CN110330559A - 一种p120ctn蛋白突变体及其应用 - Google Patents

一种p120ctn蛋白突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种p120ctn蛋白突变体及其应用，蛋白p120ctn‑1序列如SEQ ID NO.2所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。比天然p120ctn的生物活性和强的生物稳定性，且在原核体系中表达水平高，可以在室温条件下长时间保持结构和功能的稳定，便于保存、运输，对肝癌的治疗具有生物活性和治疗效果，在生物药业和生物制剂方面具有非常广泛的应用前景。

Description

一种p120ctn蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本发明涉及一种p120ctn蛋白突变体及其应用。
技术背景
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，具有侵袭性强、死亡率高的特点，位列癌症相关死亡原因的第二位(Esther,Cidon.Systemictreatment of hepatocellular carcinoma:Past,present and future[J].WorldJournal of Hepatology,2017,9(18):797-80)。目前认为乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、酒精性及非酒精性肝硬化、黄曲霉毒素、肥胖等均与肝癌的发生相关。肝癌的发病机制尚未完全明确，研究认为与基因突变、肝癌干细胞、微环境、非编码RNA、代谢异常等有关(Farazi PA,Depinho RA.Hepatocellular carcinoma pathogenesis:fromgenes to environment[J].Nature Reviews Cancer,2006,9(9):674-687)。由于我国肝癌多发生于欠发达地区，使得很多患者被诊断时多已处于进展期或晚期，错过了最佳的手术时机。肝移植被认为是治疗肝癌和潜在肝疾病最有效的方法，但由于其手术费用昂贵，而且有严格的适应症，肝源相对短缺，虽然近年来肝移植技术已非常成熟，但肝癌的总体死亡率仍未有很大的改善。靶向口服化疗药物索拉菲尼被认为是晚期肝癌患者的唯一选择，但其价格昂贵，不是所有患者都能承受，而且远期疗效有限，所以中晚期肝癌患者的预后依然很差。过去的几十年中，随着科学技术的进步，肿瘤的免疫治疗、基因治疗等取得了巨大的进展，因此，深入研究肝癌细胞的基因谱及寻找新的治疗靶点至关重要。
肝癌的发病是一个涉及多种调控和分子通路的复杂过程，目前尚不十分清楚。连环蛋白是一组具有相似结构的细胞内糖蛋白家族，可分为α-、β-、γ-和p120ctn连环蛋白4种，它们都能与上皮钙黏蛋白(E-cadherin)胞内肽段结合。这些黏附分子与肿瘤有着密切关系，p120连环蛋白(p120ctn)是Armadillo结构蛋白家族成员之一。它位于细胞间连接处和细胞核内，与钙粘蛋白高度保守的近膜区(JMD)相互作用，从而参与钙粘蛋白介导的信号转导和粘附过程。在多种恶性肿瘤中均发现p120ctn有异常表达，提示其在恶性肿瘤的浸润和转移中可能具有一定作用。研究报道，p120ctn在表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)刺激后发生酪氨酸磷酸化，细胞黏附能力下降，迁移能力增加，细胞形态发生恶性改变等细胞恶性行为。但天然p120ctn外源表达水平不高，在室温条件下不能长时间保持结构和功能的稳定，不便于保存、运输，是生物药业和生物制剂产业亟待解决的问题。
1981年，Trams等在透射电镜下发现了一组比多泡体还要小的、直径在40-1000nm的囊泡样物质。1987年，Johnstone等命名这种膜泡为外泌体(exosomes)，其产生的主要过程，可概括为：(1)细胞质膜凹陷形成细胞内小泡；(2)细胞内小泡进一步发展形成多泡小体；(3)多泡小体与细胞质膜融合释放外泌体，受体细胞对外泌体的接收可以通过配体-受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来实现。从其产生过程可以看出，外泌体是细胞膜成分的囊泡，内里可以携带诸如DNA、RNA、microRNA以及蛋白质等具有生物活性和治疗效果的分子。外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；外泌体还可以通过内吞或胞饮作用被靶细胞内在化；外泌体还可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。外泌体介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的转移途径。
外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40-100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。但对于携带大分子物质如蛋白质的研究少之又少。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的p120ctn蛋白，表达量较天然的提高70％，且在常温条件下稳定性较好。
