CN110291106A - 抗体表位 - Google Patents

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D·J·莱特伍德
R·J·曼罗
J·P·奥康奈尔
J·R·波特
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UCB Pharma SA
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Abstract

已经证明某些化合物结合TNF并稳定化结合TNF受体的三聚体TNF的构象。公开了选择性结合这些化合物与TNF超家族成员的复合物的抗体。这些抗体可用于检测具有相同活性的其他化合物，以及作为靶标接合与生物标志物。

Description

抗体表位
发明领域
本发明涉及抗体，特别是识别特定表位的抗体，其可用于筛选TNFα的小分子调控剂。本发明涉及选择性结合这种TNFα小分子调控剂复合物的抗体，以及这些抗体的用途。本发明还涉及使用所述抗体鉴定新的TNFα的调控剂的测定法。
发明背景
肿瘤坏死因子(TNF)超家族是共同享有调节细胞存活和细胞死亡的主要功能的蛋白质家族。TNF超家族的成员共同享有的共同的核心基序，其由形成“果冻卷”β结构的两个具有反平行β-链的反平行β-折叠片组成。TNF超家族成员共有的另一个共同享有特征是形成同源或异源三聚体复合物。正是这些三聚体形式的TNF超家族成员结合并激活特定的TNF超家族受体。
TNFα是TNF超家族的原型成员。TNFα产生的调节异常与许多具有重要医学意义的病理状况有关。例如，TNFα与类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病)、牛皮癣、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、疼痛、癫痫、骨质疏松症、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)有关。TNF超家族的其他成员也涉及病理状况，包括自身免疫疾病。
TNF超家族成员的常规拮抗剂是大分子的并且通过抑制TNF超家族成员与其受体的结合而起作用。常规拮抗剂的实例包括抗TNFα抗体，特别是单克隆抗体，例如英夫利昔单抗阿达木单抗和赛妥珠单抗或可溶性TNFα受体融合蛋白，例如依那西普
发明概述
本发明人已经鉴定了调控TNFα的小分子实体(SME)类别。这些化合物通过结合同源三聚体形式的TNFα，并诱导和/或稳定化TNFα同源三聚体中的构象变化而起作用。例如，结合有化合物的TNFα的同源三聚体可以结合TNFα受体，但是不太能或不能启动TNFα受体下游的信号传导。这些化合物可用于治疗由TNFα介导的病况。
本发明人已经开发了选择性结合包含这些化合物和TNFα的复合物的抗体。这些抗体可用于鉴定能够以这种方式抑制TNFα的其他化合物，并且还可以用作靶标接合生物标志物。
因此，本发明提供了结合包含三聚体TNFα的至少以下残基的表位的抗体：
(a)Y115；
(b)Q149；和
(c)N137或K98或两者兼有；
其中Y115和Q149存在于三聚体TNFα的C链上，并且N137和K98存在于三聚体TNFα的A链上，并且其中残基编号是根据SEQ ID NO：36。
本发明还提供：
-与如上定义的抗体竞争结合TNFα的抗体。
-编码本发明抗体的分离的多核苷酸。
-本发明的抗体用于通过疗法治疗人体或动物体的方法。
-药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的辅剂和/或载体。
-本发明的抗体作为靶标接合生物标记物的用途，用于检测从受试者获得的样品中的化合物-三聚体复合物；其中所述抗体是可检测的并且所述复合物包含三聚体TNFα和能够结合三聚体TNFα的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导。
-检测化合物与三聚体TNFα的靶标接合的方法，由此化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，所述方法包括：
(a)从施用所述化合物的受试者获得样品；
(b)使本发明的抗体与所述样品和对照样品接触，其中所述抗体是可检测的；
(c)确定所述可检测抗体与所述样品和所述对照样品的结合量，
其中所述可检测抗体与所述样品的结合大于所述可检测抗体与所述对照样品的结合表明所述化合物与所述三聚体TNFα的靶标接合。
-本发明的抗体在筛选引发TNFα三聚体中构象变化的化合物中的用途，其中所述构象变化调控必需受体对三聚体TNFα结合的信号传导。
-包含TNFα三聚体和与其结合的化合物的复合物，其中所述化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中所述复合物以1nM或更小的KD-ab结合本发明的抗体。
-能够结合TNFα三聚体以形成复合物的化合物，其中化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中化合物-三聚体复合物以1nM或更小的KD-ab结合本发明的抗体。
-鉴定能够结合TNFα三聚体并调控三聚体通过必需受体的信号传导的化合物的方法，包括以下步骤：
(a)进行结合测定法以测量包含TNFα三聚体和测试化合物的测试化合物-三聚体复合物与选择性结合所述复合物的本发明抗体的结合亲和力；
(b)比较步骤(a)中测量的结合亲和力和已知以高亲和力结合步骤(a)中提到的抗体的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力；和
(c)如果根据步骤(b)中提到的比较考虑其测量的结合亲和力是可接受的，则选择步骤(a)的化合物-三聚体复合物中存在的化合物。
附图简要说明
图1突出显示了人TNFα的晶体结构上的残基N168、I194、F220和A221。
图2显示了使用CA185_01974 mFab和化合物(1)的HPLC实验的结果。对应于过量Fab的峰出现在1.5倍和2.0倍过量。因此确定化学计量为1Fab:1TNFα三聚体。
图3显示了使用CA185_01979 mFab和化合物(1)的HPLC实验的结果。同样，对应于过量Fab的峰出现在1.5倍和2.0倍过量。因此，也确定化学计量为1Fab:1TNFα三聚体。
图4显示了使用市售抗TNFα多克隆抗体的化合物(3)、(4)和(5)的总TNFαELISA的结果。
