CN110317197A - 一种氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及其药用盐或溶剂化物。本发明还涉及式(I)化合物的制备方法及其药物组合物和医药用途。本发明的式(I)化合物具有保护肝损伤，抗氧化、调节血脂异常的作用，可以作为治疗肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、乙肝、丙肝、肝纤维化及肝癌等疾病药物。

Description

一种氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及化合物领域，尤其是涉及一种氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
水飞蓟素是从菊科植物水飞蓟(Silybum marianum(L.)Gaertn.)的种子和果实中提取分离出的含水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟丁四个黄酮木酚素异构体组成的标准提取物。其水飞蓟宾(Silybin)的成分含量在50％—70％左右，属黄酮木质素类化合物。
水飞蓟宾用于肝脏疾病的治疗已有两千年的历史，是天然的保肝药物，其作用机制主要是抗氧化、抗脂质过氧化、清除自由基和稳定细胞膜。目前临床上应用的水飞蓟宾制剂有水林佳(水飞蓟宾胶囊，天士力医药集团股份有限公司)、益肝灵(水飞蓟宾葡甲胺片，复星朝晖药业有限公司)、西立匹特(水飞蓟素与卵磷脂复合物胶囊)等。同时，水飞蓟宾还广泛用于非酒精性脂肪肝、抗抑郁、降血脂、保护心肌、抑制癌细胞增殖以及神经保护等多个新适应症的探索开发。
由于水飞蓟宾的脂溶性和水溶性均较差，体内生物利用度低，个体对药物的吸收差异较大，从而降低水飞蓟宾的临床疗效。为此，国内外学者通过化学修饰的方法制备各种水飞蓟宾衍生物及其类似物，或采取水飞蓟宾与其他载体、包膜以及固体分散体结合的结构修饰方法来增加其溶解性，增强临床应用疗效。例如，将水飞蓟宾23位羟基基团修饰为硫酸、磷酸二酯等亲水基团，可以降低衍生物的logP，改善水飞蓟宾的亲水性，抗氧化细胞模型试验显示该系列衍生物具有与水飞蓟宾相似或者更好的抗氧化活性(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2011,21(15):4389-4392)。采用高压匀质法制备水飞蓟宾纳米晶体自稳定Pickering乳液，大鼠灌胃给药后AUC比水飞蓟宾原料药提高了3.8倍，生物利用度明显提高(Acta Pharmaceutica Sinica,2016,(5):813-820)。
曼尼希碱是存在于自然界中的一类含氮有机化合物，多具有显著而特殊的生物活性。许多生物碱、核苷酸、甾族化合物、肽、抗生素和维生素均包括氨甲基片段。生物活性,例如抗氧化，抗真菌，抗疟，血管舒张，抗结核，镇痛，抗癌等,是这类化合物的常见特征。然而在水飞蓟宾的研究过程中，却没有合成氨甲基化衍生物的报道，水飞蓟宾类化合物是否适用于合成氨甲基化衍生物，以及合成后的氨甲基化衍生物是否可以改善水飞蓟宾类化合物的性质，都是未知的。
发明内容
本发明设计合成一系列氨甲基取代水飞蓟宾衍生物，通过向水飞蓟宾分子结构中引入氮原子改善其药理活性，疗效提高，并具有保护肝损伤、抗氧化、调节血脂异常的作用，可以作为治疗肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等疾病药物。通过成盐改善其水溶性，提高生物利用度。
本发明的一个目的是提供式(I)所示的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物或其药用盐或溶剂化物：
其中，单元可以为碳碳单键-(CH-CH)-或者碳碳双键-(C＝C)-；其中R1，R2分别独立地选自H、有机仲胺亚甲基，R1，R2不同时为H。
所述的有机仲胺亚甲基选自二甲胺基亚甲基、二乙胺基亚甲基、二丙胺基亚甲基、二丁胺基亚甲基、哌啶亚甲基、吡咯烷亚甲基、吗啉亚甲基、哌嗪亚甲基、4-取代哌嗪亚甲基、4-哌啶醇亚甲基、4-哌啶酮亚甲基、葡甲胺亚甲基、L-脯氨醇亚甲基。优选所述的有机仲胺亚甲基选自哌啶亚甲基、二乙胺基亚甲基、哌嗪亚甲基、4-哌啶醇亚甲基、L-脯氨醇亚甲基。
优选的，本发明所提供的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物为如下具体化合物：
更优选的，本发明所提供的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物为如下具体化合物：
本发明的另一目的是提供式(I)所示的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物的制备方法:分别以水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾为起始原料，与有机仲胺类化合物和甲醛溶液在有机溶剂中经曼尼希氨甲基化反应得到的。
其中，所述的有机仲胺类化合物选自二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、哌啶、吡咯烷、吗啉、哌嗪、4-取代哌嗪、4-哌啶醇、4-哌啶酮、葡甲胺、L-脯氨醇。
反应有机溶剂选自乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、醋酸；其中优选为甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和醋酸。
水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物的摩尔投料比例为1：0.3～1：10.0；其中，当水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物摩尔投料比小于1:0.5时，主要得到R1为有机仲胺亚甲基取代基的单取代Mannich碱衍生物，当水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物摩尔投料比大于1:2时，主要得到R1、R2均为有机仲胺亚甲基取代基的双取代Mannich碱衍生物。当水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物摩尔投料比1:0.5-1:2，主要是单氨甲基化水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-a)和双氨甲基化水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-b)的混合物。优选，水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物的投料比例为1：4～1：6。