本发明的目的之二在于提供一种能够分泌新的p120ctn蛋白的重组菌。
本发明的目的之三在于本发明所提供的新的p120ctn蛋白在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种包载蛋白的外泌体的制备方法，特别是一种用于治疗肝癌的外泌体及其制备方法和应用。
本发明的目的通过以下技术方案具体实现：
本发明是通过核苷酸定点突变将p120ctn第47位的丝氨酸编码序列TCA突变为天冬氨酸编码序列GAC，利用原核表达载体通过基因工程技术获得的突变体蛋白，命名为p120ctn-1，其序列如SEQ ID NO.2所示。这种突变体具有天然p120ctn的生物活性和强的生物稳定性，且在原核体系中表达水平高，可以在室温条件下长时间保持结构和功能的稳定，便于保存、运输，在生物药业和生物制剂方面具有非常广泛的应用前景。
本发明还提供一种编码突变体p120ctn-1的基因。在一种实施例中，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种表达突变体p120ctn-1的菌株。在一种实施例中，本发明还提供了一株高表达p120ctn-1蛋白的重组菌，分类命名为大肠杆菌BRIX1-1，于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号CCTCCNO:M 2019044。
本发明还提供所述p120ctn-1蛋白在制备治疗癌症药物中的应用，特别是在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明还提供一种包载p120ctn-1蛋白的外泌体。
本发明还提供所述包载p120ctn-1蛋白的外泌体在制备治疗癌症药物中的应用，特别是在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的有益效果：
针对我国肝癌诊疗的现状，开发具有自主知识产权新型生物靶向制剂，本研究结合现代分子生物学和生物信息学等知识和手段，对p120ctn进行更深入的分子改良，筛选性能优良的突变体，低成本地制备高表达的重组蛋白p120ctn-1，结合外泌体作为药物载体，外泌体中的有效分子到达肝癌细胞后，可以与之相互作用，释放具有生物活性和治疗效果的分子，促进损伤组织结构和功能的恢复，具有非常重要的理论价值和现实意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中重组质粒TF-p120ctn-1-pCold构建图谱；
图2为本发明实施例2中通过定点突变的p120ctn-1突变体基因PCR扩增；
图3为本发明实施例3中原核表达p120ctn-1突变体蛋白SDS-PAGE电泳鉴定结果图；
图4为本发明实施例5中外泌体重组p120ctn-1与野生型p120蛋白对肝癌细胞增殖的抑制作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。细胞复苏、培养、传代、冻存等细胞学常见操作步骤参考《动物细胞培养(第六版)》。
实施例1p120ctn突变位点确定
通过现有技术的突变方法将p120ctn蛋白(序列如SEQ ID NO.4所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)第47位氨基酸丝氨酸突变为天冬氨酸，得到突变体p120ctn-1，其序列如SEQ ID NO.2所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过检测对比，稳定性和表达量相对于野生型有所提高。
实施例2：TF-p120ctn-1-pCold-BL21原核体系构建
根据已报道的人p120ctn基因序列和p120ctn-1突变体突变位点核苷酸，设计特异性引物，并在连接引物的两端引入约15bp的同源臂，其中在设计反向引物中将原终止密码子TAG改为大肠杆菌偏性的TAA。核酸定点突变原则设计一对重叠PCR引物使p120ctn第47位的丝氨酸突变为天冬氨酸。
引物P1:5’-CGAAGGTAGGATGGACGACTCAGAG-3’；
引物P2:5’-AGATTACCTATTAAATCTTCTGCATCAA-3’，
其中加粗为同源臂序列。
定点突变overlap PCR引物：
P3:5’-CGTCCGGGTCGACCCACAAGATGCC-3’；
P4:5’-CATCTTGTGGGTCGACCCGGACGCG-3’。
成功从人293cDNA文库中调出p120ctn片段，利用人293cDNA文库为模板，引物P1和P2通过PCR扩增得到p120ctn片段；以引物P1与P4、P2与P3、P1与P2通过overlap PCR方法扩增得到突变体p120ctn-1片段(图2：M：DNA marker；1：p120ctn原始片段；2：p120ctn-1突变片段)，其大小符合理论值。将纯化后的PCR产物与线性化pCold载体同源重组，构建重组质粒TF-p120ctn-1-pCold(图1)，将重组质粒TF-p120ctn-1-pCold转入大肠杆菌。
实施例3：重组p120ctn-1蛋白的表达和纯化
