发明中药制剂对C6荷瘤大鼠的影响

1.对荷瘤大鼠抗肿瘤作用的分析

1.1肿瘤体积和抑瘤率

对肿瘤生长的抑制作用是评价药物抗肿瘤药效最直观、最有力的指标。本实验研究中，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1三个剂量对大鼠C6脑胶质瘤肿瘤体积均有明显的抑制作用，抑制率分别达43.10％、53.13％、54.66％；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用对脑胶质瘤大鼠肿瘤体积均有明显的抑制作用，抑制率分别为70.41％、70.60％、70.95％，能增强Me-CCNU的抑瘤作用；同时对脑指数无明显影响。提示：FZXLF单用即对C6脑胶质瘤有显著的抑制作用，与Me-CCNU合用能增强Me-CCNU的抑瘤作用，有协调增效作用。

1.2NO及NOS

NO是作为一种活跃的信使分子，通过多种机制影响着脑胶质瘤的生长、分化及脑肿瘤屏障的开放。一方面，NO是近年来新发现的一种血管形成调节因子，肿瘤组织可通过自分泌细胞因子诱导iNOS产生而调节NO的合成，NO可诱导内皮的分裂、增生，调节肿瘤血管新生，调控肿瘤血流量，因而NO可能是肿瘤生长必要的血管形成开关；没有NO，生长中的肿瘤其大小将会因血供的缺乏而受到限制。另一方面，活化的巨噬细胞产生的NO可抑制肿瘤细胞的呼吸链、DNA复制等而发挥细胞毒性作用，抑制细胞生长，导致细胞死亡。本实验研究中，模型组血清NO含量显著升高，TNOS含量显著降低，iNOS含量无明显变化；肿瘤组织TNOS和iNOS含量均有升高趋势。提示肿瘤的入侵，诱导活化了机体巨噬细胞，使其产生了大量NO以抵抗肿瘤的入侵；同时，肿瘤组织通过自分泌细胞因子诱导iNOS产生而增加NO的合成，促进肿瘤组织血管生成，从而促进肿瘤生长。FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能显著升高血清NO含量，高剂量还能显著升高血清TNOS含量，但对血清iNOS无明显影响；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1对肿瘤组织TNOS和iNOS均有一定的降低作用；提示FZXLF各剂量能促进活化的巨噬细胞产生大量的NO，从而对肿瘤细胞产生强大的细胞毒作用，同时能降低肿瘤组织TNOS和iNOS，抑制肿瘤血管新生，对肿瘤生长产生强大的抑制作用。Me-CCNU组NO含量显著降低，FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组血清NO含量显著升高，Me-CCNU单用及与FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1合用组血清TNOS含量均显著升高，对iNOS含量无明显影响，提示Me-CCNU对巨噬细胞释放细胞毒性NO有明显的抑制作用，FZXLF可改善其对巨噬细胞的抑制作用。Me-CCNU单用及与FZXLF各剂量合用对瘤组织TNOS及iNOS含量均有不同程度的降低作用，FZXLF与Me-CCNU合用较Me-CCNU单用作用更强，提示Me-CCNU对肿瘤组织血管增生有一定的抑制作用，FZXLF与其有协同增效作用。

1.3瘤组织VEGF

肿瘤的持续生长和转移有赖于血管生成新生血管供给肿瘤生长所需要的氧、营养物质。肿瘤需要功能性的血管网络提供氧气、养料并清除代谢产物，因此,肿瘤必须通过形成新生血管网构建自己的血管系统，这样才能持续地生长和发展。如果没有血管系统提供氧气和养料，实体瘤的增长会受到抑制，抗血管生成治疗的研究成为现今肿瘤治疗的热点。研究证明，VEGF/VEGFR系统是唯一的血管内皮细胞特异性生长调节因子系统。在脑胶质瘤中存在着VEGF和VEGFR的过度表达，VEGF表达与微血管密度显著相关，其表达水平随肿瘤的恶性程度升高而增强。这证明VEGF对胶质瘤的生长和新生血管生成有重要影响。本实验研究中，模型组肿瘤组织VEGF含量显著升高，提示肿瘤组织有血管新生。FZXLF各剂量均能明显降低肿瘤组织VEGF含量，提示抗血管生成是FZXLF抗C6大鼠脑胶质瘤的作用机制之一；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组肿瘤组织VEGF含量明显降低，提示抗血管生成可能是Me-CCNU与FZXLF共同的作用机制。