反应温度为室温至回流温度，反应时间10-48h。
优选的，本发明的制备方法包括几个方法：
将水飞蓟宾或者2,3-脱氢水飞蓟宾、甲醛水溶液、有机仲胺类化合物溶于甲醇中，室温搅拌24-36h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品，经纯化后得单氨甲基化水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-a)，其中水飞蓟宾或者2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物投料比小于1:0.5。
将水飞蓟宾或者2,3-脱氢水飞蓟宾、甲醛水溶液、有机仲胺类化合物溶于甲醇中，室温搅拌24-36h反应完全，终止反应。反应液中析出固体，经纯化后得双氨甲基化水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-b)，其中水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾与有机仲胺类化合物投料比大于1:2。
所述的纯化包括但不限于色谱柱分离、重结晶、硅胶柱分离、过滤等。分离纯化步骤可以根据每个化合物的性质进行调整。
式(I)所示的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物可以与有机酸或者无机酸形成药用盐，增加水溶性，其中有机酸或者无机酸可以选自硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、酒石酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、甲酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、草酸或琥珀酸，优选盐酸、氢硫酸或者柠檬酸、草酸。优选盐酸。
本发明的式(Ⅰ)化合物或其药用盐或溶剂化物可以与药学上常用的辅料或载体结合，从而制备具有治疗和/或预防肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等疾病的药物组合物。
上述各类药物组合物可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、口服液或软膏剂，还可以是控释或缓释剂型。
在本文中，所有涉及式(Ⅰ)化合物、“式(I)所示的化合物”和类似表述的技术方案均同时涵盖本发明所述的药用盐或溶剂化物。
本发明的式(Ⅰ)化合物适宜以药物组合物的形式给药。这类组合物可以按照常规方式与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能，在治疗上将本发明的式(Ⅰ)化合物作为原料药给药，优选活性成分直接作为药物制剂。在与其它成分相容和对服药者无害的意义上，载体必须是药学上可接受的。
因此，本发明进一步提供本发明的式(Ⅰ)化合物的药物制剂，其包含本发明的式(Ⅰ)化合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，以及含有或不含其它治疗和/或预防性成分。这些制剂适用于口服、胃肠外(包括皮下例如注射或药库片；真皮内；鞘内；肌内例如药库；静脉内等)、直肠和局部(如舌下)给药，但最适合的给药途径应取决于患者的病症。该制剂可以是单位制剂，并且可以通过用药学领域熟知的任一种方法制备。所有方法包括使本发明的式(Ⅰ)化合物与载体结合的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。一般来说，该制剂的制备过程如下：使本发明的式(Ⅰ)化合物与液体载体、或微细粉碎的固体载体、或二者的结合均匀而紧密的结合，然后，如果必要的话，使产物成型为所必须的制剂。
通常可使用标准的制药技术，即可将本发明的式(Ⅰ)化合物和药学上可接受的载体或赋形剂制得本发明药物组合物，这些方法包括混合、制粒和压制。本领域技术人员所熟知的是，药学上可接受的载体或赋形剂的形式和特性取决于与其混合的活性成分的量、给药途径和其它已知因素。
本文中，所用的药学上可接受的载体或赋形剂是可与药物组合物联用给药的各种有机或无机的载体或赋形剂，例如用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和包衣剂；也可使用药用添加剂，例如着色剂和甜味剂。所述药学上可接受的载体或赋形剂选自：糖醇，例如甘露醇、山梨醇、木糖醇；氨基酸，例如盐酸半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸；维生素C；EDTA二钠、EDTA钙钠；无机盐，例如一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液；氯化钠、氯化钾；焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠；碳酸钙、碳酸氢钙；硬脂酸盐，例如硬脂酸钙、硬脂酸镁；无机酸，例如盐酸、醋酸、硫酸、磷酸；有机酸盐，例如乳酸钠；寡糖、多糖、纤维素及其衍生物，例如麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、蔗糖、乳糖、环糊精(例如β-环糊精)、淀粉；硅衍生物；藻酸盐；明胶；聚乙烯吡咯烷酮；甘油；琼脂；表面活性剂，例如吐温80；聚乙二醇；磷脂类材料；高岭土；滑石粉等。
其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂，例如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂；胶囊剂，例如硬胶囊剂、软胶囊剂；口服液；口含剂；颗粒剂；冲剂；丸剂；散剂；膏剂；丹剂；混悬剂；粉剂；溶液剂；注射剂；栓剂；膏剂，例如软膏剂、硬膏剂；霜剂；喷雾剂；滴剂以及贴剂。本发明的制剂优选：口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；以及注射剂，如粉针剂、注射液、输液等。本发明的制剂最优选为片剂。
其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
优选的示例赋形剂包括：乳糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉如α-淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硅酸铝镁等。
优选的示例润滑剂包括：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、硅胶等。