将测序正确的阳性克隆菌落接种氨苄霉素的LB培养基中，16℃，200rpm培养，当菌液OD600达0.8时，加入1:1000IPTG诱导4h，离心收集菌体，按1:10将菌体溶于1×PBS缓冲液中，常规超声破碎，离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和表达形式。4℃条件下将目的蛋白粗提液过Ni离子交换柱，并用咪唑进行梯度洗脱，SDS-PAGE电泳分析。
如图3所示(M：Protein marker；1：诱导前TF-p120ctn-1-pCold-BL21全菌；2：诱导后TF-p120ctn-1-pCold-BL21全菌；3：诱导后TF-p120ctn-1-pCold-BL21沉淀；4：诱导后TF-p120ctn-1-pCold-BL21上清)，SDS-PAGE电泳检测发现，目的蛋白能在原核体系中表达，且以可溶表达形式存在，表达量较原先研究数据提高了约70％。将表达的目的蛋白过Ni纯化，经SDS-PAGE分析，目的蛋白在500mmol/L咪唑中被大量洗脱，纯度大于90％。将纯化的重组p120ctn-1用储存液稀释至100mg/L后等量分装，置于4℃保存，于1、3、5、7、10、15、20、30天各取出一份，通过SDS-PAGE分析粗略判断突变型p120ctn蛋白的稳定性未发现明显降解，说明其稳定性高(表1)。
表1突变型和野生型p120ctn蛋白的稳定性
实施例4：一种包载p120ctn-1外泌体的制备
(1)细胞的培养：A.CHO细胞的培养：CHO细胞和HEK293细胞培养至对数生长期(购自Lonza公司)，最终浓度为4×105-6×105个/mL，在36-38℃，3-7％CO2，转速160-200rpm下于Tube spin管振荡悬浮培养60-84h，扩增到1L培养摇瓶中，细胞活率可以维持在90％左右；(2)瞬时表达：细胞培养至对数生长期，取一灭菌的1.5mL EP管，按照需要的重组p120ctn-1及转染试剂Linear 25kDa PEI(聚乙烯亚胺)(Polysciences公司)，将两者按照一定比例(p120ctn-1：PEI＝1:2-1:3)分别加入EP管中充分混合，静置5-10min；将p120ctn-1/PEI混合液加入浓度2×106-4×106个/mL细胞悬液中，使细胞和p120ctn-1/PEI复合物充分均匀；37℃，6％CO2，180rpm振荡悬浮培养，每天检测活细胞密度和细胞活率，第三天开始隔天收样检测，当细胞活率低于30％收样。纯化蛋白并检测其浓度。(3)外泌体抽提：无外泌体血清制备：胎牛血清于120000g，4℃离心2h，提取上清(外泌体为沉淀)，并用0.22μm的滤器过滤除菌，配制为终浓度为10％培养基备用。外泌体条件培养基收集：干细胞培养，生长到80％时，去除培养基，并用PBS清洗两次，清洗后采用去除外泌体的条件培养基进行培养，培养24h收集培养基进行外泌体的提取。外泌体提取(梯度离心法)：条件培养基上清一次离心4℃，300g离心10min；4℃，12000g离心20min；去除细胞碎片和凋亡小体；用0.22μm的滤器过滤上清，去除直径大于200nm的微囊泡；过滤后的上清置于超速离心管中，4℃，100000g离心70min；得到外泌体沉淀，并用PBS重悬，待用。
实施例5：携带重组p120ctn-1外泌体的应用
选择重组表达的p120ctn-1，我们通过观察肝癌细胞抑制实验检测了包含该重组蛋白的外泌体具有同样的药效功能，这样可以确认携带重组蛋白的外泌体可以作为一个载药系统将药物蛋白传递给靶细胞。
用无血清的DMEM于96孔细胞培养板培养肝癌细胞，密度1.2×105个/mL，50μL/孔。37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下培养2h使细胞贴壁。加入用含有20％胎牛血清的DMEM培养基(10％FBS)稀释的含有p120ctn野生的重组蛋白(5μg/mL)和含有实施例4制备的p120ctn-1突变体的外泌体(10％(v/v))，按递次10倍稀释的浓度分别加入细胞培养液中，50μL/孔。继续培养168h，使细胞丰度达到80％以上。加入MTT溶液(购自Sigma)，20μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下培养4h。小心移走上清，加入DMSO(购自Sigma)，100μL/孔，37℃避光孵育15min至结晶完全溶解。220nm为激发波长，在371nm发射波长处测定肝癌细胞OD值。
结果如图4所示，包含有重组p120ctn-1的外泌体具有与野生型相同效果的抑制肿瘤细胞，说明被包裹进外泌体的蛋白是具有活性的，这说明了外泌体可以作为药物载体携带有活性的药物蛋白进行疾病的治疗，且含有重组p120ctn-1的外泌体的效果优于野生型。
序列表
<110> 程张军
雷正清
<120> 一种p120ctn蛋白突变体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2802
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacgact cagaggtgga gtcgaccgcc agcatcttgg cctctgtgaa ggaacaagag 60
gcccagtttg agaagctgac ccgggcgctg gaggaggaac ggcgccacgt ctcggcgcag 120