图5显示了具有CA185_01974.0和化合物(3)、(4)和(5)的构象特异性TNFαELISA的结果。在该测定法中，Apo TNFα没有给出信号，证明了抗体CA185_01974与化合物结合的TNFα的结合的特异性性质。
图6显示了用1和10μg/ml的CA185_01974和CA185_01979染色的FACS直方图。这些图表明抗体仅识别已与化合物(1)预孵育的TNFα。DMSO对照没有染色。
图7显示了对于亲本NS0细胞系和过表达膜TNFα的工程化改造的NS0细胞系用CA185_01974染色的FACS直方图。将细胞与化合物(1)或DMSO一起孵育，并用抗体Fab片段染色。同样，结果表明DMSO对照(亲本或工程化改造的细胞系)没有染色。然而，在化合物(1)存在的情况下，观察到工程化改造的细胞系的染色。
图8显示了使用食蟹猴TNFα测定CA185_01974的亲和力值的传感图。对照(上图)含有食蟹猴TNFα和DMSO。然后下图显示与化合物(4)复合的食蟹猴TNFα的重复实验。
图9显示了使用人TNFα测定CA185_01974的亲和力值的传感图。对照(上图)含有人TNFα和DMSO。然后下图显示与化合物(4)复合的人TNFα的重复实验。
图10显示了化合物(1)-(7)的结构。
图11显示了与人TNFα不对称三聚体、化合物(2)和2种人TNFR1受体的复合物结合的Fab1974的结构。
图12显示了与图11相同的结构，但是在计算上模拟了对称的三聚体(即没有化合物)。使用这种对称三聚体，三聚体的A链保留与Fab片段的相互作用。然而，Fab片段和三聚体的C链之间存在空间冲突。
图13显示了具有CA185_1974的TNFα三聚体的A和C链上的实验确定的表位为球体。
图14显示了CA185_1974代表用于测量复杂生物基质中靶标占据的合适试剂。使用CA185_1974作为捕获试剂，以使用商业抗TNFα抗体作为检测试剂，使用高灵敏度ELISA来测量与化合物(2)复合的TNFα。将与过量化合物或DMSO预孵育的TNFα掺入纯人血浆(耗竭或内源性TNFα)中并稀释至多种浓度。TNFα-小分子抑制剂复合物产生的信号明显与TNFα掺入浓度成比例增加。在测试的任何TNFα掺入浓度下，没有显著检测到用DMSO(apo-TNF)预孵育的TNFα。在25pg/ml及以上的TNFα浓度，TNFα-小分子复合物信号以至少为0.999的概率显著高于apo-TNFα背景。
图15显示了化合物(1)结合直接固定化的人TNFα(a)或通过用CA185_1974捕获的人TNFα(b)的单循环动力学。当通过构象选择性抗体CA1974捕获时，动力学从直接固定化的apo-TNF的“缓慢结合-缓慢解离”变为“快速结合-快速解离”。
序列表概述
SEQ ID NO：1显示CA185_01974.0的LCDR1。
SEQ ID NO：2显示CA185_01974.0的LCDR2。
SEQ ID NO：3显示CA185_01974.0的LCDR3。
SEQ ID NO：4显示CA185_01974.0的HCDR1。
SEQ ID NO：5显示CA185_01974.0的HCDR2。
SEQ ID NO：6显示CA185_01974.0的HCDR3。
SEQ ID NO：7显示CA185_01974.0的LCVR的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8显示CA185_01974.0的HCVR的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示CA185_01974.0的LCVR的DNA序列。
SEQ ID NO：10显示CA185_01974.0的HCVR的DNA序列。
SEQ ID NO：11显示CA185_01974.0的κ轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12显示CA185_01974.0的mIgG1重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13显示CA185_01974.0的mFab(无铰链)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14显示CA185_01974.0的κ轻链的DNA序列。
SEQ ID NO：15显示CA185_01974.0的mIgG1重链的DNA序列。
SEQ ID NO：16显示CA185_01974.0的mFab(无铰链)重链的DNA序列。
SEQ ID NO：17显示CA185_01979.0的LCDR2。
SEQ ID NO：18显示CA185_01979.0的LCDR3。
SEQ ID NO：19显示CA185_01979.0的HCDR1。
SEQ ID NO：20显示CA185_01979.0的HCDR2。
SEQ ID NO：21显示CA185_01979.0的HCDR3。
SEQ ID NO：22显示CA185_01979.0的LCVR的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23显示CA185_01979.0的HCVR的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24显示CA185_01979.0的LCVR的DNA序列。
SEQ ID NO：25显示CA185_01979.0的HCVR的DNA序列。
SEQ ID NO：26显示CA185_01979.0的κ轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27显示CA185_01979.0的mIgG1重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28显示CA185_01979.0的mFab(无铰链)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29显示CA185_01979.0的κ轻链的DNA序列。
SEQ ID NO：30显示CA185_01979.0的mIgG1重链的DNA序列。
SEQ ID NO：31显示CA185_01979.0的mFab(无铰链)重链的DNA序列。
