CN110339204A - 一种含有叶酸的组合物及其在制备脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种叶酸组合物，具体公开了一种含有叶酸的组合物，包括：叶酸类化合物、维生素B₁₂和维生素B₆。本发明将叶酸类化合物、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，可以充分发挥各原料间的协同增效作用，同时，叶酸类化合物、维生素B₁₂和维生素B₆的含量，使得各原料间实现最佳的协同增效作用，有效地预防及治疗脑卒中。

Description

一种含有叶酸的组合物及其在制备脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种叶酸组合物，具体涉及一种含有叶酸的组合物及其在制备脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑卒中是一组由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的急性脑血管疾病。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，常见于中年以上人群的急性发作，严重者可发生意识障碍和肢体瘫痪，是造成人类死亡和残疾的三大主要疾病之一，也是高血压患者的主要致死原因，存活者中有50％-70％患者遗留有严重残疾，给社会和家庭带来了沉重的负担。

脑卒中的发病原因有多种，其中高血压病是脑卒中最主要、最常见的病因。有资料表明，脑出血患者有93％有高血压病史，脑血栓形成患者也有86％有高血压病史。因此，高血压人群通过控制血压，对脑卒中的发生具有显著的预防效果。常用的降压药主要有：钙拮抗剂(CCB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)、利尿剂和β受体阻滞剂，或者由这些药物组成的固定剂量的复方制剂。然而，高剂量的降压药往往也是引起脑卒中的一个危险因素。一方面由于脑组织的血流量主要是靠血压来维持，若使用作用较强的降压药或服用降压药剂量过大，致使血压骤然大幅度下降，从而影响了大脑血液供应，脑部血流缓慢，促使脑血栓形成。睡前更应忌服大剂量降压药。人在入睡后机体大部分处于休息状态，新陈代谢减慢，血压也相对降低，若再服用大量降压药，势必会使血压更低，心、脑、肾等重要器官供血减少，血流缓慢，血粘度增加，瘀积在脑血管形成血栓，而发生脑卒中。另一方面，长期使用高剂量的降压药，会对多种器官产生不良影响，同样也增加了脑卒中的发生率。

中国专利申请CN100551442A公开了一种含有钙通道阻滞剂和B族维生素的药物组合物及其用途，该药物组合物将B族维生素(包括维生素B₆、维生素B₁₂、叶酸类物质的一种或几种)和钙拮抗剂进行联合应用，可以提高提高钙拮抗剂降血压的疗效，并在一定程度上可增强钙拮抗剂降压药的靶器官保护作用，从而减少脑卒中的发生率。

中国专利申请CN 101897706 A公开了一种预防和治疗高同型半胱氨酸血症或伴有同型半胱氨酸升高的疾病的药物组合物，包括：(1)药用剂量的叶酸；(2)药用剂量的B族维生素；及(3)药剂学上可接受的载体，其中，B族维生素选自维生素B₆、维生素B₁₂、维生素B₁、维生素B₂、维生素PP、生物素和泛酸中的一种或几种。

但现有技术中均未公开将叶酸类化合物、维生素B₁₂和维生素B₆进行组合可以预防脑卒中发生。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种含有叶酸的组合物。本发明的叶酸组合物对于预防及治疗脑卒中效果显著。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.4-1.2份；

维生素B₁₂ 0.2-1.0份；

维生素B₆ 6-14份。

进一步地，所述含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-12份。

更进一步地，所述含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-9份。

进一步地，所述叶酸类化合物为叶酸、甲酰四氢叶酸、(6S)-5-甲基四氢叶酸、L-甲基叶酸、叶酸可药用盐、叶酸或叶酸可药用盐的活性代谢产物和可在体内代谢和/或生成叶酸的物质中的一种或多种。

进一步地，所述维生素B₁₂为钴胺素、甲钴胺、5’-脱氧腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

