CN103450165A

CN103450165A - 一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103450165A
Application number: CN2012101794447A
Authority: CN
Inventors: 刘苏友; 罗志勇; 马大友; 曾江; 黄景嘉; 皮朝琼; 金芳; 刘丽君; 陈湘晖
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-06-04
Also published as: CN103450165B

Abstract

本发明属于新化合物的制备领域，具体提供了一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途，结构如通式Ⅰ所示。其中R₁与R₂分别独立的选自氢，碳原子数1-6的直链或支链的烷基、环烷基或不饱和的烷基；R₁R₂N为吗啡啉基、哌啶基或吡咯基；R₃、R₆、R₇、R₈分别独立地选自氢、碳原子数1-6的饱和或不饱和烷基、酰基；R₄、R₅彼此独立地选自氢、碳原子数为1-6的烷氧基、碳原子数为1-6的烷基、卤素原子、硝基、碳原子数为1-6的卤代烷基、碳原子数1-6的烷基或不饱和烷基、羟基、酰基、胺基、酰氨基、酯基；其中n为0、1、2或3。本发明还提供了2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用。

Description

一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及水飞蓟宾的结构衍生物，特别是涉及在2,3-脱氢水飞蓟宾相关结构母核芳环上引入含氮的氨基侧链和它们的盐，其制备方法及用于抗肿瘤等方面的用途。

背景技术

水飞蓟素 (silymarin) 为菊科草本植物水飞蓟的果实或种子中分离得到的一种黄酮木脂素类化合物，主要由水飞蓟宾 (silibinin, silybin)、异水飞蓟宾 (isosilybin)、水飞蓟宁 (silydianin)和水飞蓟亭 (silychristin) 等7 种化合物组成。在水飞蓟素中，水飞蓟宾含量最高，是主要活性成分。天然的水飞蓟宾是由等量的两种立体异构体水飞蓟宾 A (2R, 3R, 10R, 11R) 和水飞蓟宾B (2R, 3R, 10S, 11S)所组成的混合物。水飞蓟宾有广泛的生物活性，如清除活性氧、抗脂质过氧化作用、预防和治疗心血管疾病、预防脑缺血、抑制前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌等癌症的作用，但水飞蓟宾水溶性差，生物利用度低，致使它在药品领域中的应用受到限制。

水飞蓟宾A 水飞蓟宾B

水飞蓟宾对乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、肝癌等癌症有明显的抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。

在人前列腺癌PC3细胞中，水飞蓟宾在50-100 ug/ml的浓度下能抑制细胞增殖、诱导细胞死亡和引起G1期和G2-M期细胞周期阻滞，呈剂量和时间依赖性（Deep, G. etc Oncogene . 2006, 25(7): 1053–1069）。

水飞蓟宾能有效地抑制肾癌Caki-1细胞生长，呈时间和剂量依赖性。当水飞蓟宾的剂量是50 uM、100 uM和200 uM时，在含有血清的培养基，作用24小时，Caki-1细胞有2-18%的抑制(P < 0.05)；而在不含血清的培养基，作用24h，Caki-1细胞有4-39 %的抑制(P < 0.05) （Li, L. etc Cancer Letters. 2008, 272(1): 61–69）。

水飞蓟宾能有效的抑制胰腺癌AsPC-1, BxPC-3 和Panc-1细胞的增殖，并诱导其凋亡，水飞蓟宾在100 μM的浓度下，处理胰腺癌AsPC-1, BxPC-3 和Panc-1细胞24小时，凋亡的比例分别为13.24 %、7.02 %和6.03 %（Ge, Y.K. etc International Journal of Molecular Sciences. 2011, 12 (8): 4861-4871）。

水飞蓟宾呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞（Hep3B）增殖。与对照组相比，水飞蓟宾作用8小时，在100 μM、250 μM 和500 μM的浓度下，分别抑制25 %、45 %和72 %（García-Maceira, P. etc Oncogene. 2009, 28(3): 313–324）。