SEQ ID NO：32显示大鼠TNFα的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33显示小鼠TNFα的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34显示人TNFα的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35显示可溶形式的人TNFα的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36显示可溶形式的人TNFα的氨基酸序列，但没有起始“S”(其为SEQ IDNO：35中的克隆假象)。
SEQ ID NO：37显示具有N54D和C182S突变的人TNFR1的细胞外结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38显示SEQ ID NO：37的氨基酸序列，但没有起始“G”，其是克隆假象。
发明详述
TNF超家族成员的调控剂
已经鉴定了结合三聚体形式的TNF超家族成员的测试化合物。以下公开内容一般涉及这些化合物与任何TNF超家族成员的结合。本发明的一个实施方案特别涉及这些化合物与TNFα的结合。
测试化合物是小分子实体(SME)，其分子量为1000Da或更小、750Da或更小、或600Da或更小。分子量可以为约50-约1000Da或约100-约1000Da。这些化合物稳定化三聚体TNF超家族成员的构象，所述成员结合必需TNF超家族受体并调控受体的信号传导。此类化合物的实例包括式(1)-(7)的化合物。
化合物对三聚体形式的TNF超家族成员的稳定化作用可以通过测量在化合物存在和不存在的情况下三聚体的热转变中点(Tm)来量化。Tm表示当50％的生物分子解折叠时的温度。稳定化TNF超家族成员三聚体的化合物将增加三聚体的Tm。Tm可以使用本领域已知的任何适当技术确定，例如使用差示扫描量热法(DSC)或荧光探测热变性测定法。
化合物可以结合在TNF超家族成员三聚体内存在的中心空间(即三聚体的核心)内。
这些化合物可使TNF超家族成员转变为TNF超家族受体拮抗剂。因此，这些化合物能够阻断TNF超家族成员信号传导，而不必与TNF超家族成员和其受体之间的高亲和力相互作用竞争。
备选地，所述化合物可稳定化三聚体TNF超家族成员的构象，所述成员结合必需TNF超家族受体并增强受体的信号传导。因此，这些化合物能够增加TNF超家族成员信号传导，而不必与TNF超家族成员和其受体之间的高亲和力相互作用竞争。
在本文中将化合物描述为拮抗剂时，应理解化合物同样可以是激动剂并通过结合TNF超家族成员三聚体和这种激动剂化合物的复合物TNF受体超家族受体来增加信号传导。类似地，当其他公开内容涉及拮抗化合物、鉴定此类化合物的方法和此类化合物的用途时，本公开内容可同等地指代激动剂化合物。
本文所述的化合物是变构调控剂，其结合TNF超家族受体的天然激动剂，即结合三聚体形式的TNF超家族成员，并驱使这些三聚体采用仍结合必需TNF超家族受体并通过受体调控信号传导的构象。通过调控，可以理解该化合物可具有拮抗作用，并因此可减少通过TNF超家族受体的信号传导，或者刺激作用，并因此增加或增强TNF超家族受体的信号传导。
这些化合物可以将天然TNF超家族成员激动剂转化为拮抗剂。相反，常规TNF超家族成员拮抗剂结合TNF超家族成员或TNF超家族受体，并阻止TNF超家族成员与必需受体的结合。备选地，与在化合物不存在的情况下TNF超家族成员结合时，通过TNF超家族受体的信号传导水平相比，化合物可以增加当TNF超家族成员结合时，通过TNF超家族受体的信号传导。因此，化合物可以将天然TNF超家族成员激动剂转化为所谓的“超激动剂”。因此，化合物也可称为配体活性的变构调控剂(AMLA)。
化合物的化学式或结构不受限制，只要它们结合至少一个TNF超家族成员并稳定化三聚体TNF超家族成员的构象，所述成员结合必需TNF超家族受体并调控TNF超家族受体的信号传导。因此，可以使用本文描述的抗体和方法鉴定化合物。非限制性实例是可包含苯并咪唑部分或其等排体(isostere)的化合物。
与在化合物不存在的情况下TNF超家族成员与必需受体的结合亲和力相比，化合物可以增加TNF超家族成员(以化合物-三聚体复合物的形式)与必需受体的结合亲和力。
化合物结合三聚体形式的TNF超家族成员。这些化合物可以特异性地(或选择性地)结合一种或多种TNF超家族成员的三聚体形式。化合物可以特异性地(或选择性地)结合TNF超家族成员中的仅一种，但不结合任何其他TNF超家族成员。化合物还可以特异性结合两种、三种、四种或多至所有的TNF超家族成员。通过特异性(或选择性)，可以理解化合物结合目标分子，在这种情况下三聚体形式的TNF超家族成员，与任何其他分子(可能包括TNF超家族的其他成员)没有显著的交叉反应性。可以通过任何合适的方法评估交叉反应性，例如表面等离子体共振。如果化合物结合另一分子的强度是其结合目标三聚体形式的TNF超家族成员的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，则认为化合物对于三聚体形式的TNF超家族成员与该三聚体形式的特定TNF超家族成员以外的分子的交叉反应性是显著的。例如，如果化合物结合另一分子的强度是其结合目标三聚体形式的TNF超家族成员的约5％-约100％，通常约20％-约100％，或约50％-约100％，则其交叉反应性认为是显著的。对三聚体形式的TNF超家族成员具有特异性(或选择性)的化合物可以以其结合三聚体形式的TNF超家族成员的强度的小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％结合另一种分子(低至零结合)。化合物可以以其结合三聚体形式的TNF超家族成员的强度的小于约20％，小于约15％，小于约10％或小于约5％，小于约2％或小于约1％结合另一种分子(低至零结合)。
测试化合物结合TNF超家族成员结合的速率在本文中称为“结合”速率或kon-c，并且测试化合物与TNF超家族成员解离的率在本文中称为“解离”速率或koff-c。如本文所用，符号“KD-c”表示测试化合物对于TNF超家族成员的结合亲和力(解离常数)。KD-c定义为koff-c/kon-c。测试化合物可具有缓慢的“结合”速率，其可通过TNF超家族成员的质谱分析和化合物-三聚体复合物峰强度在几分钟内测量。通过在不同的TNF超家族成员:化合物-三聚体复合物比例下重复该测量，可以估计测试化合物的KD-c值。作为非限制性实例，化合物与TNF超家族三聚体的结合可以通过快速“结合”速率表征，约107M-1s-1，具有缓慢的“解离”速率，例如10-3s-1、10-4s-1的值，或无可测量的“解离”速率。
如本文所用，符号“kon-r”表示化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体时的速率(“结合”速率)。如本文所用，符号“koff-r”表示化合物-三聚体复合物与TNF超家族受体解离的速率(“解离”速率)。如本文所用，符号“KD-r”表示化合物-三聚体复合物对于超家族受体的结合亲和力(解离常数)。KD-r定义为koff-r/kon-r。