进一步地，所述维生素B₆为吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

进一步地，所述组合物还包括药用剂量的防止血栓形成的药物、药用剂量的降血脂药物和药用剂量的控血压的药物中的一种或多种。

更进一步地，所述防止血栓形成的药物为阿司匹林；

所述降血脂药物为他汀类药物，所述他汀类药物优选为阿托伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀中的一种或多种；

所述控血压的药物为氢氯噻嗪、赖诺普利、苯磺酸氨氯地平和缬沙坦中的一种或多种。本发明还提供了一种含有叶酸的组合物在制备预防和/或治疗脑卒中药物中的应用，所述含有叶酸的组合物包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.4-1.2份；

维生素B₁₂ 0.2-1.0份；

维生素B₆ 6-14份。

进一步地，一种含有叶酸的组合物在制备预防和/或治疗脑卒中药物中的应用，所述含有叶酸的组合物包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-12份。

更进一步地，一种含有叶酸的组合物在制备预防和/或治疗脑卒中药物中的应用，所述含有叶酸的组合物包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-9份。

进一步地，所述叶酸类化合物为叶酸、甲酰四氢叶酸、(6S)-5-甲基四氢叶酸、L-甲基叶酸、叶酸可药用盐、叶酸或叶酸可药用盐的活性代谢产物和可在体内代谢和/或生成叶酸的物质中的一种或多种。

进一步地，所述维生素B₁₂为钴胺素、甲钴胺、5’-脱氧腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

进一步地，所述维生素B₆为吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

进一步地，所述含有叶酸的组合物还包括药用剂量的防止血栓形成的药物、药用剂量的降血脂药物和药用剂量的控血压的药物中的一种或多种。

更进一步地，所述防止血栓形成的药物为阿司匹林；

所述降血脂药物为他汀类药物，所述他汀类药物优选为阿托伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀中的一种或多种；

所述控血压的药物为氢氯噻嗪、赖诺普利、苯磺酸氨氯地平和缬沙坦中的一种或多种。进一步地，所述应用为含有叶酸的组合物在制备预防和/或治疗由高血压引起的脑卒中药物中的应用。

进一步地，所述应用为含有叶酸的组合物在制备脑卒中二级预防干预药物中的应用。

进一步地，所述药物包括所述含有叶酸的组合物及药学上可接受的辅料。用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。

制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。常用填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；常用粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；常用崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；常用润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。

叶酸类化合物、维生素B₁₂、维生素B₆均为重要的B族维生素，具有各自不同的作用机理。将叶酸类化合物、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，可以充分发挥各原料间的协同增效作用，同时，叶酸类化合物、维生素B₁₂和B₆的含量，使得各原料间实现最佳的协同增效作用，可有效地预防及治疗脑卒中，尤其适用于脑卒中的二级预防干预。

具体实施方式

本发明提供了一种含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物0.4-1.2份；维生素B₁₂0.2-1.0份；维生素B₆6-14份；优选为包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物0.6-1份；维生素B₁₂0.3-0.7份；维生素B₆6-12份；更优选为包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物0.6-1份；维生素B₁₂0.3-0.7份；维生素B₆6-9份；或以下重量份数的组分：叶酸类化合物0.6-1份；维生素B₁₂0.3-0.7份；维生素B₆8-12份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.6-0.7份；维生素B₁₂0.3-0.4份；维生素B₆6-9份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.9-1.0份；维生素B₁₂0.6-0.7份；维生素B₆11-12份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.6-0.7份；维生素B₁₂0.6-0.7份；维生素B₆6-9份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.9-1.0份；维生素B₁₂0.3-0.4份；维生素B₆11-12份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.6-0.7份；维生素B₁₂0.3-0.4份；维生素B₆11-12份。