优选的示例粘合剂包括：α-淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、吡咯烷酮等。
优选的示例崩解剂包括：乳糖、糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、氨烷基钠、羧甲基淀粉钠、轻质无水硅酸、低取代的羟丙基纤维素等。
优选的示例包衣剂包括：羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等。
优选的示例着色剂包括：水溶性食用枸橼黄染料(食用染料例如食用红No.2和No.3，食用黄No.4和No.5，食用蓝No.1和No.2)；水不溶性色沉染料(例如上述水溶性食用枸橼黄染料的铝盐)；天然染料(例如β-胡萝卜素、叶绿素、铁丹)等。
优选的示例甜味剂包括：糖精钠、甘草次酸、阿斯帕坦、甜菊等。
片剂的制备方法一般为：将本发明的式(I)化合物与一种或多种药学上可接受的辅料一起压制或模制。
本发明的式(I)化合物还可以制成口服液体制剂，例如水性或油性悬液、溶液、乳剂、糖浆剂等。本发明的式(I)化合物还可以是干燥产品，使用前用水或其它适合的载体混合。这类液体制剂可以含有常规的添加剂，可以包括悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可以包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇或乙醇；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。
用于胃肠道外给药的制剂包括水性与非水性无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、等渗剂等；以及水性与非水性无菌混悬液，其中可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存放在单剂量或多计量容器内，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临时用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。
用于直肠给药的制剂可以是栓剂，含有常规的栓剂基质，例如可可脂、硬脂肪酸或其它甘油酯，或乙二醇。
用于口腔局部、例如颊部或舌下给药的制剂包括锭剂，其中在加味的基质中包含活性成分，该基质例如蔗糖和阿拉伯胶；还包括软锭剂，其中在基质中含有活性成分，该基质可以是明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶。
本发明的式(I)化合物还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射给药。所以，本发明式(I)化合物可以与适合的聚合物或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。
本发明另一个目的是提供式(I)化合物或其药用盐或溶剂化物在制备用于治疗和/或预防肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等疾病药物中的应用。
有益效果
本发明化合物具有保护肝损伤、抗氧化、调节血脂异常的作用，可以作为治疗肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、肝纤维化及肝癌等疾病药物。
本发明设计合成一系列氨甲基取代水飞蓟宾衍生物，通过向水飞蓟宾分子结构中引入氮原子改善其药理活性，尤其是对四氯化碳造成的肝损伤活性更强。在四氯化碳造成的肝损伤模型中会产生大量的过氧化物自由基，这些自由基可造成机体的损害，诱导小鼠肝细胞发生不同程度的脂肪性变。与模型组相比，阳性药水林佳组对TG的升高无明显改善，说明水飞蓟宾对于肝脏脂质过氧化的抑制作用较弱。而本发明化合物与模型组相比，TG含量显著降低(P<0.05)，抑制能力显著优于水林佳对照组。其作用机制可能是通过向水飞蓟宾分子结构中引入氮原子降低肝内脂质过氧化反应，改善细胞免疫等功能从而实现对肝细胞的保护。
本发明化合物引入氮原子更容易与胃酸中的酸性物质或者无机酸或者有机酸形成水溶性盐大大增大了衍生物的水溶性，溶解度比水飞蓟宾提高1000倍,促进药物在体内的吸收，改善水飞蓟宾的生物利用度，甚至可以实现静脉注射给药。
本发明的合成工艺简单，通过调整原料的投料比例来控制水飞蓟宾氨甲基化取代位置，获得不同取代度的氨甲基化水飞蓟宾衍生物。
附图说明
图1、肝组织病理学研究结果。
A、正常组；B、模型组；C、水林佳组；D、(I-1)组；E.(I-2组；F.(I-3)组；G.(I-4)组；H.(I-5)组；I.(I-6)组；J.(I-7)组；K.(I-8)组；L.(Ⅰ-9)组。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明。下述实施例给出了式(Ⅰ)所示的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物的制备方法及相关结构鉴定数据。下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：8-(N-亚甲基哌啶基)水飞蓟宾(Ⅰ-1)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-1盐酸盐
将水飞蓟宾(5.0g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(0.48g，5.2mmol)、哌啶(0.44g，5.2mmol)置于50mL甲醇中，室温搅拌。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，24h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品5.7g，加入100ml乙酸乙酯打浆2h，减压过滤后，经硅胶柱色谱(CH2Cl2-CH3OH＝10:1-8:1)分离得(Ⅰ-1)0.9g(收率30％)。将制得的(Ⅰ-1)溶于甲醇-盐酸溶液(100ml)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得到(Ⅰ-1)盐酸盐0.95g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.02～6.82(6H,m)，5.62(1H,s)，4.99～4.94(1H,m)，4.93～4.90(1H,m)，4.56～4.46(1H,m)，4.18～4.15(1H,m)，3.78(3H,s)，3.60(2H,s)，3.36～3.32(2H,m)，2.45～2.24(4H,m)，1.61～1.45(6H,m)；ESI-MS:[M+H]+,580.69.
