CN110357931A - 一种高纯度黄芩苷的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度黄芩苷的制备方法及其应用，其制备方法为(1)黄芩药材的研磨过筛，(2)闪式提取法提取得到提取液，(3)提取液的过滤，(4)滤过液减压浓缩至油状物，(5)油状物加水加热混均，(6)将混均液加入到大孔吸附树脂柱中进行吸附洗脱得到洗脱液，(7)用酸调节pH至1~3，然后降温析晶、抽滤、干燥得到高纯度黄芩苷。黄芩苷在N,N‑二甲基甲酰胺或者N,N‑二甲基乙酰胺中的溶解度比较大，在闪式提取过程中提高了黄芩苷的收率，且溶剂使用量较少，在该溶剂中黄芩苷不易分解；本发明减蒸得到的N,N‑二甲基甲酰胺或者N,N‑二甲基乙酰胺可以重复使用；本发明的制备方法操作简单、生产成本低、易于实现工业化生产。

Description

一种高纯度黄芩苷的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药活性成分的提取及应用领域，具体涉及高纯度黄芩苷的制备方法及其应用。

背景技术

黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，为常用中药，其根性寒味苦，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。临床上广泛用于肺热、咯血、肠炎痢疾、黄疽、高血压及化脓性感染等症。黄芩苷是黄芩中主要的药用成分，具有多种显著的生物活性，包括抗炎、抗病毒、抗肿瘤、化学预防等。黄芩苷作为药物在临床上用于肺炎、肝炎、感染等疾病，如黄芩苷片，黄芩苷胶囊等。

黄芩苷的提取工艺通常为水溶液中的酸碱工艺，该工艺由于酸化时快速形成很细的黄芩苷无定形结晶，夹带了大量的杂质，难以达到很高的纯度。高纯度的黄芩苷通常需要在有机溶剂中制取，目前黄芩苷的纯化以酸碱处理工艺和树脂吸脱为主。

2008年北京中医药大学王庆国等(CN 101475618A)公开了一种注射用黄芩苷的精制方法，通过加热碱溶、过滤、酸化、过滤、洗涤等工艺，得到纯度在92 ％以上的黄芩苷。2009年贾继明等(CN 200910075217.8)公开了一种黄芩苷粗品的精制方法，采用乙醇、盐酸、氢氧化钠及去离子水分步除去不同极性的杂质，得到纯度98％以上的黄芩苷，但是黄芩苷在碱性条件下不稳定，容易分解。

2011年沈阳药科大学邱峰等(CN102584918)公开了一种制备高纯度黄芩苷的方法以大孔吸附树脂吸附，0-30％的乙醇水洗脱除掉杂质，继续用40-60％的乙醇水洗脱，洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，得到黄芩苷含量大于80％的粗品，该粗品用乙醇/水/乙酸溶剂系统在进行重结晶，得到的产品为淡黄色，经高效液相检测，纯度在98％以上，但是该专利方法制备的黄芩苷收率比较低。

2015年山西大学周玉枝等(CN104829666)公开了一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法，黄芩苷的纯化步骤比较繁琐，收率较低，不适合大批量的生产。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高纯度、高收率的黄芩苷的制备方法，以及通过该方法制备的黄芩苷在抗H9N2亚型禽流感病毒中的应用。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种高纯度黄芩苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)、取黄芩药材，研磨，过10～30目筛，得到黄芩粗粉；

(2)、将黄芩粗粉浸泡于非质子性溶剂中，采用闪式提取法提取2～3次，得到提取液；

(3)、将步骤(2)得到的提取液进行过滤，收集滤过液；

(4)、将步骤(3)得到的滤过液进行减压浓缩，浓缩至油状物；

(5)、向步骤(4)的油状物中加入到4～8倍重量的水中，加热至50～70℃搅拌混均，得到混均液；

(6)、将混均液加入到大孔吸附树脂柱中进行吸附，然后用2～5BV的水洗脱，再用2～6BV的10～30％的乙醇水溶液洗脱，最后用35～50％的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液；