在本发明的一些实施例中，含有叶酸的组合物，包括以下重量份数的组分：叶酸类化合物的含量为0.9-1.0份；维生素B₁₂0.6-0.7份；维生素B₆6-9份。

实施例1-13

一种含有叶酸的组合物，包括如表1及表2中所示的组分：

表1

表2

对比例1-5

一种组合物，包括如表3中所示的组分：

表3

其中，对比例1-5、实施例8-9和实施例11中，叶酸类化合物为叶酸；维生素B₁₂为氰钴胺素；维生素B₆为盐酸吡哆醇。

实施例12中，叶酸类化合物为四氢叶酸；维生素B₁₂为甲钴胺素；维生素B₆为吡哆醛。

实施例13中，叶酸类化合物为(6S)-5-甲基四氢叶酸；维生素B₁₂为钴胺素；维生素B₆为吡哆胺。

实施例10中，叶酸类化合物为甲酰四氢叶酸；维生素B₁₂为羟钴胺素；维生素B₆为磷酸吡哆醇。

本发明所提供的组合物，具体使用时，可将上述组合物与药学领域中可接受的辅料混合制成药剂。可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。常用填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；常用粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；常用崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；常用润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。

为了表明本发明的优点，本发明提供实施例8-13，对比例1-5的效果试验结果，以证明本发明的有益效果。

试验例

1.组合物对脑卒中的二级预防效果

(1)组合物对胶原酶注射法大鼠脑出血模型的预防作用

脑出血是脑卒中复发的主要结局事件之一，考察本发明所提供的组合物对胶原酶注射法大鼠脑出血模型脑出血的预防作用及行为学的影响，可为其临床用于脑卒中患者二级预防提供前瞻性药理学依据。

1)动物分组及给药

动物选取SPF级SD大鼠，全体重(180±20)g。SD大鼠按体重分层后随机分为假手术组、模型对照组、对比例1-5组、实施例8-13组，每组8只。采用ig给药的方式预防性给药，对比例1-5组、实施例8-13组给药(即表2和表3所述的组合物)剂量为1.318mg/kg，用生理盐水稀释，给药体积10ml/kg，假手术组和模型组对照给予等体积的生理盐水。连续预防性给药30天。

2)造模方法

末次给药后1h，所有大鼠均采用9％水合氯醛3.2ml/kg麻醉后固定于脑立体定位仪上，暴露前囟。取前囟前0.5mm，右旁开3mm，牙科钻钻孔。微量注射器抽取0.6U VII型胶原酶，溶于1.5uL生理盐水，进针至硬膜下5.5mm，5min内缓慢注射至大鼠尾状核，注射完毕后留针8min缓慢退针，缝合头皮。全程无菌操作。假手术组除注射给予等体积的生理盐水外，其余操作均同造模组。

3)大鼠运动功能检测和肢体神经症状评分

在脑出血模型制作后的24h后对每只大鼠参考文献[夏鹰，陈街城，季耀东，等.脑出血的大鼠模型[J].中国临床神经科学，2003，11(1)：71-72]进行3种运动行为学检测：①有无自发性向血肿同侧转圈现象，从0级(无转圈)到3级(持续转圈)进行分级；②将大鼠的左侧后肢向外拉2～3cm，观察其收缩情况，从0级(立即收缩到原位)到3级(在数秒后收缩到原位或无收缩)进行分级；③大鼠通过2.4cm×80cm窄木条的能力，从0级(顺利通过)到3级(在木条上站立＜10s)进行分级；将3种检查的分级分数相加，即为大鼠的运动功能评分。

肢体神经症状评分采用Longa Fz评分和Bederson评分方法进行。

Longa Fz评分：0级：无体征，记0分；1级：大鼠不能完全伸直其前肢，记1分；2级：大鼠一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分；3级：大鼠不能站立或打滚，记3分；4级：无自发性活动，有意识障碍记4分。

Bederson评分：轻抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节，肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征+向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状)。所有检测由对大鼠分组不知情的同一个人完成。

4)TTC染色测量出血面积

行为学测试完成后，将动物采用10％水合氯醛过量麻醉后，经心脏先用0.9％的生理盐水20mL快速灌注，开颅取脑，切取药物注入部位后剩余脑立即置于-20℃冷冻15分钟，然后切1mm切片，然后置于10％的TTC溶液中染色20min，采用游标卡尺测量出血面：长×宽(mm²)。