实施例2：6,8-双(N-亚甲基哌啶基)水飞蓟宾(I-2)及其盐酸盐的制备
I-2盐酸盐
将水飞蓟宾(5.0g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(3.38g，41.7mmol)、哌啶(3.55g，41.7mmol)置于25mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，24h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品6.5g，100ml乙醇打浆2h后减压过滤，固体经干燥后得(Ⅰ-2)3.7g(收率52.9％)。将制得的(Ⅰ-2)溶于甲醇-盐酸溶液(100ml)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得(Ⅰ-2)盐酸盐3.9g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.12-6.80(6H,m)，4.99-4.94(1H,m)，4.93-4.90(1H,m)，4.66-4.46(1H,m)，4.18-4.15(1H,m)，3.78(3H,s)，3.60(4H,m)，3.36-3.32(2H,m)，2.45-2.24(8H,m)，1.61-1.45(12H,m)；ESI-MS:[M+H]+,677.75.
实施例3：8-(N-亚甲基二乙胺基)水飞蓟宾(I-3)及其盐酸盐的制备
I-3盐酸盐
将水飞蓟宾(10.0g，20.8mmol)、37％甲醛水溶液(1.0g，10.4mmol)、二乙胺(0.76g，10.4mmol)置于80mL甲醇中，室温搅拌。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，24h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品10.3g，加入100mL乙酸乙酯打浆2h，减压过滤后，经硅胶柱色谱(CH2Cl2-CH3OH＝10:1-8:1)分离得(I-3)2.1g(收率19％)。将制得的(I-3)溶于甲醇-盐酸溶液(100mL)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得到(I-3)盐酸盐2.12g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.07～6.82(6H,m)，5.54(1H,s)，4.99～4.94(1H,m)，4.98～4.93(1H,m)，4.92～4.90(1H,m)，4.50～4.45(1H,m)，3.79(3H,s)，3.60(2H,s)，3.36～3.32(2H,m)，2.87～2.81(4H,m)，1.16～1.12(6H,m)；ESI-MS:[M+H]+,568.68.
实施例4：6,8-双(N-亚甲基二乙胺基)水飞蓟宾(Ⅰ-4)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-4盐酸盐
将水飞蓟宾(10g，20.8mmol)、37％甲醛水溶液(11.5g，124.8mmol)、二乙胺(9.23g，124.8mmol)置于100mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，30h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品18g，100mL乙醇打浆2h后减压过滤，固体经干燥后得(I-4)6.0g(收率38.5％)。将制得的(Ⅰ-4)溶于甲醇-盐酸溶液(100mL)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得(Ⅰ-4)盐酸盐6.2g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.02～6.80(6H,m)，5.09～5.05(1H,m)，4.99～4.95(1H,m)，4.92～4.90(1H,m)，4.50～4.45(1H,m)，3.79(3H,s)，3.60(2H,s)，3.36～3.32(2H,m)，2.87～2.81(4H,m)，1.16～1.12(6H,m)；ESI-MS:[M+H]+,653.73.
实施例5：8-(N-亚甲基-N’-甲基哌嗪基)水飞蓟宾(I-5)及其盐酸盐的制备
I-5盐酸盐
将水飞蓟宾(5g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(5.7g，62.4mmol)、N-甲基哌嗪(6.24g，62.4mmol)置于50mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝5:1)跟踪反应，20h反应完全，终止反应。反应中析出固体，过滤后固体经100mL乙醇打浆2h，减压过滤，固体经干燥后得(Ⅰ-5)1.4g(收率19.1％)。将制得的(Ⅰ-5)溶于甲醇-盐酸溶液(50mL)中，搅拌浓缩干燥得(Ⅰ-5)盐酸盐。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08-6.55(6H,m)，4.92-4.90(1H,m)，4.86-4.83(1H,m)，4.56-4.48(1H,m)，4.22-4.15(1H,m)，3.75(3H,s)，3.62(4H,m)，3.36-3.32(2H,m)，2.45-2.24(16H,m)，2.25(6H,s)；ESI-MS:[M+H]+,707.78.
实施例6：6,8-双(N-亚甲基脯氨醇基)水飞蓟宾(Ⅰ-6)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-6盐酸盐
将水飞蓟宾(5g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(5.7g，62.4mmol)、L-脯氨醇(6.30g，62.4mmol)置于50mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝5:1)跟踪反应，20h反应完全，终止反应。反应中析出固体，过滤后固体经100mL乙醇打浆2h，减压过滤，固体经干燥后得(Ⅰ-6)2.2g(收率30％)。将制得的(Ⅰ-6)溶于甲醇-盐酸溶液(50mL)中，搅拌浓缩干燥得(Ⅰ-6)盐酸盐。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.21-6.83(6H,m)，5.04-4.99(1H,m)，4.92-4.90(1H,m)，4.65-4.52(1H,m)，4.22-4.15(1H,m)，3.75(3H,s)，3.71-3.66(2H,m)，3.62-3.58(4H,s)，3.46-3.40(2H,m),2.33-2.20(6H,m)，1.42-1.67(8H,m)；ESI-MS:[M+H]+,709.75.