水飞蓟宾有多种抗肿瘤机制，分为:（1）抑制肿瘤细胞增殖与诱导其凋亡；在膀胱癌细胞中，水飞蓟宾诱导其凋亡，是由2条线粒体死亡途径所介导的，一条是细胞色素C / caspase-依赖的途径。水飞蓟宾改变线粒体膜电位，导致细胞色素C的释放到细胞液中，然后激活Caspase凋亡蛋白酶，包括caspase-3、caspase-9、caspase-8等。半胱天冬酶是一个半胱氨酸蛋白酶家族,这个家族的所有成员在它们的活性位点均含有半胱氨酸，并且切割靶蛋白也均在特异性的天门冬氨酸位点后，因此称为半胱天冬酶。它们在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。另一条是AIF/ caspase-非依赖的途径。水飞蓟宾诱导AIF从线粒体中释放，然后转移到细胞核中，从而诱导肿瘤细胞凋亡（Zeng, J. etc Molecular Cancer Therapeutics . 2011, 10(1): 104-116）。（2）抑制新生血管形成；与对照组相比，用水飞蓟宾处理人结肠癌（CRC）HT29肿瘤细胞，能减少VEGF-阳性细胞52%(P < 0.001)，因此，水飞蓟宾能明显减少VEGF 的蛋白水平。上调NOS，尤其是iNOS 和 NOS3（内皮NOS），诱导许多生理过程，如血管生成。在人结肠癌（CRC）HT29肿瘤细胞中，用免疫着色定量分析，显示对照组iNOS-阳性细胞为46±2%，水飞蓟宾处理组为14±1%，另外研究发现水飞蓟宾对 NOS1 没有影响，但能显著减少NOS3的蛋白水平。因此，水飞蓟宾抑制新生血管形成也与抑制 iNOS 和 NOS3有关。COX-2与血管生成存在密切关系。用免疫组织化学检查COX-2的表达，定量分析发现对照组COX-2-阳性细胞为45±2%，而水飞蓟宾处理组为22±1%。另外水飞蓟宾处理的肿瘤细胞也能减少COX-1蛋白表达。HIF-1α在肿瘤血管生成中超表达，而水飞蓟宾能明显减少HIF-1α的表达。定量分析发现，对照组HIF-1α-阳性细胞为20±1%，而水飞蓟宾处理的小鼠组为13±1% ，减少了对照组的35%（Singh, R. P. etc Cancer Res. 2008, 68 (6): 2043–2050）。（3）阻滞细胞周期；在晚期结肠癌LoVo细胞中，水飞蓟宾在50 uM、100 uM、200 uM的浓度下，有较多的细胞阻滞在细胞周期的G1期（DMSO处理的对照组为41.5%，而水飞蓟宾处理组为49%-57%）。但水飞蓟宾在较高浓度下，不但能对G1期造成细胞阻滞，也能对G2-M期造成轻微的阻滞（DMSO处理的对照组为14%，而水飞蓟宾处理组为19%）。细胞周期调控的分子分析表明，水飞蓟宾降低细胞周期蛋白(D1, D3, A 和 B1)和细胞周期蛋白依赖性激酶（1，2，4和6）的水平，提高细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（P21和p27）的水平（Kaur , M. etc Molecular Cancer Therapeutics. 2009, 8 (8): 2366-2374）。（4）抑制肿瘤的迁移和侵润；Wu KJ等人研究发现，水飞蓟宾上调细胞角蛋白18，下调波形蛋白和MMP2，从而在形态学上逆转EMT。另外，NF-κB是转录因子家族的一员，是EMT的关键调节者，为促进和维持入侵表型扮演了举足轻重的角色。水飞蓟宾能抑制核因子κB（NF-κ B）p50的迁移，通过上调 IκBα蛋白，然后可能下调两种主要的EMT监管（ZEB1和SLUG转录因子）的表达（Wu ,K.J. etc Oncology Reports. 2010, 23(6): 1545-1552）。

发明内容

针对水飞蓟宾有较好的抗肿瘤活性，且毒性小，本发明对它进行了较深入的研究，合成了一系列新的2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物，该类化合物的活性高于对照物水飞蓟宾；并且该类化合物中的胺基易与酸成盐，其水溶性高于水飞蓟宾。