5)实验结果

组合物对脑出血模型大鼠运动功能评分和肢体神经症状评分的影响如表4所示：

表4

注，同列标有不同字母(A、B、C、D、E、F)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表4可知，与假手术组比较，模型对照组大鼠运动功能评分、Longa Fz评分和Bederson评分均显著增高，具有极显著的统计学意义(P＜0.01)，提示脑出血模型大鼠存在明显的运动功能障碍和肢体神经功能障碍。与模型对照组比较，对比例1-5组、实施例8-13组的运动功能评分均显著降低，具有显著统计学意义(P＜0.01)，由对比例1-5组、实施例8-13组间的比较可知，实施例8-13组的效果显著优于与对比例1-3、5，且其中的实施例9、11-13效果显著优于对比例1-5，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合可以发生协同增效作用，效果显著优于仅由其中一种或两种原料组成的药物，也优于单独使用非洛地平的药物，而与对比例4相比，即使少了非洛地平，但效果并没有降低，且进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的一种，还可进一步提高效果。与模型对照组比较，实施例8-13组的Longa Fz评分均显著降低，具有显著统计学意义(P＜0.01)，而与对比例比较，实施例8-13组的效果显著优于对比例1-3，与对比例4-5无显著性差异，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合可以发生协同增效作用，效果显著于仅由其中一种或两种原料组成的药物，而与对比例4相比，即使少了非洛地平，但效果并没有降低。与模型对照组比较，比例1-3的Bederson评分无显著性差异，而对比例4-5、实施例8-13的评分显著低于模型对照组，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合可以发生协同增效作用，效果显著于仅由其中一种或两种原料组成的药物，而与对比例4相比，即使少了非洛地平，但效果并没有降低。

综上所述，由叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对脑出血模型大鼠运动功能评分和肢体神经评分的综合效果具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果并未降低，而进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，则可以进一步加强效果。

组合物对脑出血模型大鼠对TTC染色出血面积的影响如表5所示：

表5

注，同列标有不同字母(A、B、C、D、E、F)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表5可知，与假手术组比较，模型对照组大鼠脑出血面积显著增加，表明模型制备成功；与模型对照组比较，对比例1-5，与实施例8-13各组脑出血面积均有统计学差异；实施例8-10与对比例1-3、5具有显著性差异，与对比例4差异不显著；实施例11-13与实施例8-10具有显著性差异。表明，由叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对脑出血模型大鼠对TTC染色出血面积的影响具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果并未降低，而进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，则可以进一步加强效果。

(2)对自体血栓注射致多发性脑梗塞模型的预防作用

脑梗死是脑卒中复发的主要结局事件之一，考察本发明所提供的组合物对自体血栓注射致多发性脑梗塞模型大鼠的预防作用、血清高同型半胱氨酸和血脂水平的影响，为其临床用于脑卒中患者二级预防提供前瞻性药理学依据。

1)动物分组及给药

动物选取SPF级SD大鼠，全体重(200±20)g，SD大鼠适应性喂养3d后，根据体重随机分为假手术组、模型对照组、对比例1-5组、实施例8-13组，每组8只。除假手术组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水外，其余各给药组灌胃给予相应浓度的药物(即表2和表3所述的组合物)，剂量为1.318mg/kg，给药体积10ml/kg。每天给药1次，预防给药1个月后造模。造模后继续给药2周。

2)血栓的制备

采用股动脉取血法收集健康SD大鼠血液于干净培养皿中，放入37℃烘箱中凝固24小时，将血块取出，切割研磨成微粒。造模用血栓颗粒直径为通过药典5号筛但不通过6号筛，即颗粒直径为150μm-180μm，4℃冰箱保存备用。临用前称取20mg预先制备的血栓按照血栓20mg∶6ml生理盐水溶于生理盐水中，涡旋仪混悬均匀，即得血栓混悬液。

