CN110292534A - 一种载活性美容多肽丝素蛋白/ha复合微囊冻干方晶制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶,包含0‑5重量%的活性美容多肽、10‑50重量%的丝素蛋白、10‑20重量%的透明质酸、1‑15重量%的原花青素,5‑30重量%的冻干保护剂,余量为去离子水。本发明还公开了该复合微球冻干方晶制备方法:先将活性美容多肽包裹入丝素蛋白微囊,再用透明质酸修饰,原花青素交联,辅以冻干保护剂,通过预冷、预冻、升华干燥与解析干燥的过程,得到载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶。本发明复合微囊的独特结构能延缓活性美容多肽的释放,提高其生物活性和稳定性,解决多肽难被皮肤吸收问题;同时,制备的冻干粉可自发形成具“方晶状”结构的空间聚集体,该结构将复合微囊包载后,可提高其复水性。
Description
技术领域
本发明属于美容抗衰老化妆品领域,具体涉及一种载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶组合物及制备方法。
背景技术
近年来随着我国经济的快速发展和生活水平的提高,人们对于美容和抗衰老的需求呈爆发式增长。在皮肤的自然老化和护理过程中,生物活性美容多肽起着重要的作用,如细胞增殖、细胞迁移、血管发生、色素形成和蛋白质合成及调控等。各种活性美容多肽除了具备自身的功能外,相互之间还可以产生促进作用,所以,复合活性美容多肽在医疗和化妆品等行业具有重要作用。对于生物活性美容多肽,容易受到温度、酸碱的影响,造成不同程度的变形,影响其纯度及活性,因此在化妆品应用中受到了一定的限制。
微囊是指把分散的固体物质、液体或气体包封在生物相容性的半透膜内形成的球形微囊。通过微囊技术的应用可提高活性美容多肽稳定性。丝素蛋白是一种纤维状蛋白,由20种氨基酸组成,具有良好的生物相容性,优异的力学性能,可加工性强,是制备微囊的理想膜材。但单一丝素蛋白作为膜材料的力学性能和抗水性差,易降解,包载在微囊中的活性美容成分容易突释。
透明质酸(HA)作为三维网络的主要成分与其它蛋白、糖胺聚糖甚至生长因子相互结合,同时通过控制水的平衡,流动阻力、影响渗透压和蛋白的选择性吸附。透明质酸的高粘弹性可提丝素蛋白的机械性能,具有良好的生物相容性和生物降解性。利用丝素蛋白和透明质酸共混制备微囊,最大程度地模仿了细胞外基质的蛋白和多糖结构组成,他们分别发挥各自的特性,共同调节细胞的增殖、分化、迁移和凋亡,维持组织的正常结构和功能。
为维持微囊结构力学性能,选用生物安全性高的原花青素作为交联剂。同时,原花青素可以清除自由基,防止胶原蛋白过度交联结合,抑制胶原酶活性,减少皱纹产生,延缓皮肤衰老,有效避免材料交联带来的副作用。
发明内容
本发明的技术方案提供了一种载活性美容多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶,可提高活性美容多肽的生物活性和稳定性,能够在冷藏或者常温下保存较长时间,解决了单一丝素蛋白作为膜材料微囊的力学性能差、抗水性低,易降解和突释的问题,同时形成的具“方晶状”结构空间聚集体稳定性好,能够在冷藏或者常温下保存较长时间;同时可增强复合微囊复水性,溶解迅速;而且成型性好,无塌陷,不皱缩。
本发明所述目的是由以下技术方案实现的。
一种载活性美容多肽的丝素蛋白/HA复合微囊,包括以下重量百分比的各组分:0-5重量%的活性美容多肽、10-50重量%的丝素蛋白、10-20重量%的透明质酸、0.5-5重量%原花青素,5-30重量%的冻干保护剂,余量为去离子水。
进一步地,其中所述活性美容多肽为aFGF、bFGF或EGF中的一种或多种
进一步地,其中所述冻干保护剂为海藻糖、甘露醇、甘氨酸、右旋糖酐、精氨酸中的一种或多种;
所述载活性美容多肽的丝素蛋白/HA复合微囊的制备方法包括以下步骤:
(1)单组份微囊制备:在搅拌条件下,向丝素蛋白、活性美容多肽原料液中滴加蛋白不良溶剂,其中蛋白不良剂与所述原料液的体积比为1∶5-10;-20℃冷冻后转移至室温解冻,离心,除上清,收集固体部分进行低压真空干燥,即得到载活性美容多肽的单组分微囊。
(2)复合微囊制备:将步骤(1)中获得的单组分微囊加入到透明质酸溶液中,混合均匀,边搅拌边滴加原花青素醇溶液交联,超声5min,过0.45um微孔滤膜,离心后水洗,即得原花青素交丝素蛋白/HA复合微囊悬液。
(3)复合微囊冻干方晶制备:向步骤(2)中获得的复合微囊溶液中加入冻干保护剂,依次通过预冷、预冻、升华干燥和解析干燥处理,自发形成具“方晶状”结构空间聚集体,冲入惰性气体保护,获得载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶。
优选的,步骤(1)所述蛋白不良溶剂为甲醇或乙醇;
优选的,步骤(2)中原花青素溶液与所述透明质酸钠溶液的体积比为1∶2~5;
优选的,步骤(2)中原花青素溶液含无水乙醇,其中无水乙醇的含量为10~50%;
优选的,步骤(2)中原花青素溶液中原花青素的含量为2~15%;
优选的,步骤(2)所述丝素蛋白/HA复合微囊的粒径小于450nm;
优选的,步骤(3)所述预冷温度的目标温度4℃±1℃,时长1-2小时;