实施例7：8-(N-亚甲基哌啶基)脱氢水飞蓟宾(Ⅰ-7)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-7盐酸盐
将脱氢水飞蓟宾(5.0g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(0.48g，5.2mmol)、哌啶(0.44g，5.2mmol)置于50mL甲醇中，室温搅拌。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，20h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品，加入100mL乙酸乙酯打浆2h，减压过滤后，经硅胶柱色谱(CH2Cl2-CH3OH＝10:1-5:1)分离得(Ⅰ-7)1.3g(收率43％)。将制得的(Ⅰ-7)溶于甲醇盐酸溶液(100mL)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得到(Ⅰ-7)盐酸盐1.35g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.80～7.76(2H,m)，7.11～6.81(4H,m)，6.10(1H,s)，4.99～4.95(1H,m),4.26～4.24(1H,m),3.89(3H,s),3.80(2H,s)，3.50～3.35(2H,m)，2.55～2.24(4H,m)，1.40～1.60(6H,m)；ESI-MS:[M+H]+,578.58.
实施例8：6,8-双(N-亚甲基哌啶基)脱氢水飞蓟宾(I-8)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-8盐酸盐
将脱氢水飞蓟宾(5.0g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(3.38g，41.7mmol)、哌啶(3.55g，41.7mmol)置于25mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，40h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品6.5g，加入100mL乙酸乙酯打浆2h，减压过滤后，经硅胶柱色谱(CH2Cl2-CH3OH＝10:1-7:1)分离得(I-8)3.7g(收率52.9％)。将制得的(I-8)溶于甲醇-盐酸溶液(100mL)中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得(I-8)盐酸盐3.9g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(2H,s),7.12-6.82(4H,m),4.98(1H,d,J＝8.0Hz),4.26-4.24(1H,m),3.78(3H,s),3.75(2H,s),3.67(2H,s),3.59(1H,d,J＝10.1Hz),3.39(1H,d,J＝7.8Hz),2.52-2.50(8H,m),1.45-1.55(12H,m)ESI-MS[M+H]+675.29.
实施例9：6,8-双(N-亚甲基羟基哌啶基)脱氢水飞蓟宾(Ⅰ-9)及其盐酸盐的制备
Ⅰ-9盐酸盐
将脱氢水飞蓟宾(5.0g，10.4mmol)、37％甲醛水溶液(3.38g，41.7mmol)、4-羟基哌啶(4.21g，41.7mmol)置于50mL甲醇中，室温搅拌，TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)跟踪反应，24h反应完全，终止反应。减压旋干得粗品，加入100mL乙酸乙酯打浆2h，减压过滤后，经硅胶柱色谱(CH2Cl2-CH3OH＝10:1-5:1)分离得(I-9)2.7g(收率36.5％)。将制得的(I-9)溶于甲醇-盐酸溶液50mL中，搅拌0.5h，经浓缩干燥得(I-9)盐酸盐。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.52(2H,s),6.75-6.53(4H,m),4.98(1H,d,J＝7.8Hz),4.29～4.22(1H,m),3.80(3H,s),3.75(4H,s),3.23(2H,m),2.29-2.19(8H,m),1.52～1.77(8H,m)；ESI-MS[M+H]+707.74.
实施例10：片剂的制备
工艺：
(1)制粒
氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物与微晶纤维素、淀粉和羧甲基淀粉钠，采用等量递加法混合均匀，用适量5％(w/v)PVP的无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，于50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁，用14目筛进行整粒。
(2)压片
取上述颗粒用冲模压片机压片。
实施例11：胶囊剂的制备
工艺：
(1)制粒
氨甲基取代水飞蓟宾衍生物及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物与淀粉、羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量5％(w/v)PVP的无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁，用14目筛进行整粒。
2.灌装
取上述颗粒装入胶囊壳中。
实施例12：注射液的制备
处方：
工艺：
取处方量的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物，加注射用水1000mL使溶解，搅拌均匀；另取处方量的甘露醇，加注射用水500mL使溶解，加入上述溶液中，搅匀，用0.5g活性碳保温搅拌30min，过滤，滤液调节pH为4.5-5.0，加注射用水至2500mL，除菌过滤，分装即得。