本发明旨在提供一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物，化合物的结构如通式Ⅰ。

本发明的另一个目的是提供通式Ⅰ化合物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供通式Ⅰ化合物的医药用途。

本发明的技术方案之一是：

一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐，结构如通式Ⅰ所示：

（Ⅰ）

其中，R₁与R₂分别独立的选自氢，碳原子数1-6的直链或支链的烷基、环烷基或不饱和的烷基；或者R₁R₂ N为吗啡啉基、哌啶基或吡咯基；

R₃、R₆、R₇、R₈分别独立地选自氢、碳原子数1-6的饱和或不饱和烷基、酰基；

R₄、R₅彼此独立地选自氢、碳原子数为1-6的烷氧基、碳原子数为1-6的烷基、卤素原子、硝基、碳原子数为1-6的卤代烷基、碳原子数1-6的烷基或不饱和烷基、羟基、酰基、胺基、酰氨基、酯基；其中n为0、1、2或3。

所述药学上可接受的盐是指与无机酸或有机酸形成的盐，其中无机酸或有机酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、三氟醋酸、磷酸、甲磺酸，苯磺酸，草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸或抗坏血酸。

所述R₁与R₂分别独立的优选选自碳原子数1-6的烷基，更优选为甲基或者乙基；或R₁R₂ N优选为吗啡啉基、哌啶基或吡咯基；R₃、R₆、R₇、R₈分别独立优选为氢；R₄和R₅为氢、其中n为0或1。

优选包括但不限于下列化合物：

7-（2-吗啉基）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-哌啶基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-二乙基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-二甲基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（3-吗啉基）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（3-（1-哌啶基））丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾。

本发明的技术方案之二是：

一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，具体步骤为：以取代或未取代的水飞蓟宾为原料，加入卤代烷烃，得到含卤原子的烷氧基侧链化合物，即中间体；然后将中间体和胺反应，得到通式Ⅰ化合物中的2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物。

本发明的具体合成路线如图1所示，其中R_1-8如上所定义：

本发明通式Ⅰ所述化合物第一步中间体1的制备方法是：

（1）将取代或未取代的水飞蓟宾溶于溶剂，加入卤代烷烃，在-10℃到200℃的反应温度下回流搅拌2小时-48小时，反应结束后旋去溶剂，加入水和溶剂萃取1-3次，合并萃取液，加入干燥剂干燥，旋干溶剂得粗产物，经硅胶柱层析分离纯化得到中间体；

（2）将中间体溶于溶剂中，加入胺，在10℃到100℃的搅拌2-15小时，TLC监测反应，反应结束后加入水，有机溶剂萃取1-3次，合并萃取液，加入干燥剂干燥，旋干溶剂得粗产物，经硅胶柱层析分离纯化得到产物；

所述溶剂是指常用的质子性与非质子性溶剂，如乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、氯仿或N,N-二甲基甲酰胺等；所述胺是指二甲胺、二乙胺、三乙胺、吗啡啉、吡咯或哌啶等；干燥剂是指无水硫酸钠或无水氯化钙等。

本发明的技术方案之三是：

本发明的一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用。

所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、骨细胞癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫颈癌、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、肾癌、松果体瘤、成血细胞癌、直肠癌、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、软骨肉瘤、精原细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤或骨肉瘤。

据此，本发明提供的一种新2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物，该类化合物具有活性高、毒性低和水溶性较好的特点。

附图说明

图1是本发明的2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法的具体合成路线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细描述，应理解为，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。本申请中的百分含量均指质量百分含量。