ctggaacgcg tccgggtcga cccacaagat gccaacccac tcatggccaa cggcacactc 180
acccgccggc atcagaacgg ccggtttgtg ggcgatgctg accttgaaag acagaaattt 240
tcagatttga aactcaacgg accccaggat cacagtcacc ttctatatag caccatcccc 300
aggatgcagg agccggggca gattgtggag acctacacgg aggaggatcc tgagggagcc 360
atgtctgtag tctctgtgga gacctcagat gatgggacca ctcggcgcac agagaccacg 420
gtcaagaaag tagtgaagac tgtgacaaca cggacagtac agccagtcgc tatgggacca 480
gacgggttgc ctgtggatgc ttcatcagtt tctaacaact atatccagac tttgggtcgt 540
gatttccgca agaatggcaa tgggggacct ggtccctatg tggggcaagc tggcactgct 600
acccttccta ggaacttcca ctaccctcct gatggttata gtcgccacta tgaagatggt 660
tatccaggtg gcagtgataa ctatggcagt ctgtcccggg tgacccgcat tgaggagcgg 720
tataggccca gcatggaagg ctaccgggca cctagtagac aggatgtgta tgggccccaa 780
ccccaggttc gggtaggtgg gagcagcgtg gatctgcatc gctttcatcc agagccttat 840
gggctagagg atgaccagcg tagtatgggc tatgatgacc tggattatgg tatgatgtct 900
gattatggca ctgcccgtcg gactgggaca ccctctgacc ctcgtcggcg cctcaggagc 960
tatgaagaca tgattggtga ggaggtgcca tcggatcaat actactgggc tcctttggcc 1020
cagcatgagc gaggaagttt agcaagcttg gatagcctgc gcaaaggagg gcctccacct 1080
cctaattgga gacagccaga gctgccagag gtgatcgcca tgcttggatt ccgcttgggt 1140
gctgtcaagt ccaatgcagc tgcatacctg caacacttat gctaccgcaa tgacaaggtg 1200
aagactgacg tgcggaagct caagggcatc ccagtactgg tgggattgtt agaccatccc 1260
aaaaaggaag tgcaccttgg agcctgtgga gctctcaaga atatctcttt tggacgtgac 1320
caggataaca agattgccat aaaaaactgt gatggtgtgc ctgcccttgt gcgattgctt 1380
cgaaaggctc gtgatatgga ccttactgaa gttattaccg gaaccctgtg gaatctttca 1440
tcccatgact caatcaaaat ggagattgtg gaccatgcac tgcatgcctt gacagatgaa 1500
gtgatcattc ctcattctgg ttgggagcgg gaacctaatg aagactgtaa gccacgccat 1560
attgagtggg aatcggtgct caccaacaca gctggctgcc ttaggaatgt aagctcagag 1620
aggagtgaag ctcgccggaa acttcgggaa tgtgatggtt tagttgatgc cctcattttc 1680
attgttcagg ctgagattgg gcagaaggat tcagacagca agcttgtaga gaactgtgtt 1740
tgccttcttc ggaacttatc atatcaagtt caccgggaga tcccacaggc agagcgttac 1800
caagaggcag ctcccaatgt tgccaacaat actgggccac atgctgccag ttgctttggg 1860
gccaagaagg gcaaagggaa aaaacctata gaggatccag caaacgatac agtggatttc 1920
cctaaaagaa cgagtccagc tcgaggctat gagctcttat ttcagccaga ggtggttcgg 1980
atatacatct cacttcttaa ggagagcaag actcctgcca tcctagaagc ctcagctgga 2040