在测试化合物存在下(即以化合物-三聚体复合物的形式)，TNF超家族成员对于结合其受体的KD-r值可以是在测试化合物不存在的情况下TNF超家族成员对于结合其受体的KD-r值的低至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。对于结合TNF超家族成员的化合物-三聚体复合物的KD-r值可以是在测试化合物不存在的情况下TNF超家族三聚体结合TNF超家族受体的KD-r值降低至少约1.5倍，或至少约3倍，或至少约4倍，即化合物-三聚体复合物对于TNF超家族受体的结合亲和力与在测试化合物不存在的情况下TNF超家族三聚体与TNF超家族受体的结合亲和力相比较，可以增加为至少约1.5倍、至少约3倍、至少约4倍。
本文所述的化合物可以增加TNF超家族成员与其受体的结合亲和力为与在化合物不存在的情况下TNF超家族成员与其受体的结合亲和力相比的约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
结合亲和力可以以结合亲和力(KD-r)给出，并且可以以任何合适的单位给出，例如μM、nM或pM。KD-r值越小，TNF超家族成员与其受体的结合亲和力越大。
在化合物存在的情况下TNF化合物超家族成员对于结合受体的KD-r值可以是在测试化合物不存在的情况下TNF超家族成员对于结合其受体的KD-r值的低至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。
与TNF超家族三聚体单独结合TNF超家族受体的KD-r值相比，化合物-三聚体复合物对于结合TNF超家族受体的KD-r值的降低可能是由于与单独的TNF超家族三聚体相比，化合物-三聚体复合物结合TNF超家族三聚体的结合速率(kon-r)增加，和/或与单独的TNF超家族三聚体相比，解离速率(koff-r)降低。与单独的TNF超家族三聚体相比，化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的结合速率(kon-r)通常增加。与单独的TNF超家族三聚体相比，化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的解离速率(koff-r)通常降低。最合适的是，与单独的TNF超家族三聚体相比，化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的结合速率(kon-r)增加，并且化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的解离速率(koff-r)降低。与在化合物不存在的情况下TNF超家族三聚体结合其受体的kon-r值相比，化合物-三聚体复合物对必需TNF超家族受体的kon-r值可以增加至少约1.5倍或至少约2倍或至少约3倍，和/或与在化合物不存在的情况下TNF超家族三聚体结合其受体的koff-r值相比，化合物-三聚体复合物对所需TNF超家族受体的koff-r值可以减少至少约1.2倍，至少约1.6倍，至少约2倍，更合适地至少约2.4倍。
化合物结合TNF超家族三聚体的结合速率(kon-c)通常快于化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的结合速率(kon-r)。化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的解离速率(koff-r)通常也快于化合物结合TNF超家族三聚体的解离速率(koff-c)。在本发明的一个实施方案中，化合物结合TNF超家族三聚体的结合速率(kon-c)快于化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的结合速率(kon-r)，并且化合物-三聚体复合物结合TNF超家族受体的解离速率(koff-r)快于化合物结合TNF超家族三聚体的解离速率(koff-c)。化合物对于结合TNF超家族三聚体的KD-c值通常低于化合物-三聚体复合物对于结合TNF超家族受体的KD-r值，即化合物对三聚体的亲和力高于化合物-三聚体复合物对于受体的亲和力。
化合物-三聚体复合物和TNF超家族三聚体对必需TNF超家族受体的kon-r、koff-r和KD-r值可以使用任何适当的技术测定，例如表面等离子共振、质谱和等温量热法。在测试化合物存在下TNF受体超家族成员对于结合其受体的KD-r值可以是1μM、100nM、10nM、5nM、1nM、100pM、10pM或更小(至更低的值约1pM)。在测试化合物存在下(即以化合物-三聚体复合物)TNF超家族成员对于结合其受体的KD-r值可以是1nM或更小。化合物-三聚体复合物对于结合必需TNF超家族受体的KD-r值可以小于600pM、小于500pM、小于400pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM或小于50pM(再次低至更低的值约1pM)。化合物-三聚体复合物对于结合必需TNF超家族受体的KD-r值可以小于约200pM(至约1pM)。
化合物可通过测定法鉴定，包括测定TNF超家族成员和化合物的样品中三聚体形式的TNF超家族成员的KD-r；比较样品中三聚体形式的TNF超家族成员与对照样品的KD-r；并选择一种化合物。对照可以是阳性对照，已知其可以增加TNF超家族成员与其受体的结合亲和力。这里，测试化合物可具有等于或小于(优于)阳性对照的KD-r。
化合物稳定化三聚体形式的TNF超家族成员。如果与对于在测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员和去稳定剂的样品观察到的三聚体的量相比，测试化合物增加三聚体的比例，认为发生稳定化。与在测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员和去稳定剂的样品中存在的三聚体的量相比，测试化合物可使三聚体的量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。
与对于在去稳定剂和测试化合物不存在的情况下TNF超家族成员的样品观察到的相比，测试化合物还可以增加三聚体的量。与在去稳定剂和测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员的样品中存在的三聚体的量相比，测试化合物可使三聚体的量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。