实施例1 ： （中间体的制备）

制备7-（2-溴）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾

7-（2-溴）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾的结构式

将2.41 g (5 mmol)的水飞蓟宾溶于110 ml丙酮中，再加入8.5 ml (100 mmol)的1,2-二溴乙烷和0.345 g (2.5 mmol)的碳酸钾，在45 ℃搅拌反应2 d，TLC监测。反应结束后，停止反应，旋去丙酮，加入100 ml 水，用EA萃取，分别用水和饱和氯化钠洗EA层，分出有机层，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩。硅胶柱分离，得到0.63 g黄色固体，产率21.5%, mp 240.0-242.0℃。结构鉴定数据：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 3.35-3.39 (m, 1H), 3.56-3.58 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.83 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 4.26-4.30 (m, 1H), 4.44 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 4.96 (s, 1H), 4.98 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.37 (br.s, 1H), 6.75-6.90 (m，3H), 7.047(br.s, 1H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.81-7.82 (m, 2H), 9.14 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 12.38 (s, 1H).

实施例2 ：（中间体的制备）

制备7-（3-溴）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾

7-（3-溴）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾的结构式

按实施例1，用1,3-二溴丙烷代替1,2-二溴乙烷，得到黄色固体，产率10.2%, mp 214.0-215.0 ℃。结构鉴定数据：¹H NMR（DMSO-d₆）：δ 2.25-2.29 (m, 2H), 3.35-3.40 (m, 1H), 3.56-3.58 (m, 1H), 3.66 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 4.19 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.25-4.28 (m, 1H), 4.96 (d, 1H), 6.35 (d, 1H), 6.81-6.83 (m, 2H), 6.89 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.05 (br, 1H), 7.12 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.80-7.82 (m, 2H).

实施例3 ：

制备7-（2-吗啉基）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物1）

化合物1结构式

将0.11 g (0.188 mmol)的7-（2-溴）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾溶于4 ml的DMF中，再加入33 mg (0.376 mmol)的吗啡啉，在50 ℃反应12小时，TLC监测。反应结束后，停止反应，室温冷却，加入30 ml水，用EA萃取，分出有机层，有机层依次用水和饱和氯化钠洗，分出有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得到0.11 g黄色固体残渣。硅胶柱分离，得到0.1 g黄色固体，产率90.1%, mp 229.3-232.6 ℃。 ¹H NMR（DMSO-d₆）：δ 2.47 (t, 4H), 2.70 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39-3.42 (m, 1H), 3.56-3.58 (m, 1H), 3.57 (t, 4H), 3.79(s, 3H), 4.19 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.25-4.29 (m, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.98(d, 1H), 6.33 (br.s，1H), 6.81-6.83 (m，2H), 6.88-6.91 (m, 1H), 7.046 (br,1H), 7.11-7.13 (m,1H), 7.81-7.83 (m, 2H). IR (KBr, cm^-1) V _max: 3421.4, 2920.4， 1654.4, 1596.1, 1499.0, 1398.0, 1273.8. EI-MS (m/z): 593 (M⁺).

实施例4 ：

制备7-（2-（1-哌啶基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物2）

化合物2结构式

参照化合物1的合成，用哌啶替代吗啡啉，得到黄色固体，产率84.4% , mp 225℃。 ¹H NMR（DMSO-d₆）：δ 1.33-1.40 (m, 2H), 1.46-1.51 (m, 4H), 2.43 (br，4H), 2.67 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.37-3.39 (m, 1H)，3.55-3.58 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.83 (t, 2H), 4.16 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 4.26-4.30 (m, 1H), 4.96 (d, 1H), 6.32 (d，J = 2 Hz, 1H), 6.81-6.83 (m, 2H), 6.89 (dd, 1H), 7.05 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.80-7.83 (m, 2H).IR (KBr, cm^-1) V _max: 3176.7, 2963.1, 2932.0, 1726.8, 1394.2, 1281.5, 1118.4, 1079.6. EI-MS (m/z): 591 (M⁺).