3)模型制备

SD大鼠称重后用9％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，注射体积为3.2ml/kg，大鼠麻醉后，固定大鼠，剪去颈部鼠毛，铺上两层消毒酒精浸泡的纱布，在纱布上剪一个缺口，暴露手术部位，手术部位用碘伏消毒。用手术刀片切开颈部中线，钝性分离暴露左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、左侧颈内动脉(internal cerebral artery，ICA)和左侧颈外动脉(external carotid artery，ECA)。分离出ECA5-6mm，用0号手术线结扎ECA远端，并在近端打一活结，推向ECA根部；用0号手术线活结暂时结扎CCA。用26号留置针在ECA逆行刺入，略抽出针芯，用外套管继续插入致颈总动脉“Y”型分岔处，栓紧ECA根部的活结，防止套管滑出和出血，手术动物注入0.4ml含血栓的生理盐水混悬液，缓慢注入血栓混悬液同时松开CCA，让动脉血液将血栓冲入颈内动脉，注射完毕后结扎ECA近心端。缝合伤口，常规消毒。手术动物肌注0.5ml硫酸庆大霉素，术后注射硫酸庆大霉素连续3d，每次1ml/kg预防感染。假手术组大鼠只将血栓溶液换为生理盐水，其余步骤与模型动物相同。整个手术过程中，大鼠肛温应保持在36.5～37.5℃，防止低温造成动物死亡。

4)指标检测

血清高同型半胱氨酸、TC、TG、HDL、LDL含量检测

末次给药后24h，尾静脉取血，离心分离血清，采用循环酶法检测高同型半胱氨酸含量，采用试剂盒检测TC、TG、HDL、LDL的含量水平。

5)实验结果

组合物对MID模型大鼠血清血脂及同型半胱氨酸的影响结果如表6所示：

表6

注，同列标有相同字母(a)表示不同组间不存在显著差异，P＞0.05；同列标有不同字母(A、B、C)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表6可知，各组间血脂四项没有显著的差异(P＞0.05)；与模型对照组比较，实施例8-13组的同型半胱氨酸含量均显著降低，有显著的统计学意义(P＜0.01)，而对比例1-5的同型半胱氨酸含量降低不显著；实施例11-13与实施例8-10具有极显著性差异。上述结果提示叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆之间具有协同作用，且阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平的添加有利于效果的提高。

(3)对动脉粥样硬化所致脑血管损伤预防作用

高血脂/动脉粥样硬化是脑卒中发生和复发关键病理过程，认知功能减退是脑卒中复发的次要结局事件的关键点之一。对高脂饮食复合L-蛋氨酸所致高脂血症/动脉粥样硬化模型的预防作用、血清血脂水平、同型半胱氨酸和血管功能指标影响，为其临床用于脑卒中患者二级预防提供前瞻性药理学依据。

1)动物及动物模型制备

动物选取SPF级SD大鼠，全体重(200±20)g。采用高脂饲料(高脂饲料配方：胆固醇1％，猪油10％，蛋黄粉5％，牛磺胆酸钠1％，丙基硫氧嘧啶0.2％，基础饲料82.8％)喂养复合L-蛋氨酸制备高脂血症/动脉粥样硬化模型。造模大鼠每天给予高脂饲料喂养7周后，在高脂饲料喂养的基础上早晚ig给予3％L-蛋氨酸10ml/kg，连续3周造模。

2)分组及给药

SD大鼠按体重分层后随机分为空白对照组、模型对照组、对比例1-5组、实施例8-13组，每组8只。采用预防给药的方式，造模同时开始ig给予各组大鼠相应的药物(即表2和表3所述的组合物)，剂量为1.318mg/kg，空白对照组和模型对照组ig等体积的生理盐水，每天1次，10ml/kg，连续给药10周。

3)指标检测

大鼠血清TC的动态检测

第5周、第7周、第10周，大鼠尾静脉取血，分离血清，采用TC检测试剂盒检测血清TC含量，监测动物造模情况。

学习记忆功能测定(Morris水迷宫法)