与在测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员的样品中与其受体结合的TNF超家族成员的量相比，测试化合物可以使与其受体结合的TNF超家族成员的量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。
测试化合物可以增强三聚体形式的TNF超家族成员的稳定性。如果与对于在测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员和去稳定剂的样品观察到的三聚体形式的TNF超家族成员的Tm相比，测试化合物增加三聚体形式的TNF超家族成员的热转变中点(Tm)，则认为发生三聚体形式的TNF超家族成员的增强稳定性。三聚体形式的TNF超家族成员的Tm是50％生物分子解折叠的温度。在测试化合物的存在和/或不存在情况下，三聚体形式的TNF超家族成员的Tm可以使用本领域已知的任何适当技术测量，例如使用差示扫描量热法(DSC)或荧光探测热变性测定法。
与在测试化合物不存在的情况下含有TNF超家族成员的样品中三聚体形式的TNF超家族成员的Tm相比，测试化合物可使三聚体形式的TNF三聚体成员的Tm增加至少1℃，至少2℃，至少5℃，至少10℃，至少15℃，至少20℃或更多。测试化合物可使三聚体形式的TNF三聚体成员的Tm增加至少1℃，至少10℃和10℃至20℃。
当化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员结合受体时，化合物可以完全地或部分地抑制通过TNF受体的信号传导。化合物可以减少通过TNF超家族受体的信号传导至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。备选地，当化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员结合受体时，化合物可以增加通过TNF受体的信号传导。化合物可以增加通过TNF超家族受体的信号传导至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％。信号传导水平的任何变化可以通过任何适当的技术测量，包括但不限于通过碱性磷酸酶或荧光素酶测量报告基因活性、使用诸如CellomicsArrayscan的机制的NF-κB易位、下游效应子的磷酸化、信号传导分子的募集或细胞死亡。
当化合物-三聚体复合物形式的TNF超家族成员结合受体时，化合物可调控通过TNF受体的信号传导的至少一种下游作用。本文讨论了这些作用，包括TNF超家族诱导的IL-8、IL17A/F、IL2和VCAM生产，TNF超家族诱导的NF-κB活化和中性粒细胞募集。本领域已知用于测量TNF超家族成员的下游作用的标准技术。化合物可调控通过TNF受体的信号传导的至少1、2、3、4、5、10或多至所有下游作用。
化合物的活性可使用标准术语量化，例如IC50或半数最大有效浓度(EC50)值。IC50值表示50％抑制特定生物或生物化学功能所需的化合物浓度。EC50值表示其最大作用的50％所需的化合物浓度。化合物的IC50或EC50值可以为500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM、100pM或更小(低至更低的值约10pM或1pM)。可以使用任何合适的技术测量IC50和EC50值，例如可以使用ELISA定量细胞因子生产。然后可以使用标准的4-参数逻辑模型(也称为S形剂量响应模型)生成IC50和EC50值。
如上所述，能够结合TNF并调控信号传导的化合物的实例是式(1)-(7)的化合物。
调控剂-TNF超家族成员复合物
本发明的一个实施方案鉴定了本文所述化合物与三聚体形式的TNF超家族成员的结合导致TNF超家族三聚体的构象变化。在另一个实施方案中，TNF超家族成员三聚体在被本文公开的化合物结合时呈现变形或扭曲的构象。
例如，当化合物(1)-(7)与人TNFα的可溶性结构域结合时，TNF保留其三聚体结构，但A和C亚基彼此远离并且C旋转以在这些亚基之间产生裂缝。
不受理论束缚，据信在化合物不存在的情况下，三聚体TNF超家族成员(包括三聚体TNFα)能够结合三个单独的二聚体TNF超家族成员受体。每个二聚体TNF超家族成员受体能够结合两个单独的TNF超家族三聚体。这导致多个TNF超家族成员三聚体和TNF超家族成员受体二聚体的聚集，产生启动下游信号传导的信号传导。
当三聚体TNFα与化合物结合时，所得复合物的构象发生变形。因此，不受理论束缚，据信在本文公开的化合物存在下，三聚体TNF超家族成员，包括三聚体TNFα，仅能够结合两个单独的二聚体TNF超家族成员受体。事实上，只有两个而不是三个单独的二聚体TNF超家族成员受体结合三聚体TNF超家族成员，这减少或抑制了多个TNF超家族成员三聚体和TNF超家族成员受体二聚体的聚集。这减少或抑制信号传导筏的形成，并从而减少或抑制下游信号传导。
由于本文公开的化合物的结合，本发明的抗体可以用于检测具有扭曲构象的TNFα。通常，具有扭曲或变形构象的TNFα是三聚体TNFα。然而，本发明的抗体也可以结合其他形式的TNFα。例如，本发明的抗体可以结合TNFα单体。
TNFα通常是三聚体TNFα，可以是TNFαs(或三聚体TNFαs)。
因此，本发明提供了包含TNFα三聚体和与其结合的化合物的复合物，其中化合物-三聚体复合物结合必需TNFα受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中所述复合物结合本发明的抗体，其亲和力至少为1nM(即1nM或更小，低至约1pM)。TNF超家族成员通常是TNFα。
此外，抗体通常以相对于对于在TNFα三聚体不存在下结合化合物和/或在化合物不存在的情况下结合TNFα三聚体的亲和力，至少低约100倍(亲和力提高至少约100倍)，低约200倍的亲和力结合复合物。
本发明进一步提供了能够结合TNFα三聚体以形成复合物的化合物，其中化合物-三聚体复合物结合必需TNFα受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中化合物-三聚体复合物结合本发明的抗体，其KD-ab为1nM或更小(低至约1pM)。TNFα通常是TNFαs。
抗体可以以相对于在TNFα三聚体不存在的情况下结合化合物和/或在化合物不存在的情况下结合TNFα三聚体的亲和力，至少低约100倍(亲和力提高至少约100倍)、低约200倍的亲和力结合复合物。