实施例5 ：

制备7-（2-（1-二乙基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物3）

化合物3结构式

参照化合物1的合成，用二乙胺替代吗啡啉，得到黄色泡状固体，产率47.3%, mp 170 ℃。 ¹H NMR（DMSO-d₆）：δ 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 2.53-2.57 (m, 4H), 2.80 (br, 2H), 3.37-3.40 (m, 1H), 3.55-3.60 (m, 1H), 4.11(t, 2H), 4.25-4.30 (m, 1H), 4.96 (d, 1H) , 6.30 (d, J = 2 Hz, 1H), 6.80-6.84 (m, 2H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.06 (br.s, 1H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.81-7.84 (m, 2H). IR (KBr, cm^-1)V _max: 3423.9, 3161.6, 2961.4, 2916.5, 2844.0, 1653.1, 1594.4, 1501.2, 1456.3, 1401.1, 1269.9, 1166.3, 1031.7, 817.7. EI-MS (m/z): 579 (M⁺).

实施例6 ：

制备 7-（2-（1-二甲基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物4）

化合物4结构式

参照化合物1的合成，用二甲胺替代吗啡啉，得到黄色固体，产率36.4%, mp 223.9-225.5 ℃。 ¹H NMR (DMSO-d₆)：δ 2.25 (s, 6H), 2.68 (t, 2H), 3.37-3.40 (m, 1H), 3.55-3.60 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 4.15 (t, 2H), 4.25-4.30 (m, 1H), 4.96 (d, 1H), 6.30 (d, J = 2 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 2 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.89-6.92 (m, 1H), 7.06 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.12-7.14 (m, 1H), 7.81-7.84 (m, 2H). IR (KBr, cm^-1) V _max: 3448.5, 3165.0, 2924.3, 1654.4, 1596.1, 1499.0, 1398.1, 1273.8, 1168.9, 1029.1. ESI-MS (m/z): 552 (M⁺+1).

实施例7 ：

制备7-（3-吗啉基）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物5）

化合物5结构式

参照化合物1的合成，用7-（3-溴）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾替代7-（2-溴）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾，得到黄色固体，产率64%, mp 120.0-121.0℃。 ¹H NMR（DMSO-d₆）：δ 1.89 (m, 2H), 2.36-2.41 (m, 6H), 3.35-3.40 (m, 1H) , 3.56-3.58 (m, 5H) 3.80 (s, 3H), 4.11 (t, 2H), 4.25-4.28 (m, 1H), 4.96 (d, 1H), 6.32 (s, 1H), 6.80-6.83 (m, 2H), 6.90 (d, J = 8 Hz,1H), 7.05 (br.s, 1H), 7.13 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.80-7.83 (m, 2H).IR (KBr, cm^-1) V _max: 3445.8, 3151.5, 1656.7, 1499.6, 1399.2, 1268.8, 1161.8, 1111.6, 1031.4. ESI-MS (m/z): 608 (M⁺+1).

实施例8 ：

制备 7-（3-（1-哌啶基））丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾（化合物6）

化合物6结构式

参照化合物1的合成，用7-（3-溴）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾替代7-（2-溴）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾，并用哌啶替代吗啡啉，得到黄色油状物，产率59.8%。 ¹H NMR （DMSO-d₆）：δ 1.47 (br, 2H), 1.66 (br, 4H), 2.07 (br, 2H), 2.84 (br, 6H), 3.35-3.40 (m, 1H) , 3.56-3.58 (m, 1H), 3.80(s, 3H), 4.13(t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.25-4.29 (m, 1H), 4.96 (d, J=8 Hz, 1H), 5.04 (s, 1H), 6.32 (d, J = 2 Hz, 1H), 6.79-6.90 (m, 3H), 7.05 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.80-7.83 (m, 2H). IR (KBr, cm^-1) V _max: 3451.1, 3163.1, 2920.4, 2845.9, 1648.5, 1509.4, 1399.4, 1269.9, 1163.1. ESI-MS (m/z): 606 (M⁺+1).