(7)、向洗脱液中加入一定量的酸调节pH至1～3，然后自然冷却至室温，静止析晶6～10h，抽滤、滤饼用水洗涤至Ph至6～7，干燥得到高纯度黄芩苷。

进一步地，所述的非质子性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种。

步骤(2)所述黄芩粗粉和非质子性溶剂的质量比为1:(4～7)。

步骤(6)所述大孔吸附树脂型号选自HPD-100、HPD-300、HPD-450、 HPD-500、D-101中的一种。

步骤(7)所述酸为无机酸，所述无机酸选自硫酸、乙酸、盐酸中的一种。

步骤(7)所述干燥的温度为50～80℃，干燥时间为4～6h。

更进一步地，通过上述方法制备的高纯度黄芩苷在抗H9N2亚型禽流感病毒中的应用。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果包括：

黄芩苷在非质子性溶剂(N,N-二甲基甲酰胺或者N,N-二甲基乙酰胺)中的溶解度比较大，在闪式提取过程中可以提取出较多的黄芩苷，提高了黄芩苷的收率，且溶剂使用量较少，在N,N-二甲基甲酰胺或者N,N-二甲基乙酰胺中黄芩苷比较稳定，不易分解。本发明减蒸得到的N,N-二甲基甲酰胺或者N,N-二甲基乙酰胺可以重复循环使用。本发明通过提取液的初步过滤、混均液在大孔吸附树脂柱中的吸附洗脱除去了大量的杂质，使得步骤(7)洗脱液加酸调pH降温析晶过程中，不会在析出的晶体中夹带较多的杂质，最终得到黄芩苷纯度较高，纯度高于98％。本发明的制备方法操作简单、生产成本低、易于实现大规模工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

黄芩苷的HPLC测定方法为：等度洗脱，检测波长280nm，柱温25℃，流动相：甲醇-0.2％磷酸水溶液(47:53)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。HPLC 测定方法按照黄芩苷标准(标准号WS-10001-(HD-0989)-2002)检测，出处《化学药品地方标准上升国家标准(第十册)》D10-239。

实施例1

一种高纯度黄芩苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)、取100g黄芩药材，研磨，过10目筛，得到黄芩粗粉；

(2)、将黄芩粗粉浸泡于6倍重量的N,N-二甲基甲酰胺中，采用闪式提取法提取2次，得到提取液；

(3)、将步骤(2)得到的提取液进行抽滤，收集滤过液；

(4)、将步骤(3)得到的滤过液进行减压浓缩(0.098MPa，80℃)，浓缩至油状物；

(5)、向步骤(4)的油状物中加入到4倍油状物重量的水中，加热至60℃搅拌混均，得到混均液；

(6)、将混均液加入到HPD-100型大孔吸附树脂柱中进行吸附，然后用4BV 的水洗脱，再用4BV的20％的乙醇水溶液洗脱，最后用50％的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液；

(7)、向洗脱液中加入一定量的盐酸调节pH至1，然后自然冷却至室温，静止析晶6h，抽滤、滤饼用水洗涤至pH至6，65℃下干燥5h后得到9.1g黄芩苷，经HPLC分析黄芩苷的含量为98.86％。

实施例2

一种高纯度黄芩苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)、取黄芩药材，研磨，过20目筛，得到黄芩粗粉；

(2)、将黄芩粗粉浸泡于4倍重量的N,N-二甲基甲酰胺中，采用闪式提取法提取3次，得到提取液；

(3)、将步骤(2)得到的提取液进行抽滤，收集滤过液；

(4)、将步骤(3)得到的滤过液进行减压浓缩(0.098MPa，80℃)，浓缩至油状物；

(5)、向步骤(4)的油状物中加入到6倍油状物重量的水中，加热至50℃搅拌混均，得到混均液；

(6)、将混均液加入到HPD-300型大孔吸附树脂柱中进行吸附，然后用2BV 的水洗脱，再用2BV的10％的乙醇水溶液洗脱，最后用40％的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液；