gctatccaga acttgtgtgc tgggcgctgg acgtatggtc gatacatccg ctctgctctg 2100
cgtcaagaga aggctctttc tgccatagct gacctcctga ctaatgaaca tgaacgggtg 2160
gtgaaagctg catctggagc actgagaaac ctggctgtgg atgctcgcaa caaagaatta 2220
attggtaaac atgctattcc taacttggta aagaatctgc caggaggaca gcagaactcc 2280
tcttggaatt tctctgagga cactgtcatc tctattttga acactatcaa cgaggttatc 2340
gctgagaact tggaggctgc caaaaagctt cgagagacac agggtattga gaagctggtg 2400
ttgatcaaca aatcagggaa ccgctcagaa aaagaagttc gagcagcagc acttgtatta 2460
cagacaatct ggggatataa ggaactgcgg aagccactgg aaaaagaagg atggaagaaa 2520
tcagactttc aggtgaatct aaacaatgct tcccgaagcc agagcagtca ttcatatgat 2580
gatagtactc tccctctcat tgaccggaac caaaaatcag ataagaaacc tgatcgggaa 2640
gaaattcaga tgagcaatat gggatcaaac acaaaatcac tagataacaa ctattccaca 2700
ccaaatgaga gaggagacca caatagaaca ctggatcgat cgggggatct aggcgacatg 2760
gagccattga agggaacaac acccttgatg cagaagattt aa 2802
<210> 2
<211> 933
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Asp Ser Glu Val Glu Ser Thr Ala Ser Ile Leu Ala Ser Val
1 5 10 15
Lys Glu Gln Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu Thr Arg Ala Leu Glu Glu
20 25 30
Glu Arg Arg His Val Ser Ala Gln Leu Glu Arg Val Arg Val Asp Pro
35 40 45
Gln Asp Ala Asn Pro Leu Met Ala Asn Gly Thr Leu Thr Arg Arg His
50 55 60
Gln Asn Gly Arg Phe Val Gly Asp Ala Asp Leu Glu Arg Gln Lys Phe
65 70 75 80
Ser Asp Leu Lys Leu Asn Gly Pro Gln Asp His Ser His Leu Leu Tyr
85 90 95
Ser Thr Ile Pro Arg Met Gln Glu Pro Gly Gln Ile Val Glu Thr Tyr
100 105 110
Thr Glu Glu Asp Pro Glu Gly Ala Met Ser Val Val Ser Val Glu Thr
115 120 125
Ser Asp Asp Gly Thr Thr Arg Arg Thr Glu Thr Thr Val Lys Lys Val
130 135 140
Val Lys Thr Val Thr Thr Arg Thr Val Gln Pro Val Ala Met Gly Pro
145 150 155 160
Asp Gly Leu Pro Val Asp Ala Ser Ser Val Ser Asn Asn Tyr Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Gly Arg Asp Phe Arg Lys Asn Gly Asn Gly Gly Pro Gly Pro
180 185 190
Tyr Val Gly Gln Ala Gly Thr Ala Thr Leu Pro Arg Asn Phe His Tyr
195 200 205
Pro Pro Asp Gly Tyr Ser Arg His Tyr Glu Asp Gly Tyr Pro Gly Gly
210 215 220
Ser Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Ser Arg Val Thr Arg Ile Glu Glu Arg
225 230 235 240
Tyr Arg Pro Ser Met Glu Gly Tyr Arg Ala Pro Ser Arg Gln Asp Val
245 250 255
Tyr Gly Pro Gln Pro Gln Val Arg Val Gly Gly Ser Ser Val Asp Leu
260 265 270