所述预冻温度的目标温度为-20±2℃,时长为8-10小时;
所述升华干燥以每小时升温不超过1.0℃,调节冷冻干燥室温度缓慢升至0.0℃,真空条件下保持25-30小时;
所述解析干燥的目标温度为20-35℃,升温速率为3-10℃/h,时长3-5小时;
所述惰性气体为氮气、氦气或氩气中的一种或多种。
本发明利用丝素蛋白和透明质酸共混制备复合微囊,最大程度地模仿了细胞外基质的蛋白和多糖结构组成,选用高生物安全性的原花青素作为交联剂,避免交联引起组织钙化的副作用;通过微囊包裹技术将有效的活性成份传递到细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,加速皮肤修复,有效抚平细纹,延缓皮肤老化。同时,通过对复合微囊溶液冻干工艺的调整,形成具“方晶状”结构的空间聚集体的冻干方晶,具有稳定性良好,能够在冷藏或者常温下保存较长时间,成型性好,无塌陷,复溶性良好,溶解迅速,不皱缩等优点。
为了便于本领域的技术人员更好地理解本发明,以下将结合具体的实施例和附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1丝素蛋白-HA复合微囊成囊过程示意图
图2为载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶外观图片
图3为皮肤弹性系数值图
图4为载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶抗衰功效评价VISIA面部成像图。其中(A)为使用实施例2的产品前VISIA图像;(B)为使用实施例2的产品1周后VISIA图像;(C)为使用实施例2的产品2周后VISIA图像;(D)为使用实施例2的产品3周后VISIA图像;(E)为使用实施例2的产品4周后VISIA图像。
具体实施方式
下面的实施例用来说明本发明技术解决方案,并不是想限制本发明的范围。
实施例1含aFGF的丝素蛋白/HA复合微囊的制备
(1)取10g丝素蛋白粉完全溶解于50ml水中,加入0.05g aFGF混合均匀,形成原料液。在搅拌条件下,慢慢滴加10ml的无水乙醇,放置于-20℃冰箱内冷冻后再转移至室温解冻,高速离心5min,收集固体部分进行真空干燥,即得载活性美容多肽丝素蛋白单组分微囊。
(2)配制10%透明质酸钠溶液,加入(1)中所述单组分微囊,混合均匀;同时将原花青素溶于50%(v/v)无水乙醇溶液中,配制成1.0%(w/v)原花青素溶液。边搅拌边滴加原花青素溶液交联,超声5min,过0.45um微孔滤膜,离心后水洗,即得原花青素交联的载aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊。
实施例2载aEGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶制备
将实时例1中制备的含aFGF的丝素蛋白/HA复合微囊、甘露醇和海藻糖溶解于去离子水中,其中含甘露醇浓度为10%(w/v),海藻糖浓度为1%(w/v),进行灌装与半加塞,开启冷冻干燥机,在4℃±1℃温度条件下,维持4h;降温至-20℃以下,保持冷冻干燥室温度-20±2℃,产品预冻8h;开始抽真空,当真空度达到10Pa以下,进行升温;调节冷冻干燥室温度缓慢升至0.0℃,每小时升温不超过1.0℃,真空条件下保持28个小时;继续调节冷冻干燥室温度,以5℃/h的速率升温至35℃,保温3个小时。通入氮气、氦气或氩气,调节冷冻干燥室内为常压后压内塞,取出钆盖,即得载aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶(如图1)。
实施例3
对实施2所得载aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶进行检测,结果见表1:
表1 aFGF活性多肽生物微晶冻干粉检测结果
实施例4
对实施2所得载aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶进行体外释放测试
aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶(测试样)的对照品配方与实施例2一致,制备方法是按1℃/min的降温速率,降温至-70℃后保持2h,之后在不控温条件下进行真空干燥,获得对照品冻干粉。将所述测试样和对照品中加入溶媒进行复溶,具体结果见表2。
表2测试样和对照品复溶时间对比(n=3)
结果表明,通过对制备的复合微囊冻干方晶冻干工艺的调整,可以增加其复溶性,溶解迅速。
实施例5
对包载aFGF活性多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶进行抗衰功效评价50位年龄在25~40岁符合条件受试者,签订知情同意书,测试期间志愿者通过面部涂抹试用产品。
使用方法:将实施例2制备的载aFGF的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶用纯水复溶得后到混悬液,每天早晚各涂一次,连续使用4周。
测试项目:皮肤弹性测试、皮肤皱纹测试