本发明在制药领域中的应用完全不局限于此，原料药还可以是权利要求1-2中所述任何一项化合物或其可药用酸加成盐。
本发明的药物剂型不完全局限于此，它可以制备成更多的剂型，如滴丸、缓释制剂等任何可服用的药物形式。
试验例1：氨甲基取代水飞蓟宾衍生物对肝损伤的保护作用
(1)实验材料
水飞蓟宾胶囊(水林佳)，规格：35mg/粒，天津天士力圣特制药有限公司，批准文号：国药准字H20040299；实施例1-9化合物(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)，纯度95～98％。各组给药剂量均为40mg·kg-1，其给药量均是根据水飞蓟宾人临床用药量参考换算而成。四氯化碳，批号20150607，天津市华东试剂厂，进口分装，分析纯。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、总胆固醇、甘油三酯测定试剂均购于和光试剂，由和光纯药工业株式会社生产。SPF级雄性ICR小鼠120只，体重20-22g，购于北京维通利华公司，动物合格证号：SCXK(京)2017—0001。
(2)实验方法
将动物称重，编号，随机分组。实验分为12组，分别为正常组、模型组、阳性药组(水林佳，40mg·kg-1)、(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)组(40mg·kg-1)，每组10只，适应性饲养3天，除正常组和模型组分别给予相同体积的纯水和溶媒(2％吐温水溶液)灌胃外，其余各组给予相应剂量灌胃给药，每日1次，连续给药8天。于第8天末次给药2h后立即采用0.08％四氯化碳花生油溶液按0.01mg·g-1腹腔注射。随即禁食不禁水，造模后16个小时摘眼球取血约1mL，4000r·min-1离心10min，取血清-40℃冻存待测。采用全自动生化仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)肝脏甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)活性；同时取肝脏，用生理盐水冲洗组织样品以除去血液，滤纸吸干并称重，计算肝脏指数：肝脏指数＝肝质量(g)/体质量(g)×100％。待称重完成后取小鼠肝左叶，固定于组织固定液中，常规石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。
(3)实验数据统计
采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计学处理，小鼠血清中ALT、AST、LDH、TG及TC的活性及小鼠的肝体比指数均以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
(4)对小鼠肝脏指数的影响
正常对照组、模型组、(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)组各组间小鼠体质量差异均无统计学意义(P＞0.05)；但模型组小鼠肝质量、肝脏指数与正常对照组比较显著增加(P＜0.05)，提示小鼠急性肝损伤模型成功建立；与模型组比较，(I-1)～(I-9)组小鼠肝质量和肝脏指数均显著降低(P＜0.01)，且降低程度均优于水林佳对照组；初步说明氨甲基取代水飞蓟宾衍生物(I-1)～(I-9)对四氯化碳致小鼠肝损伤具有保护作用。各组小鼠肝脏指数测定结果见表1。
表1、氨甲基取代水飞蓟宾衍生物对急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响
n＝8,与正常组相比，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
(5)对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、LDH活性的影响
测定结果显示，模型组小鼠腹腔注射四氯化碳后与正常组比较小鼠血清中ALT、AST、LDH活性均显著升高(P<0.05)，表明肝细胞已受到破坏，原位于细胞内的转氨酶大量入血，ALT、AST、LDH活性升高程度与肝细胞受损的程度呈正相关，提示造模成功。阳性药水林佳对照组与模型组相比较ALT、AST、LDH均明显降低(P<0.05)，表现出良好的肝保护能力；(I-1)～(I-9)组与模型组相比较，ALT、AST、LDH值较模型组均显著降低(P<0.05)，其中(I-3)、(I-4)、(I-6)、(I-8)和(I-9)组下降幅度最为明显(P<0.01)；与水林佳对照组相比较，(I-1)～(I-9)各组ALT、AST降低水平相似，(I-7)、(I-8)和(I-9)组LDH水平显著降低(P<0.01)，优于水林佳组(P<0.05)。说明各氨甲基取代水飞蓟宾衍生物可以减轻四氯化碳对小鼠肝细胞的损伤程度，对肝损伤具有较好的保护作用。各给药组小鼠血清指标测定结果见表2。
表2、氨甲基取代水飞蓟宾衍生物对急性肝损伤小鼠血清ALT,AST和LDH指标的影响
n＝8,与正常组相比，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
(6)对CCl4致急性肝损伤小鼠血清脂质的影响
由表3可见，各给药组与正常组血清TC的数据接近，差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比，四氯化碳4急性肝损伤模型组血清中TG的含量明显升高(P<0.05)，说明四氯化碳可造成小鼠肝损伤并诱导肝脏脂质化发生。与模型组相比，阳性药水林佳组对TG的升高无明显改善，说明水飞蓟宾对于肝脏脂质过氧化的抑制作用较弱。而化合物(I-4)、(I-5)、(I-7)、(I-8)和(I-9)组与模型组相比，TG含量显著降低(P<0.05)，抑制能力优于水林佳对照组；这表明氨甲基取代水飞蓟宾衍生物化合物(I-4)、(Ⅰ-5)、(Ⅰ-7)、(Ⅰ-8)和(Ⅰ-9)可以抑制肝脏受四氯化碳损害造成的肝脏脂质过氧化和加速体内由于肝损伤产生毒素的排出，对小鼠的血脂升高具有明显的抑制作用，提示该系列衍生物对于肝损伤及脂肪肝具有保护作用。