His Arg Phe His Pro Glu Pro Tyr Gly Leu Glu Asp Asp Gln Arg Ser
275 280 285
Met Gly Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr Gly Met Met Ser Asp Tyr Gly Thr
290 295 300
Ala Arg Arg Thr Gly Thr Pro Ser Asp Pro Arg Arg Arg Leu Arg Ser
305 310 315 320
Tyr Glu Asp Met Ile Gly Glu Glu Val Pro Ser Asp Gln Tyr Tyr Trp
325 330 335
Ala Pro Leu Ala Gln His Glu Arg Gly Ser Leu Ala Ser Leu Asp Ser
340 345 350
Leu Arg Lys Gly Gly Pro Pro Pro Pro Asn Trp Arg Gln Pro Glu Leu
355 360 365
Pro Glu Val Ile Ala Met Leu Gly Phe Arg Leu Gly Ala Val Lys Ser
370 375 380
Asn Ala Ala Ala Tyr Leu Gln His Leu Cys Tyr Arg Asn Asp Lys Val
385 390 395 400
Lys Thr Asp Val Arg Lys Leu Lys Gly Ile Pro Val Leu Val Gly Leu
405 410 415
Leu Asp His Pro Lys Lys Glu Val His Leu Gly Ala Cys Gly Ala Leu
420 425 430
Lys Asn Ile Ser Phe Gly Arg Asp Gln Asp Asn Lys Ile Ala Ile Lys
435 440 445
Asn Cys Asp Gly Val Pro Ala Leu Val Arg Leu Leu Arg Lys Ala Arg
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Asn Thr Ala Gly Cys Leu Arg Asn Val Ser Ser Glu Arg Ser Glu Ala
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Lys Gly Lys Lys Pro Ile Glu Asp Pro Ala Asn Asp Thr Val Asp Phe
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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900 905 910
Arg Ser Gly Asp Leu Gly Asp Met Glu Pro Leu Lys Gly Thr Thr Pro
915 920 925
Leu Met Gln Lys Ile
930
<210> 4
<211> 2802
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
atggacgact cagaggtgga gtcgaccgcc agcatcttgg cctctgtgaa ggaacaagag 60
gcccagtttg agaagctgac ccgggcgctg gaggaggaac ggcgccacgt ctcggcgcag 120
ctggaacgcg tccgggtctc accacaagat gccaacccac tcatggccaa cggcacactc 180
acccgccggc atcagaacgg ccggtttgtg ggcgatgctg accttgaaag acagaaattt 240
tcagatttga aactcaacgg accccaggat cacagtcacc ttctatatag caccatcccc 300
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atgtctgtag tctctgtgga gacctcagat gatgggacca ctcggcgcac agagaccacg 420
gtcaagaaag tagtgaagac tgtgacaaca cggacagtac agccagtcgc tatgggacca 480
gacgggttgc ctgtggatgc ttcatcagtt tctaacaact atatccagac tttgggtcgt 540
gatttccgca agaatggcaa tgggggacct ggtccctatg tggggcaagc tggcactgct 600
acccttccta ggaacttcca ctaccctcct gatggttata gtcgccacta tgaagatggt 660
tatccaggtg gcagtgataa ctatggcagt ctgtcccggg tgacccgcat tgaggagcgg 720
tataggccca gcatggaagg ctaccgggca cctagtagac aggatgtgta tgggccccaa 780