测试时间:从第一天开始,之后每隔一周进行一次皮肤测试。
测试方法:测试前,被评估者清洁皮肤后,在21±1℃、相对湿度50%±10%环境下稳定至少30分钟。
皮肤弹性测试采用德国CK Cutometer dual MPA580型皮肤弹性测试仪,把探头垂直轻轻接触待测试皮肤区域,以探头顶端弹簧全部缩进为宜,开始测试,直至测试循环时间结束后方可把探头挪开,并盖上探头盖。邻近肌肤取3点测试,最后核算取R2(皮肤弹性参数,越接近于1,皮肤弹性越好)的平均值:
R2=Ua/Uf
Ua——从取消负压到下一次连续测试皮肤表面再加负压时皮肤的恢复值。
Uf——有负压时的皮肤最大拉伸量
利用VISIA皮肤分析仪对每位试用者的左、右面颊和前正面进行检测,检测皱纹、纹理和毛孔生理指标,检测仪自动生成特征值及绝对分值作为分折标准。绝对分值代表了出现在选定区域的皮肤特征检测值的面积和强度。采用SPSS19.0软件对研究数据进行统计分析。数据以均数±标准差表示,计量资料采用配对t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
测试结果:
产品试用四周后的皮肤弹性测试结果如图2:由图可知,与初始值相比,使用1周后,皮肤弹性参数R2开始略微升高,第3周增加明显,第4周趋于稳定。由此,可以得出,通过面部涂抹实施例2复合微囊冻干方晶,可以增加皮肤弹性。
VISIA皮肤检测仪测试皮肤皱纹状况如图3,应用实施例2冻干方晶后面部皮肤状态得到明显改善,表现为细腻度增加,皱纹减少,主观感受皮肤饱满。
上述变化在应用2周后略有现象,应用4周后更加明显,具体结果见表3。
表3载aFGF丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶作用前后VISIA数值结果
因此,功效实验结果表明,通过使用载aFGF丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶可以有效增加皮肤弹性,减少皱纹,增加皮肤细腻度,达到一定抗衰老作用。
以上为对本发明实施例的描述,所涉及的组分和工艺参数数值在上述实施例中不可能全部体现,需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域专业技术人员可以在不脱离本发明的精神范围或范围的情况下,做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、本发明各原料的等同替换、具体方式选择等,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶,其特征在于,所述复合微囊冻干方晶包括以下重量百分比的各组分:0-5重量%的活性美容多肽、10-50重量%的丝素蛋白、10-20重量%的透明质酸、0.5-5重量%原花青素,5-30重量%的冻干保护剂,余量为去离子水。
其中所述活性美容多肽为aFGF、bFGF或EGF中的一种或多种;
所述冻干保护剂海藻糖、甘露醇、甘氨酸、右旋糖酐、精氨酸中的一种或多种。
2.一种载活性美容多肽的丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶的制备方法,包括以下步骤:
(1)单组分微囊制备:在搅拌条件下,向丝素蛋白、活性美容多肽原料液中滴加蛋白不良溶剂,蛋白不良溶剂与所述原料液的体积比为1∶5-10;-20℃冷冻后转移至室温解冻,离心,除上清,收集固体部分进行低压真空干燥,即得到载活性美容多肽的单组份微囊。
(2)复合微囊制备:将步骤(1)中获得的单组分微囊加入到透明质酸溶液中,混合均匀,边搅拌边滴加原花青素溶液交联,超声5min,过0.45um微孔滤膜,离心后水洗,即得原花青素交丝素蛋白/HA复合微囊。
(3)复合微囊冻干方晶制备:向步骤(2)中获得的复合微囊溶液中加入冻干保护剂,依次通过预冷、预冻、升华干燥和解析干燥处理,自发形成具“方晶状”结构空间聚集体,冲入惰性气体保护,获得载活性美容多肽丝素蛋白/HA复合微囊冻干方晶。
3.根据权利要求2所述,其特征在于步骤(1)所述蛋白不良溶剂为甲醇或乙醇中的一种或两种。
4.根据权利要求2所述,其特征在于步骤(2)中原花青素溶液与所述透明质酸钠溶液的体积比为1∶2~5。
5.根据权利要求2所述,其特征在于步骤(2)中原花青素溶液含无水乙醇,其中无水乙醇的含量为10~50%。
6.根据权利要求2所述,其特征在于步骤(2)中原花青素溶液中原花青素的含量为2~15%。
7.根据权利要求2所述,其特征在于步骤(2)所述丝素蛋白/HA复合微囊的粒径小于450nm。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤(3):
所述预冷温度的目标温度4℃±1℃,时长1-2小时;
所述预冻温度的目标温度为-20±2℃,时长为8-10小时;
所述升华干燥以每小时升温不超过1.0℃,调节冷冻干燥室温度缓慢升至0.0℃,真空条件下保持25-30小时;
所述解析干燥的目标温度为20-35℃,升温速率为3-10℃/h,时长3-5小时;
所述惰性气体为氮气、氦气或氩气中的一种或多种。
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