实施例9 ：

化合物抗肿瘤活性测试

1. 胰酶消化对数期MCF-7细胞、人类前列腺癌DU-145细胞和人支气管上皮细胞HBE，终止后离心收集，制成细胞悬液。

2. 接种细胞：根据细胞增长速率以每孔100 μL体积设置好细胞密度，接种96孔板，设置4个复孔，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜，DMSO终浓度< 0.1％）。待细胞贴壁后即可加药，一般1-5个梯度，每孔100 μL，设3-5个复孔。

3. 培养细胞：在37℃、5％ CO₂的饱和湿度下，培养48 h。

4. 显色：每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h后弃去孔内培养液，每孔加入100 μL DMSO，于脱色摇床上振荡10 min, 使结晶物充分融解。

5. 比色：选490 nm波长，校正波长630 nm，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度，将各复孔OD值取平均值，计算细胞成活率和抑制率。

成活率 = 药物组OD值取平均值/对照组OD值取平均值×100%

抑制率 = 100%－成活率

6、测试结果见表1-3：表1为抗人类乳腺癌MCF-7增殖活性测试结果，化合物3和化合物6等显示了很强的活性，在10μM溶度下，其抑制活性分别高达92%和96%，高于对照物水飞蓟宾（在100μM溶度下，抑制率仅为59%）。抗人类前列腺癌DU-145增殖活性测试结果见表2，化合物3和化合物6显示了很好的活性。在10μM溶度下，其抑制活性分别高达96%和98%。表3为对人支气管上皮细胞株（HBE）的抑制率，在10μM溶度下，抑制率仅分别为56%和25%，比较发现，本发明化合物在肿瘤细胞株和正常细胞株（HBE）之间有较好的选择性。

另外，化合物3和化合物6的盐酸盐在水中的溶剂度大于500mg/L。

表1 本发明通式Ⅰ所示化合物结构和在不同浓度下对人类乳腺癌MCF-7细胞株的抑制率

注: -表示未测

表2 本发明通式Ⅰ所示化合物结构和在不同浓度下对人类前列腺癌DU-145细胞株的抑制率

表3本发明通式Ⅰ所示化合物结构和在不同浓度下对人支气管上皮细胞株（HBE）的抑制率

注: -表示未测

Claims

1.一种2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐，结构如通式Ⅰ所示：

Figure 2012101794447100001DEST_PATH_IMAGE001

（Ⅰ）

R₄、R₅彼此独立地选自氢、碳原子数为1-6的烷氧基、碳原子数为1-6的烷基、卤素原子、硝基、碳原子数为1-6的卤代烷基、碳原子数1-6的烷基或不饱和烷基、羟基、酰基、胺基、酰氨基、酯基；其中n为0、1、2或3；

2.根据权利要求1所示2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R₁与R₂分别独立的选自碳原子数1-6的烷基；或R₁R₂ N为吗啡啉基、哌啶基或吡咯基；R₃、R₆、R₇、R₈分别独立选自氢；R₄和R₅为氢、其中n为0或1。

3.根据权利要求1所示2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐，包括下列化合物：

7-（2-吗啉基）乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-哌啶基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-二乙基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（2-（1-二甲基胺基））乙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（3-吗啉基）丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾；

7-（3-（1-哌啶基））丙氧基-2,3-脱氢水飞蓟宾。

4.权利要求1-3之一所述2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，具体步骤为：以取代或未取代的水飞蓟宾为原料，加入二卤代烷烃，得到含卤原子的烷氧基侧链化合物，即中间体；然后将中间体和胺反应，得到通式Ⅰ化合物中的2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物。

5.根据权利要求4所述2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）将取代或未取代的水飞蓟宾溶于溶剂，加入卤代烷烃，在-10℃到200℃的反应温度下搅拌2小时-48h，反应结束后，旋去溶剂，加入水，有机溶剂萃取1-3次，合并萃取液，加入干燥剂干燥，旋干溶剂得粗产物，经硅胶柱层析分离纯化得到中间体；

所述溶剂是指常用的质子性与非质子性溶剂，如乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、氯仿或N,N-二甲基甲酰胺；所述胺是指二甲胺、二乙胺、三乙胺、吗啡啉、吡咯或哌啶；干燥剂是指无水硫酸钠或无水氯化钙。

6.权利要求1-3之一所述2,3-脱氢水飞蓟宾衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、骨细胞癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫颈癌、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、肾癌、松果体瘤、成血细胞癌、直肠癌、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、软骨肉瘤、精原细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤或骨肉瘤。