化合物-三聚体复合物可以结合本发明的任何抗体。
本文描述的化合物或复合物可以用于治疗和/或预防病理状况。因此，提供了本发明的化合物或复合物，其用于在人体或动物体上实施的治疗方法。本发明还提供了治疗方法，包括向受试者施用本发明的化合物或复合物。本发明的化合物或复合物可以用于本文所述的任何治疗适应症和/或药物组合物中。
抗体
本发明提供了选择性结合包含至少一种本文公开的化合物和TNFα三聚体的至少一种化合物-三聚体复合物的抗体。
通常，相对于在TNFα不存在的情况下抗体与化合物的结合，或在化合物不存在的情况下与TNFα的结合，或与(不同的)化合物-(三聚体)配合物的结合，测量本发明的抗体与化合物-(三聚体)复合物的选择性结合。
化合物可以是本文所述的任何化合物，包括化合物(1)-(7)(或其盐或溶剂化物)。TNF超家族成员是TNFα。滴定TNFα可以是人TNFα，特别是可溶性TNFα(TNFαS)。TNFαS可以具有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的序列(其缺少来自SEQ ID NO：35的N-末端“S”)或可以是其变体。此类变体通常与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36保持至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性(或甚至约96％、97％、98％或99％的同一性)。换句话说，此类变体可与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36保持约60％-约99％的同一性，与SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：36保持约80％-约99％的同一性，与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有约90％-约99％的同一性，与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有约95％-约99％的同一性。在下文中进一步描述变体。
本发明的抗体还可以结合其他形式的TNFα。为了示例说明，本申请的实施例证明CA185_0179抗体结合三聚体TNFα。然而，如图1所示(在化合物(1)存在下结合TNFα单体的CA185_0179抗体的晶体结构)，抗体似乎也结合单体TNFα。不受理论束缚，在化合物存在下，认为TNF的可溶性结构域保留其三聚体结构。然而，A和C亚基彼此远离(并且C亚基旋转)以在这两个亚基之间产生裂缝。因此，尽管本发明的抗体结合扭曲的三聚体，但如果三聚体结构被迫分开成单体，抗体也可能仍然结合。(请参见下文有关“A”和“C”亚基的进一步讨论。)
本文提及的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，间插有称为框架区(FR)的更保守的区域。
抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并通常是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合抗体、CDR-移植抗体、纳米抗体、人或人源化抗体或者其任何抗原结合部分。为了生产单克隆和多克隆抗体，实验动物通常是非人哺乳动物，例如山羊、兔、大鼠或小鼠，但抗体也可以在其他物种中产生。
多克隆抗体可以通过常规方法产生，例如用目标抗原免疫合适的动物。随后可以从动物中取出血液并纯化IgG级分。
可以获得针对本发明的化合物-三聚体复合物产生的抗体，其中需要免疫动物，通过将多肽施用于动物，例如非人动物，使用众所周知的常规方案，参见例如Handbook ofExperimental Immunology，D.M.Weir(ed.)，Vol 4，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England，1986)。可以免疫许多温血动物，如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein，1975，Nature，256:495-497)，三体瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today，4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)。
本发明的抗体也可以使用单一淋巴细胞抗体方法产生，通过克隆和表达由选择用于生产特定抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA，通过例如Babcook，J.etal.,1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377描述的方法。
本发明的抗体也可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生，并且包括如下公开的那些：Brinkman et al.(J.Immunol.Methods，1995,182:41-50)，Ames et al.(J.Immunol.Methods，1995,184:177-186)，Kettleborough et al.(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958)，Persic et al.(Gene，1997 187 9-18)，Burton et al.(Advances inImmunology，1994,57:191-280)和WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5750753；5821047；5,571,698；5,427,908；5516637；5780225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
完全人抗体是这样的抗体，其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在的话)都是人来源的，或者与人源序列基本上相同，但不一定来自相同的抗体。完全人抗体的实例可以包括例如通过上述噬菌体展示方法生产的抗体和由小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变区和任选的恒定区基因已经被它们的人类对应物替代。如在EP 0546073、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、EP0438474和EP 0463151中描述的。