1.4瘤组织PGE₂

正常人机体免疫监视机制可以防止胶质瘤的发生,但胶质瘤细胞生长过程中，可以分泌免疫抑制因子，抑制细胞免疫功能，这可能是胶质瘤逃避免疫监视的方式之一。有报道脑胶质瘤细胞可以分泌PGE₂及PGE₂β两种免疫因子，它们在体内均有免疫抑制性,且在胶质瘤患者血浆中及胶质瘤细胞培养液中均可检测到。1982年Kedar发现小鼠神经母细胞瘤组织中含有大量的PGE₂，其他学者在对小鼠神经细胞瘤、大鼠神经胶质瘤体外培养时,也证明胶质瘤细胞合成PGE₂要比正常小鼠脑组织高得多。大量实验表明，PGE₂对人体T细胞亚群、NK细胞活性、LAK细胞活性、TIL、TNF、IL-2等均有免疫抑制作用，肿瘤组织中及血浆中过量的PGE₂可能是造成局部及全身免疫功能受损的原因之一,以致肿瘤生长不受限制。本实验研究中，模型组肿瘤组织PGE₂含量显著升高，提示C6胶质瘤模型大鼠机体存在强烈的免疫抑制。FZXLF各剂量均能明显降低肿瘤组织PGE₂含量；FZXLF低、高剂量与Me-CCNU合用亦能降低肿瘤组织PGE₂含量。提示解除肿瘤组织PGE₂引起的免疫抑制，从而遏制脑胶质瘤生长可能是FZXLF抗脑胶质瘤的作用机制之一。

1.5瘤组织IGF-Ⅰ

IGF-Ⅰ是生长激素(GH)依赖的生长因子，在体内的表达受生长激素/胰岛素样生长因子轴的调节。IGF-Ⅰ普遍存在于组织器官中，主要存在于血液中，具有类似生长激素和胰岛素刺激组织生长发育、细胞有丝分裂等作用，而且被认为是细胞的有丝分裂原。血液中的IGF-Ⅰ主要由肝脏合成分泌，局部组织如骨髓、脑及多种肿瘤细胞都产生和分泌IGF-Ⅰ。IGF-Ⅰ也可以在脑内合成，并可从血浆中通过血脑屏障而被脑摄取。目前IGF系统与肿瘤的关系是近年研究的热点。IGF-Ⅰ通过其受体IGF-ⅠR起作用，二者结合后激活酪氨酸蛋白激酶发挥信号转导作用而产生一系列生物学效应，主要是模拟GH促进细胞增殖、抑制凋亡及类胰岛素代谢作用。IGF-ⅠR还可以通过与其他生长因子的信号传导通路相互作用及与其他癌基因协同作用等几种机制实现其促肿瘤作用。研究发现，高级别组脑胶质瘤患者血清中IGF-Ⅰ水平显著高于低级别组IGF-Ⅰ水平,且均显著高于正常人。本实验研究中，模型组肿瘤组织IGF-Ⅰ含量明显升高。FZXLF各剂量均能降低肿瘤组织IGF-Ⅰ含量；FZXLF低、高剂量与Me-CCNU合用组亦能降低肿瘤组织IGF-Ⅰ含量。提示FZXLF对脑胶质瘤细胞合成和分泌IGF-Ⅰ有一定的抑制作用，从而达到抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