定向航行测试：给药第10周开始水迷宫训练，持续6d。将大鼠面朝桶壁缓慢从相对象限放入，记录其从入水到找到平台的时间，为逃避潜伏期。如果大鼠1min中内未找到平台，须人为引导其至平台，停留5s-15s，逃避潜伏期记录为60s。第6天进行定向航行测试，记录其逃避潜伏期。

空间探索测试：定向航行测试24h后撤去平台，大鼠放入除目标象限的相对象限，进行空间探索测定。记录其穿越目标象限次数、目标象限累计时间及探索总距离。

血清高同型半胱氨酸、血脂全套含量检测(血脂四项+载脂蛋白三项)

Morris水迷宫检测完成后，连续三天分组平行安排，尾静脉取血，分离血清，采用循环酶法检测高同型半胱氨酸含量，血脂全套检测(血脂四项+载脂蛋白)。

血管功能指标检测

腹主动脉取血，分离血清，生化法血清NO浓度，ELISA法测血清ET、TXB2和6-keto-PGF1a及纤维溶解功能t-PA和PAI的含量。

4)实验结果

组合物对高脂/动脉粥样硬化模型大鼠血清动态TC含量的影响如表7所示：

表7

注，同列标有不同字母(A、B、C、D)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表7可知，与空白对照组比较，模型对照组大鼠第5周、第7周和第10周血清TC含量均极其显著增高，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示高脂模型成功。

预防给药10周后，与模型对照组比较，实施例8-13的TC含量均显著降低，有显著的统计学意义(P＜0.01)，且实施例11-13显著比实施例8-10效果好(P＜0.01)。对比例1-3、5与模型对照组间无显著性差异，虽然对比例4与模型对照组间存在极显著性差异，但与实施例8-10间无显著性差异。提示由叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对高脂/动脉粥样硬化模型大鼠血清动态TC含量的影响具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果并未降低，而进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，则可以进一步加强效果。

组合物对模型大鼠学习记忆功能的影响如表8(对模型大鼠定向航行逃避潜伏期的影响)和表9(对模型大鼠空间探索功能的影响)所示：

表8

注，同列标有相同字母(a)表示不同组间不存在显著差异，P＞0.05；同列标有不同字母(a、b、c)表示不同组间存在显著差异，P＜0.05；同列标有不同字母(A、B、C)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

与假手术组比较，模型对照组的逃避潜伏期明显延长，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示该模型存在定向航行功能的障碍；而实施例8-10、12的逃避潜伏期显著短于对比例1-3和对比例5，与对比例4无显著差异，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对模型大鼠定向航行逃避潜伏期的影响具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果并未降低，而实施例11、13表明进一步增加阿司匹林或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，则可以进一步加强效果。

表9

注，同列标有不同字母(A、B、C、D)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表9可知，模型对照组空间探索总距离较假手术组显著延长，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示该模型大鼠存在空间探索功能的障碍；由实施例8-13与对比例1-5的比较可知，叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对增加模型大鼠穿越目标象限次数、延长目标象限累计时间及缩短探索总距离具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物及在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物的效果，进一步阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，还可以进一步加强效果。

组合物对模型大鼠血脂水平和Hcy的影响如表10所示：

表10

注，同列标有相同字母(a)表示不同组间不存在显著差异，P＞0.05；同列标有不同字母(A、B、C、D)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表10可知，与空白对照组比较，除Apo-A1外，模型组血清血脂六项均显著增高，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示高脂血症模型成功，结果显示，叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对模型大鼠血脂水平的影响具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物及在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物的效果，而进一步增加阿司匹林或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，可以进一步加强效果；而对血清Hcy而言，模型组反而较空白对照组显著降低，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示高脂饲料反而影响了血清Hcy的堆积，提示高脂复合L-蛋氨酸制备高脂高同型半胱氨酸复合模型不可行。但对比例8-13组比对比例1-5组Hcy含量显著降低，有显著的统计学意义(P＜0.01)，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组的联合应用，呈现出一定的协同增效趋势。