备选地，根据本发明的抗体可以通过以下方法产生，包括：用免疫原免疫非人哺乳动物，所述免疫原包含三聚体TNFα和本文公开的化合物的化合物-三聚体复合物；从所述哺乳动物中获得抗体制备物；由此衍生选择性识别所述复合物的单克隆抗体，并针对在仅化合物存在的情况下结合TNFα的单克隆抗体筛选单克隆抗体群。
本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或者其片段或抗原结合部分。术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留选择性结合抗原的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。抗体及其片段和抗原结合部分可以是但不限于Fab，修饰的Fab，Fab'，修饰的Fab'，F(ab')2，Fv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，二、三或四价抗体，Bis-scFv，双抗体，三抗体，四抗体和任何上述的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3)，209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域熟知的(参见例如Verma et al.，1998，Journal ofImmunological Methods，216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的Fab和Fab'片段以及国际专利申请WO2009/040562中描述的Fab-dAb片段。多价抗体可以包含多特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853和WO 05/113605)。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如果存在，本发明的抗体分子的恒定区结构域可以考虑所提出的抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。备选地，当抗体分子用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可以使用IgG2和IgG4同种型。
可以通过重组方法制备、表达、产生或分离本发明的抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)分离的抗体，其是对于目的免疫球蛋白基因的转基因的或转染色体的或者由其制备的杂交瘤，(b)从被转化以表达目的抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如来自转染瘤，(c)从重组、组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
这种人抗体可以是人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物的B细胞，例如转基因小鼠，其具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
可通过体外免疫人淋巴细胞，然后用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞来制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”意指CDR-移植的抗体分子，其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上。可以在人类框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用，术语“CDR-移植的抗体分子”是指抗体分子，其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如小鼠或大鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(如果需要，包括一个或多个修饰的CDR)，其移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中。关于综述，参见Vaughan et al，Nature Biotechnology，16,535-539,1998。在一个实施方案中，而不是转移整个CDR，仅来自上文描述的任何一个CDR的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架(参见例如，Kashmiri et al，2005，Methods，36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自上文所述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文所述的每个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。
当移植CDR或特异性决定残基时，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，考虑衍生CDR的供体抗体的类别/类型，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。合适地，根据本发明的CDR-移植的抗体具有包含人受体框架区以及一种或多种上述CDR或特异性决定残基的可变结构域。因此，在一个实施方案中提供了中和CDR-移植的抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
可用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat etal.，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，EU、LAY和POM可用于重链和轻链。备选地，可以使用人种系序列；这些可在例如http://www.vbase2.org/获得(参见Retteret al.，Nucl.Acids Res.(2005)33(补充1)，D671-D674)。