2.对荷瘤大鼠免疫功能作用的分析

2.1免疫球蛋白：Ig的产生及其类型转换是一种程序化过程,受多种因素制约。机体与疾病相互作用的结果有可能在Ig各类型比例上得到反映；临床研究发现，不同种类的恶性肿瘤患者血清IgG、IgM、IgA含量及比例变化情况不一^]。本实验研究中，模型组血清IgG含量显著升高，IgA含量有降低趋势，IgM含量有升高趋势。FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能显著降低血清IgG含量，对血清IgA含量无明显影响，对血清IgM含量有一定的降低作用；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组血清IgG含量显著降低，IgA均显著升高，IgM含量略有升高。模型组血清Ig池量显著升高，IgG比例显著升高，IgA比例显著降低，IgM比例显著降低。FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能显著降低血清Ig池，不同程度的降低IgG比例，不同程度的升高IgA比例，显著升高IgM比例；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用能显著降低血清Ig池及IgG比例，显著升高IgA比例及IgM比例。提示FZXLF对脑胶质瘤模型体液免疫紊乱有一定的调节作用；FZXLF与Me-CCNU合用能增强对脑胶质瘤模型体液免疫紊乱的调节。

2.2补体：与正常对照组相比，假手术组血清补体C3含量略有降低。与假手术组相比，模型组血清补体C3含量无明显变化。与模型组相比，ZXLF1.2g·kg^-1明显升高血清补体C3含量；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组血清补体C3含量均明显升高。各组血清补体C4含量无明显变化。提示：FZXLF有一定激活补体系统的作用。

2.3血清TNF-α、IL-2、IFN-γ

IL-2是T_H细胞产生的细胞因子，可通过T细胞、NK细胞、及LAK细胞的增生活化而发挥抗肿瘤作用。众多资料表明，多数肿瘤患者IL-2产生能力下降。动物实验证明，带瘤机体T细胞及MΦ内TNFmRNA的表达明显低于正常组，而且T细胞对多种有丝分裂原及外源性细胞因子的刺激无反应，表明带瘤机体T细胞功能下降的原因之一可能与TNF缺乏有关。另外，IFN-γ不仅能增强NK细胞及MΦ的抗肿瘤作用，还能在适当浓度下增强IL-2对LAK细胞的诱导，并提高其杀伤活性。肿瘤的进行性生长，同样可使IFN-γ的产生降低。本实验研究中，脑胶质瘤模型血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量显著降低；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能显著升高血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量。FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用对血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量有不同程度的升高。提示FZXLF可通过刺激免疫细胞产生抗肿瘤免疫因子发挥抗脑胶质瘤的作用。

3.对荷瘤大鼠血液流变学作用的分析

血液流变学反映血液粘滞性变化，间接反应肿瘤的侵袭转移能力。本实验研究中，脑胶质瘤模型低切下全血粘度明显升高，中、高切下全血粘度有升高趋势，血浆粘度无明显变化。FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1能不同程度的降低低、中、高切变率下全血粘度及血浆粘度；FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与Me-CCNU合用组及Me-CCNU单用组能不同程度的降低低、中、高切变率下全血粘度及血浆粘度。提示FZXLF有一定的抗肿瘤侵袭转移作用。

4.总结

综上所述，本发明中药制剂FZXKF1.2、2.4、3.6g·kg^-1对C6大鼠脑胶质瘤均有明显的抑制作用，其作用机制可能为：①能促进活化的巨噬细胞产生大量的NO，从而对肿瘤细胞产生强大的细胞毒作用，同时能降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制肿瘤血管新生，对肿瘤生长产生强大的抑制作用；②抑制脑胶质瘤细胞合成和分泌IGF-1，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；③阻止肿瘤组织产生PGE₂，从而解除PGE₂引起的免疫抑制，遏制脑胶质瘤生长；④调节体液免疫，增加机体免疫因子的释放，从而增强荷瘤大鼠对肿瘤的抵抗作用；⑤降低荷瘤大鼠血液粘度，从而抵抗肿瘤侵袭转移。