(7)、向洗脱液中加入一定量的硫酸调节pH至3，然后自然冷却至室温，静止析晶8h，抽滤、滤饼用水洗涤至pH至6，80℃下干燥4h后得到8.8g黄芩苷，经HPLC分析黄芩苷的含量为98.71％。

实施例3

一种高纯度黄芩苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)、取黄芩药材，研磨，过30目筛，得到黄芩粗粉；

(2)、将黄芩粗粉浸泡于7倍重量的N,N-二甲基乙酰胺中，采用闪式提取法提取2次，得到提取液；

(3)、将步骤(2)得到的提取液进行抽滤，收集滤过液；

(4)、将步骤(3)得到的滤过液进行减压浓缩(0.098MPa，80℃)，浓缩至油状物；

(5)、向步骤(4)的油状物中加入到8倍油状物重量的水中，加热至70℃搅拌混均，得到混均液；

(6)、将混均液加入到HPD-450型大孔吸附树脂柱中进行吸附，然后用5BV 的水洗脱，再用6BV的30％的乙醇水溶液洗脱，最后用35％的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液；

(7)、向洗脱液中加入一定量的乙酸调节pH至2，然后自然冷却至室温，静止析晶10h，抽滤、滤饼用水洗涤至pH值7，50℃下干燥6h后得到8.7g黄芩苷，经HPLC分析黄芩苷的含量为98.91％。

实施例4

黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感小鼠的T淋巴细胞亚群的影响

本实施例使用BD LSRII型流式细胞仪。

使用的主要试剂：

(1)病毒株：为H9N2亚型禽流感病毒毒株，由中国农业大学实验室惠赠。

(2)黄芩苷，由实施例1的方法制备得到。

(3)利巴韦林片，购于中国药品检察所(批号：140629)

(4)红细胞裂解液，购于北京赛驰生物有限公司(批号：110002-100)

实验动物选择：

6～8周昆明种小白鼠60只，体重15～18g，雌雄各半，购于北京海淀区兴隆实验动物养殖厂。

实验动物分组与造模：

将小鼠称体重后按照每组10只小鼠进行分组(雌雄各半)，一共分为6组，置于动物房中隔离饲养，为了防止实验小鼠之间的交叉感染，所以将造模后的小鼠与空白组小鼠分开饲养，造模后的小鼠随机分为5组，即黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组、利巴韦林组(西药阳性对照组)以及病毒模型组。空白对照组与其它组饲养于不同的动物房，但保证两个动物房的外界条件一样。以H9N2亚型禽流感病毒稀释液0.1ml滴鼻，空白对照组按同样方法以生理盐水0.1ml滴鼻。

给药方法：

病毒模型组、空白组：生理盐水0.4ml/只·d灌胃，分两次进行灌胃；治疗组分别配置：黄芩苷低剂量组按80mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0.4ml/ 只·d分两次灌胃；黄芩苷中剂量组按160mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成 0.4ml/只·d分两次灌胃；黄芩苷高剂量组按320mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0.4ml/只·d分两次灌胃；利巴韦林组：利巴韦林阳性组按10mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0.4ml/只·d分两次灌胃。攻毒后24小时开始给药，给药3天后取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，剩余的小鼠继续给药，给药后第6天取小鼠脾脏制成脾细胞悬液。

小鼠脾细胞悬液的制作过程：

(1)脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡3分钟小鼠表面，剖腹取小鼠脾脏，浸泡于PBS(磷酸盐缓冲溶液)中；