表3、氨甲基取代水飞蓟宾衍生物对急性肝损伤小鼠血清TC和TG指标的影响
n＝8,与正常组相比，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
(7)对小鼠肝组织病理学的影响
病理切片结果图1显示：正常组(A)小鼠肝脏肝组织结构清晰，肝小叶完整，肝细胞结构及形态正常，细胞核大而圆且排列有序，无炎症出现，无纤维增生。模型组(B)肝细胞明显损伤，肝组织结构紊乱，肝细胞肿胀并出现坏死，细胞膜不清楚，细胞核分布杂乱，并伴随有弥漫性炎症细胞浸润现象。水林佳组(C)小鼠肝脏较红润，肝组织结构相对清晰，细胞膜基本清楚，细胞核排列跟正常组排列几乎没有区别，炎症细胞浸润现象得到明显改善。与模型组相比，氨甲基取代水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)各给药组(D、E、F、G、H、I、J、K、L)小鼠肝细胞病理损伤程度均减轻，肝细胞结构比较完整，肝细胞排列相对整齐，中央静脉周围的炎症细胞浸润情况得到明显改善，核仁相对明显，改善程度与阳性对照组相似。以上结果表明，各氨甲基取代水飞蓟宾衍生物对四氯化碳小鼠肝细胞损伤均有保护作用，能减轻四氯化碳对小鼠肝组织的损伤。
综合以上药效学研究，四氯化碳致急性肝损伤小鼠给予本研究设计合成的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)后均能有效抑制血清中AST、ALT水平的升高，说明该系列氨甲基取代水飞蓟宾衍生物能增强肝细胞抗损伤能力，增加膜的稳定性，对肝脏有一定的保护作用。同时，四氯化碳造成的肝损伤模型中会产生大量的过氧化物自由基，这些自由基可造成机体的损害，诱导小鼠肝细胞发生不同程度的脂肪性变。小鼠血清中所含TG显著升高，而(Ⅰ-4)、(Ⅰ-5)、(Ⅰ-7)、(Ⅰ-8)和(Ⅰ-9)可改善肝损伤小鼠的脂类代谢异常，TG含量显著降低，恢复至正常组水平，对TG的抑制作用优于水林佳对照组，其作用机制可能是通过降低肝内脂质过氧化反应，改善细胞免疫等功能从而实现对肝细胞的保护。所以，本研究设计合成的式(Ⅰ)氨甲基取代水飞蓟宾衍生物具有显著的抗肝损伤、抗过氧脂质化及改善血脂生物的活性。
试验例2：氨甲基取代水飞蓟宾衍生物大鼠体内药代动力学研究
根据以上结果，从本发明的9个新化合物中随机1-9化合物I-4及I-8作为代表，进行药代动力学的研究。
(1)实验材料
水飞蓟宾原料药，规格：99％，天津天士力圣特制药有限公司；(Ⅰ-4)和(Ⅰ-8)，纯度95～98％，自行制备。Wistar大鼠(6周龄)9只，体质量300-330g，许可证：SCXK(京)2018-0001，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
(2)实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7um 2.1*100mm流动相：甲醇(A):0.1％甲酸水(B)；流速：0.4mL·min-1；梯度洗脱程序：0～1.5min为10％(v/v)A，1.5～2.5min为10％A～100％A，2.5～2.9min为100％A，2.9～3.3min为100％A～10％A，3.3～4.5min为10％A；进样量：10uL；柱温：40℃。
2.2质谱条件
检测模式为MRM模式，质谱扫描方式进行样品分析，0.1min前经旁路排出不进质谱。SLB-DEA、DHSLB-PIP和内标艾司唑仑采用正离子模式分析，电喷雾电压为4800V，离子化温度为480℃；水飞蓟宾和内标地高辛采用负离子模式检测，电喷雾电压为-4500V；离子化温度为550℃；雾化气与加热气均为氮气，45psi；气帘气压20psi；用于定量分析的离子反应分别是m/z 481.1→m/z 300.1(水飞蓟宾)、m/z 653.0→m/z 580.3(Ⅰ-3)、m/z 675.2→m/z575.1(Ⅰ-8)、m/z 779.3→m/z 649.2(内标地高辛)、m/z 321.5→m/z 152.1(内标艾司唑仑)，碰撞能分别是-27eV、36eV、42eV、-53eV和47eV。使用1.6.2软件采集并处理数据。
2.3血浆样品采集
将9只Wistar大鼠随机分为3组，每组3只，实验前12h禁食不禁水。3组大鼠分别等摩尔灌胃给药水飞蓟宾(50mg·kg-1)、Ⅰ-4(75.1mg·kg-1)、Ⅰ-8(77.3mg·kg-1)。分别于给药前及给药0.083、0.333、0.667、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0h后于眼眶静脉丛取血300uL，置于肝素离心管中，血浆4500r·min-1离心10min，取上层血浆150uL，置于-20℃保存，待测。
2.4血浆样品处理方法
取50uL血浆，正、负谱分别加入内标(艾司唑仑50ng·mL-1、地高辛2ug·mL-1)100uL，加乙酸乙酯3mL，涡旋3min，于4500r·min-1离心10min，取上层有机相，30℃氮气吹干，加入流动相100uL复溶，取10uL进样。
(3)实验数据统计
采用DAS 3.2.6软件，以非房室模型拟合处理平均血药浓度数据，计算各个成分的药动学参数；采用SPSS 17.0计算各成分组间的显著性差异。
(4)氨甲基取代水飞蓟宾衍生物大鼠体内药代动力学参数
表4、氨甲基取代水飞蓟宾衍生物Ⅰ-4和Ⅰ-8在大鼠体内的药代动力学参数
n＝3,.*P<0.05,**P<0.01vs水飞蓟宾组.