FZXLF1.2、2.4、3.6g·kg^-1与化疗药Me-CCNU合用，能增强Me-CCNU的抗肿瘤作用，同时改善Me-CCNU引起的荷瘤大鼠免疫抑制及血清NO生成减少，降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制脑胶质瘤细胞合成和分泌IGF-1，阻止肿瘤组织产PGE₂，增加机体免疫因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的释放，对Me-CCNU抗肿瘤有减毒增效作用。

四、结论

主要药效学研究结果表明，采用ICR小鼠右前肢皮下接种H₂₂肝癌细胞和S₁₈₀肉瘤细胞制备两种小鼠移植瘤模型，采用Wistar大鼠脑右侧尾状核原位接种C6脑胶质瘤细胞建立大鼠脑胶质瘤原位移植模型等。扶正消瘤提取物单用对C6脑胶质瘤、S180肉瘤及H22肝癌具有明显的抗肿瘤作用，且与化药(环磷酰胺、司莫司汀)合用能增强化药的抑瘤作用，还具有改善化药引起的骨髓和免疫抑制等作用，起到增效减毒的疗效。其抗肿瘤作用机制可能为①促进活化的巨噬细胞产生大量的NO，对肿瘤细胞产生细胞毒作用，同时能降低肿瘤组织TNOS、iNOS及VEGF，抑制肿瘤血管新生；②抑制肿瘤细胞合成和分泌IGF-1，抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡；③阻止肿瘤组织产生PGE2，解除其引起的免疫抑制，遏制肿瘤生长；④调节体液免疫，增加机体免疫因子的释放，增强对肿瘤的抵抗作用；⑤降低血液粘度，从而抵抗肿瘤侵袭转移。为临床治疗高尿酸血症提供了依据。

Claims (4)

1.一种治疗恶性肿瘤的中药制剂，其特征在于由下列重量份数的原料药制备而成：黄芪10～20g，人参5～15g，夏枯草10～25g，甘草2～5g，莪术20～25g，半枝莲25～30g，干蟾5～10g，猫爪草15～20g，猪苓20～25g，水牛角20～25g，仙鹤草25～30g。

2.根据权利要求1所述的治疗恶性肿瘤的中药制剂，其特征在于由下列重量份数的原料药制备而成：黄芪10g，人参15g，夏枯草10g，甘草5g，莪术25g，半枝莲30g，干蟾10g，猫爪草20g，猪苓25g，水牛角25g，仙鹤草30g。

3.根据权利要求1所述的治疗恶性肿瘤的中药制剂，其特征在于由下列重量份数的原料药制备而成：黄芪20g，人参15g，夏枯草25g，甘草5g，莪术20g，半枝莲25g，干蟾10g，猫爪草15g，猪苓20g，水牛角20g，仙鹤草25g。

4.权利要求书1至3所述治疗恶性肿瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a.取莪术粉碎过20目筛，加12倍量水浸泡4小时，水蒸气蒸馏5小时，分取莪术油,加无水乙醇稀释后，在搅拌下滴加入到环糊精饱和溶液中，搅拌2小时，0-5℃冷冻24小时，过滤，低温干燥，干燥后密封，提取液备用，药渣转入c；

b.取人参、猪苓、黄芪、干蟾、水牛角、猫爪草、甘草加12倍量70％乙醇加热回流提取2小时，提取3次，2、3次分别用10倍、8倍量70％乙醇,合并提取液过滤，回收乙醇，药液备用,药渣转入c；

c.取仙鹤草、夏枯草、半枝莲及上述a、b药渣加10倍量水煮液提取1.0小时，提取3次，2、3次分别用8倍、8倍量水,合并提取液过滤，浓缩至相对密度约为1.2，醇沉24小时，回收乙醇，药液备用,弃去药渣；

将a、b、c三步提取液合并减压浓缩至1.2，减压干燥后粉碎，加入莪术油环糊精饱和物、辅料适量混合均匀制成颗粒剂。