ccccaggttc gggtaggtgg gagcagcgtg gatctgcatc gctttcatcc agagccttat 840
gggctagagg atgaccagcg tagtatgggc tatgatgacc tggattatgg tatgatgtct 900
gattatggca ctgcccgtcg gactgggaca ccctctgacc ctcgtcggcg cctcaggagc 960
tatgaagaca tgattggtga ggaggtgcca tcggatcaat actactgggc tcctttggcc 1020
cagcatgagc gaggaagttt agcaagcttg gatagcctgc gcaaaggagg gcctccacct 1080
cctaattgga gacagccaga gctgccagag gtgatcgcca tgcttggatt ccgcttgggt 1140
gctgtcaagt ccaatgcagc tgcatacctg caacacttat gctaccgcaa tgacaaggtg 1200
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aaaaaggaag tgcaccttgg agcctgtgga gctctcaaga atatctcttt tggacgtgac 1320
caggataaca agattgccat aaaaaactgt gatggtgtgc ctgcccttgt gcgattgctt 1380
cgaaaggctc gtgatatgga ccttactgaa gttattaccg gaaccctgtg gaatctttca 1440
tcccatgact caatcaaaat ggagattgtg gaccatgcac tgcatgcctt gacagatgaa 1500
gtgatcattc ctcattctgg ttgggagcgg gaacctaatg aagactgtaa gccacgccat 1560
attgagtggg aatcggtgct caccaacaca gctggctgcc ttaggaatgt aagctcagag 1620
aggagtgaag ctcgccggaa acttcgggaa tgtgatggtt tagttgatgc cctcattttc 1680
attgttcagg ctgagattgg gcagaaggat tcagacagca agcttgtaga gaactgtgtt 1740
tgccttcttc ggaacttatc atatcaagtt caccgggaga tcccacaggc agagcgttac 1800
caagaggcag ctcccaatgt tgccaacaat actgggccac atgctgccag ttgctttggg 1860
gccaagaagg gcaaagggaa aaaacctata gaggatccag caaacgatac agtggatttc 1920
cctaaaagaa cgagtccagc tcgaggctat gagctcttat ttcagccaga ggtggttcgg 1980
atatacatct cacttcttaa ggagagcaag actcctgcca tcctagaagc ctcagctgga 2040
gctatccaga acttgtgtgc tgggcgctgg acgtatggtc gatacatccg ctctgctctg 2100
cgtcaagaga aggctctttc tgccatagct gacctcctga ctaatgaaca tgaacgggtg 2160
gtgaaagctg catctggagc actgagaaac ctggctgtgg atgctcgcaa caaagaatta 2220
attggtaaac atgctattcc taacttggta aagaatctgc caggaggaca gcagaactcc 2280
tcttggaatt tctctgagga cactgtcatc tctattttga acactatcaa cgaggttatc 2340
gctgagaact tggaggctgc caaaaagctt cgagagacac agggtattga gaagctggtg 2400
ttgatcaaca aatcagggaa ccgctcagaa aaagaagttc gagcagcagc acttgtatta 2460
cagacaatct ggggatataa ggaactgcgg aagccactgg aaaaagaagg atggaagaaa 2520
tcagactttc aggtgaatct aaacaatgct tcccgaagcc agagcagtca ttcatatgat 2580
gatagtactc tccctctcat tgaccggaac caaaaatcag ataagaaacc tgatcgggaa 2640
gaaattcaga tgagcaatat gggatcaaac acaaaatcac tagataacaa ctattccaca 2700