取待测血浆样品，按血浆处理方法处理后，按照前期确定的色谱和质谱条件进行测定。结果见表4；结果表明，I-4在大鼠血浆中的Tmax、Cmax、AUC0-8h分别是水飞蓟宾的11％、5.64倍和1.72倍；I-8在大鼠血浆中的Tmax、Cmax、AUC0-8h分别是水飞蓟宾的7.4％、4.11倍和2.60倍，Ⅰ-4和Ⅰ-8在大鼠体内的达峰时间明显缩短，药物暴露量显著增加。利用公式(相对生物利用度＝AUC0-8h衍生物/AUC0-8h原型药物×100％)计算相对生物利用度，Ⅰ-4和Ⅰ-8的相对生物利用度分别为172.5％和259.8％；计算结果表明，与水飞蓟宾相比，Ⅰ-4和Ⅰ-8在大鼠体内的吸收明显增加，口服生物利用度显著提高。
氨甲基取代水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)的化学结构中均含有取代氨基，能够与胃酸中的酸性物质或者其它无机酸、有机酸形成水溶性盐，促进药物在体内的吸收。所以，从代表性化合物Ⅰ-4和Ⅰ-8的药代动力学行为可以推测其他氨甲基取代水飞蓟宾衍生物同样可以改善水飞蓟宾的生物利用度。
以上实验虽然选择化合物I-4和I-8作为代表进行了药代动力学的研究，但这并不能造成对本发明的限制，通过I-4及I-8实验结果可推测出其他氨甲基取代水飞蓟宾衍生物也同样具有相似的药代动力学活性。
试验例3：氨甲基取代水飞蓟宾衍生物药用盐在水溶液中的溶解度
测定方法：取水飞蓟宾和氨甲基取代水飞蓟宾衍生物(Ⅰ-1)～(Ⅰ-9)盐酸盐研成细粉，于25±2℃加入到一定量的纯水中，每隔5分钟强力摇振30秒，观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒，即视为完全溶解。
结果见下表5：
结论：由以上试验可知，水飞蓟宾在水中的溶解度小于0.1g/1000mL，水溶液中不溶；氨甲基取代水飞蓟宾(I-1)～(I-9)盐酸盐在水中的溶解度均大于0.1g/1mL，水溶液中易溶解；所以，氨甲基取代水飞蓟宾衍生物成盐后，(I-1)～(I-9)水溶液中的溶解度比水飞蓟宾提高1000倍。

Claims (10)

1.式(I)所示的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物或其药用盐或溶剂化物：
其中，单元可以为碳碳单键-(CH-CH)-或者碳碳双键-(C＝C)-；其中R1，R2分别独立地选自H、有机仲胺亚甲基，R1，R2不同时为H。
2.权利要求1中所述的式(I)氨甲基取代水飞蓟宾衍生物或其药用盐或溶剂化物，其特征在于，所述的有机仲胺亚甲基选自二甲胺基亚甲基、二乙胺基亚甲基、二丙胺基亚甲基、二丁胺基亚甲基、哌啶亚甲基、吡咯烷亚甲基、吗啉亚甲基、哌嗪亚甲基、4-取代哌嗪亚甲基、4-哌啶醇亚甲基、4-哌啶酮亚甲基、葡甲胺亚甲基、L-脯氨醇亚甲基；
优选所述的有机仲胺亚甲基选自哌啶亚甲基、二乙胺基亚甲基、哌嗪亚甲基、4-哌啶醇亚甲基、L-脯氨醇亚甲基。
3.权利要求2中所述的氨甲基取代水飞蓟宾衍生物或其药用盐或溶剂化物为：
4.权利要求1-3任意一项中所述的式(I)氨甲基取代水飞蓟宾衍生物的制备方法，是分别以水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾为起始原料，与有机仲胺类化合物和甲醛溶液在有机溶剂中经曼尼希氨甲基化反应得到的。
5.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述的有机仲胺类化合物选自二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、哌啶、吡咯烷、吗啉、哌嗪、4-取代哌嗪、4-哌啶醇、4-哌啶酮、葡甲胺、L-脯氨醇。
6.根据权利要求5中所述的制备方法，所述的水飞蓟宾或2,3-脱氢水飞蓟宾，与有机仲胺类化合物的投料比例为1：0.3～1：10.0。
7.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、醋酸；优选为甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和醋酸。
8.根据权利要求1或2中所述的药用盐，其中式(Ⅰ)化合物与硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、酒石酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、甲酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、草酸或琥珀酸形成的盐。
9.所述的式(I)氨甲基取代水飞蓟宾衍生物或其药用盐或溶剂化物在制备用于治疗和/或预防肝脏损伤、非酒精性脂肪肝、乙肝、丙肝、肝纤维化及肝癌等疾病药物中的应用。
10.一种药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1中所述的式(I)化合物或其药用盐或溶剂化物作为活性成分，同时含有药学上可接受的载体或赋形剂；优选药物制剂为片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、口服液或软膏剂的形式，并且所述药物是控释剂型或缓释剂型。
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