(2)在有PBS的平皿上放置一个200目筛网，将脾脏用手术剪刀剪碎放在筛网上，用注射器塞轻轻按压研磨；

(3)充分研磨后，将滤过的细胞悬液转移至15ml离心管中，300g离心5 分钟，弃上清；

(4)加入红细胞裂解液5ml混匀，裂解5分钟后，300g离心5分钟，弃上清；

(5)加入PBS 5ml混匀，300g离心5分钟，弃上清；

(6)加入PBS 5ml混匀，计数细胞。

样本染色处理：

(1)取100μl调节好浓度的脾细胞悬液加入流式管中；

(2)加入适量CD4、CD8、CD3、CD49b荧光标记抗体，充分混合均匀，室温避光反应20分钟；

(3)同时做好空白对照管，以及单色的荧光补偿管，用以调节仪器电压、补偿等；

(4)每管中加入2ml PBS重悬细胞后，350g离心5分钟，离心后弃上清；

(5)每管中加入0.5ml PBS重悬细胞后，室温避光放置待上机获取数据。

实验数据处理：

在流式细胞仪上圈门淋巴细胞，获取20000个细胞。最终CD4⁺/CD8⁺比值以均数±标准差(x±S)表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用完全随机设计多样本比较的秩和检验，数据使用SPSS17.0统计软件进行处理。

表1为黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠脾脏T细胞亚群的影响实验结果。

表1 黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠脾脏T细胞亚群的影响(x±s,n＝6)

与对照组比较：#P＜0.05##P＜0.01；与病毒组比较：*P＜0.05**P＜0.01。

感染H9N2亚型禽流感病毒后小鼠的脾脏逐渐萎缩，体内CD4⁺T细胞数量下降，CD4⁺/CD8⁺均比对照组降低。从表1的数据可以表明，感染病毒后第3天，病毒组小鼠脾脏CD4⁺/CD8⁺均比空白对照组降低(P＜0.05)，感染后第6天差异更显著(P＜0.01)，黄芩苷能够抑制病毒感染导致的小鼠脾脏萎缩及CD4⁺T 细胞数下降。感染病毒后第3天，黄芩苷能够提升小鼠CD4⁺/CD8⁺(P＜0.05)，给药3天后只有黄芩苷高剂量组能够显著提升小鼠的CD4⁺/CD8⁺的比值(P＜ 0.01)；然而在给药后第6天，黄芩苷各个剂量组均能够极显著提升小鼠的 CD4⁺/CD8⁺(P＜0.01)。正常小鼠第6天的脾脏CD4⁺/CD8⁺明显大于第3天，表明在生长期小鼠免疫细胞快速增长。而黄芩苷对正常小鼠的免疫细胞没有明显影响。本实施例的实验结果与本课题组申请的专利CN 105250322A中公开的选用上海同田生物技术有限公司(批号：E-00200)的黄芩苷的实验结果一致，说明本发明的实验方法制备黄芩苷与市售的上海同田生物技术有限公司(批号：E-00200) 具有生物等效性。

以上所述，仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明；但对于本领域的普通技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、取黄芩药材，研磨，过10~30目筛，得到黄芩粗粉；

(2)、将黄芩粗粉浸泡于非质子性溶剂中，采用闪式提取法提取2~3次，得到提取液；

(3)、将步骤（2）得到的提取液进行过滤，收集滤过液；

(4)、将步骤（3）得到的滤过液进行减压浓缩，浓缩至油状物；

(5)、向步骤（4）的油状物中加入4~8倍重量的水中，加热至50~70℃搅拌混均，得到混均液；

(6)、将混均液加入到大孔吸附树脂柱中进行吸附，然后用2~5BV的水洗脱，再用2~6BV的10~30%的乙醇水溶液洗脱，最后用35~50%的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液；

(7)、向洗脱液中加入一定量的酸调节pH至1~3，然后自然冷却至室温，静止析晶6~10h，抽滤、滤饼用水洗涤至pH 至6~7，干燥得到高纯度黄芩苷。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，所述的非质子性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述黄芩粗粉和非质子性溶剂的质量比为1:(4~7)。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述大孔吸附树脂型号选自HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-500、D-101中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，步骤（7）所述酸为无机酸，所述无机酸选自硫酸、乙酸、盐酸中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度黄芩苷的制备方法，其特征在于，步骤（7）所述干燥的温度为50~80℃，干燥时间为4~6h。

7.一种如权利要求1-6任一权利要求所述的制备方法制备的高纯度黄芩苷在抗H9N2亚型禽流感病毒中的应用。