组合物对模型大鼠血清血管功能指标含量的影响如表11所示：

表11

注，同列标有不同字母(A、B、C、D、E)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表11可知，与空白对照组比较，模型组大鼠血清ET-1、NO、TXB2、6-keto-PGF1α、PAI含量均显著升高，tPA含量明显降低，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示该模型存在血管功能的异常；结果显示，叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对模型大鼠血清血管功能指标含量具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果较好或并未变差，而进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，则可以进一步加强效果。

(4)组合物对多发性腔梗认知功能低下模型的学习记忆影响

认知功能减退是脑卒中复发的次要结局事件的关键点之一。考察本发明所提供的组合物对自体血栓注射所致多发性脑梗塞痴呆(MID)模型学习记忆功能的影响，为其临床用于脑卒中患者二级预防提供前瞻性药理学依据。

1)动物分组及给药

选取SPF级SD大鼠，全体重(200±20)g。SD大鼠适应性喂养3d后，根据体重随机分为假手术组、模型对照组、对比例1-5组、实施例8-13组，每组8只。除假手术组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水外，其余各给药组灌胃给予相应浓度的药物(即表2和表3所述的组合物)，剂量为1.318mg/kg，给药体积10ml/kg。每天给药1次，预防给药1个月后造模。造模后继续给药2周。

2)血栓制备

采用股动脉取血法收集健康SD大鼠血液于干净培养皿中，放入37℃烘箱中凝固24小时，将血块取出，切割研磨成微粒。造模用血栓颗粒直径为通过药典5号筛但不通过6号筛，即颗粒直径为150μm-180μm，4℃冰箱保存备用。临用前称取20mg预先制备的血栓按照血栓20mg∶6ml生理盐水溶于生理盐水中，涡旋仪混悬均匀，即得血栓混悬液。

3)模型制作

SD大鼠称重后用9％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，注射体积为3.2ml/kg，大鼠麻醉后，固定大鼠，剪去颈部鼠毛，铺上两层消毒酒精浸泡的纱布，在纱布上剪一个缺口，暴露手术部位，手术部位用碘伏消毒。用手术刀片切开颈部中线，钝性分离暴露左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、左侧颈内动脉(internal cerebral artery，ICA)和左侧颈外动脉(external carotid artery，ECA)。分离出ECA5-6mm，用0号手术线结扎ECA远端，并在近端打一活结，推向ECA根部；用0号手术线活结暂时结扎CCA。用26号留置针在ECA逆行刺入，略抽出针芯，用外套管继续插入致颈总动脉“Y”型分岔处，栓紧ECA根部的活结，防止套管滑出和出血，手术动物注入0.4ml含血栓的生理盐水混悬液，缓慢注入血栓混悬液同时松开CCA，让动脉血液将血栓冲入颈内动脉，注射完毕后结扎ECA近心端。缝合伤口，常规消毒。手术动物肌注0.5ml硫酸庆大霉素，术后注射硫酸庆大霉素连续3d，每次1ml/kg预防感染。假手术组大鼠只将血栓溶液换为生理盐水，其余步骤与模型动物相同。整个手术过程中，大鼠肛温应保持在36.5～37.5℃，防止低温造成动物死亡。

4)学习记忆功能检测(Morris水迷宫法)

定向航行测试：造模给药第14天开始水迷宫训练，持续5d。将大鼠背朝桶壁缓慢从四个不同象限中心放入，记录其从入水到找到平台的时间，为逃避潜伏期。如果大鼠60s内未找到平台，须人为引导其至平台，停留5s-15s，逃避潜伏期记录为60s。第5d进行定向航行测试，方法同上，记录其逃避潜伏期。

空间探索测定：定向航行测试24h后撤去平台，大鼠放入除目标象限外两个随机不同的象限，进行空间探索测定。记录其60s内进入平台象限的时间、进入平台象限的次数及总路程。