ccaaatgaga gaggagacca caatagaaca ctggatcgat cgggggatct aggcgacatg 2760
gagccattga agggaacaac acccttgatg cagaagattt ag 2802
<210> 4
<211> 933
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Asp Asp Ser Glu Val Glu Ser Thr Ala Ser Ile Leu Ala Ser Val
1 5 10 15
Lys Glu Gln Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu Thr Arg Ala Leu Glu Glu
20 25 30
Glu Arg Arg His Val Ser Ala Gln Leu Glu Arg Val Arg Val Ser Pro
35 40 45
Gln Asp Ala Asn Pro Leu Met Ala Asn Gly Thr Leu Thr Arg Arg His
50 55 60
Gln Asn Gly Arg Phe Val Gly Asp Ala Asp Leu Glu Arg Gln Lys Phe
65 70 75 80
Ser Asp Leu Lys Leu Asn Gly Pro Gln Asp His Ser His Leu Leu Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Arg Pro Ser Met Glu Gly Tyr Arg Ala Pro Ser Arg Gln Asp Val
245 250 255
Tyr Gly Pro Gln Pro Gln Val Arg Val Gly Gly Ser Ser Val Asp Leu
260 265 270
His Arg Phe His Pro Glu Pro Tyr Gly Leu Glu Asp Asp Gln Arg Ser
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Tyr Glu Asp Met Ile Gly Glu Glu Val Pro Ser Asp Gln Tyr Tyr Trp
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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770 775 780
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Pro Leu Ile Asp Arg Asn Gln Lys Ser Asp Lys Lys Pro Asp Arg Glu
865 870 875 880
Glu Ile Gln Met Ser Asn Met Gly Ser Asn Thr Lys Ser Leu Asp Asn
885 890 895
Asn Tyr Ser Thr Pro Asn Glu Arg Gly Asp His Asn Arg Thr Leu Asp
900 905 910
Arg Ser Gly Asp Leu Gly Asp Met Glu Pro Leu Lys Gly Thr Thr Pro
915 920 925
Leu Met Gln Lys Ile
930

Claims (10)

1.一种p120ctn蛋白突变体p120ctn-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的突变体p120ctn-1的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.表达权利要求1所述的突变体p120ctn-1的菌株。
5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌BRIX1-1，保藏编号CCTCC No:M 2019044。
6.权利要求1所述的突变体p120ctn-1在制备治疗癌症药物中的应用。
7.权利要求1所述的突变体p120ctn-1在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.一种包载p120ctn-1蛋白的外泌体。
9.权利要求8所述的包载p120ctn-1蛋白的外泌体在制备治疗癌症药物中的应用。
10.权利要求8所述的包载p120ctn-1蛋白的外泌体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2001067097A2 (en) * 2000-03-10 2001-09-13 Glaxo Group Limited Method of identifying modulators of presenilin

Patent Citations (1)

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葛梓: "p120ctn在肿瘤侵袭转移中的作用及其机制", 《肿瘤防治研究》 *

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