5)实验结果

组合物对MID模型大鼠学习记忆能力的影响如表12(对MID模型大鼠定航航行逃避潜伏期的影响)和表13(对MID模型大鼠空间探索的影响)所示。

表12

注，同列标有相同字母(a)表示不同组间不存在显著差异，P＞0.05；同列标有不同字母(A、B)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

与假手术组比较，模型对照组的逃避潜伏期明显延长，有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示该模型存在定向航行功能的障碍；而实施例8-10的逃避潜伏期显著短于对比例1-3和对比例5，与对比例4无显著差异，表明叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对模型大鼠定向航行逃避潜伏期的影响具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物的效果，且与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果并未降低。实施例11-13的效果与实施例8-10相当。

表13

注，同列标有不同字母(A、B、C、D)表示不同组间存在极显著差异，P＜0.01.

由表13可知，模型对照组的穿越目标象限次数、穿越平台次数、穿越目标象限时间、穿越平台区域次数与假手术组有显著的统计学意义(P＜0.01)，提示该模型大鼠存在空间探索功能的障碍；由实施例8-13与对比例1-5的比较可知，叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆进行组合，对改善模型大鼠空间探索能力具有显著的作用，优于仅由其中一种或两种原料组成的药物的效果，也优于仅由非洛地平组成的药物，与在叶酸、维生素B₁₂、维生素B₆组合物的基础上进一步添加非洛地平的药物相比，效果没有下降，进一步增加阿司匹林、阿托伐他汀或苯磺酸氨氯地平中的任意一种，还可以进一步加强效果。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种含有叶酸的组合物，其特征在于，包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-9份。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药用剂量的防止血栓形成的药物、药用剂量的降血脂药物和药用剂量的控血压的药物中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述防止血栓形成的药物为阿司匹林；

所述降血脂药物为他汀类药物，所述他汀类药物优选为阿托伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀中的一种或多种；

所述控血压的药物为氢氯噻嗪、赖诺普利、苯磺酸氨氯地平和缬沙坦中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述叶酸类化合物为叶酸、甲酰四氢叶酸、(6S)-5-甲基四氢叶酸、L-甲基叶酸、叶酸可药用盐、叶酸或叶酸可药用盐的活性代谢产物和可在体内代谢和/或生成叶酸的物质中的一种或多种；

所述维生素B₁₂为钴胺素、甲钴胺、5’-脱氧腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种；

所述维生素B₆为吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

5.一种含有叶酸的组合物在制备预防和/或治疗脑卒中药物中的应用，其特征在于，所述含有叶酸的组合物包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.4-1.2份；

维生素B₁₂ 0.2-1.0份；

维生素B₆ 6-14份；

优选包括以下重量份数的组分：

叶酸类化合物 0.6-1份；

维生素B₁₂ 0.3-0.7份；

维生素B₆ 6-12份。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含有叶酸的组合物还包括药用剂量的防止血栓形成的药物、药用剂量的降血脂药物和药用剂量的控血压的药物中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述防止血栓形成的药物为阿司匹林；

所述降血脂药物为他汀类药物，所述他汀类药物优选为阿托伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀中的一种或多种；

所述控血压的药物为氢氯噻嗪、赖诺普利、苯磺酸氨氯地平和缬沙坦中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述叶酸类化合物为叶酸、甲酰四氢叶酸、(6S)-5-甲基四氢叶酸、L-甲基叶酸、叶酸可药用盐、叶酸或叶酸可药用盐的活性代谢产物和可在体内代谢和/或生成叶酸的物质中的一种或多种；

所述维生素B₁₂为钴胺素、甲钴胺、5’-脱氧腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种；

所述维生素B₆为吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质中的一种或多种。

9.如权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为含有叶酸的组合物在制备脑卒中二级预防干预药物中的应用。

10.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述含有叶酸的组合物及药学上可接受的辅料。