在本发明的CDR-移植的抗体中，受体重链和轻链不一定需要衍生自相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
而且，在本发明的CDR-移植抗体中，框架区不需要具有与受体抗体完全相同的序列。例如，对于该受体链类别或类型，异常残基可以改变为更频繁发生的残基。备选地，可以改变受体框架区中的选定残基，使得它们对应于在供体抗体中相同位置发现的残基(参见Reichmann et al.，1998，Nature，332,323-324)。应将这些变化保持在恢复供体抗体亲和力所需的最少的水平。在WO 91/09967中阐述了用于在受体框架区中选择可能需要改变的残基的方案。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用而丧失羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)(如Harris，RJ.Journal ofChromatography 705:129-134,1995中所述)。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域并且抗体轻链包含CL结构域，κ或λ。
生物分子(例如抗体或片段)含有酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子以净正电荷或负电荷。总“观察”的电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或表面不携带净电荷的pH。在一个实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有至少7的等电点(pI)。在一个实施方案中，抗体或片段具有至少8，例如8.5、8.6、8.7、8.8或9的等电点。在一个实施方案中，抗体的pI是8。程序，例如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(参见Walker，TheProteomics Protocols Handbook，Humana Press(2005)，571-607)可以用于预测抗体或片段的等电点。
与本文公开的表位结合的抗体可以包含SEQ ID NO：4至6的至少一个、至少两个或所有三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)。这些是实施例的CA185_01974抗体的HCDR1/HCDR2/HCDR3序列。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：4至6的CDR(即，抗体不包含SEQ ID NO：4-6中的任何一个或全部的CDR)。
此外，此类抗体可包含SEQ ID NO：1至3的至少一个、至少两个或所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。这些是实施例的CA185_01974抗体的LCDR1/LCDR2/LCDR3序列。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：1至3的CDR(即，抗体不包含SEQ ID NO：1至3中的任何一个或全部的CDR)。
抗体至少包含SEQ ID NO：6的HCDR3序列。在一个实施方案中，抗体包含选自SEQID NO：4至6的至少一个重链CDR序列和选自SEQ ID NO：1至3的至少一个轻链CDR序列。抗体可以包含选自SEQ ID NOS：4至6的至少两个重链CDR序列和选自SEQ ID NO：1至3的至少两个轻链CDR序列。抗体包含SEQ ID NO：4至6的全部三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)和SEQ ID NO：1至3的所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。抗体可以是嵌合、人或人源化抗体。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：1至6中的任何一个或全部的CDR。
抗体还可以包含SEQ ID NO：19至21的至少一个、至少两个或所有三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)。这些是实施例的CA185_01979抗体的HCDR1/HCDR2/HCDR3序列。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：19至21的CDR(即SEQ ID NO：19-21中任一个或全部的CDR)。
抗体包含SEQ ID NO：21的HCDR3序列。
抗体还可以包含SEQ ID NO：1、17、18的至少一个、至少两个或所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。这些是实施例的CA185_01979抗体的LCDR1/LCDR2/LCDR3序列。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：1、17或18的CDR(即SEQ ID NO：1、17或18中的任一个或全部的CDR)。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含选自SEQ ID NO：19至21的至少一个重链CDR序列和选自SEQ ID NO：1、17、18的至少一个轻链CDR序列。抗体可以包含选自SEQ IDNOS：19至21的至少两个重链CDR序列和选自SEQ ID NOS：1、17、18的至少两个轻链CDR序列。抗体可以包含SEQ ID NO：19至21的所有三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)和SEQ ID NO：1、17、18的所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。抗体可以是嵌合、人或人源化抗体。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：1、17、18、19、20或21中的任何一个或全部的CDR。
抗体可以包含CA185_01974抗体和CA185_01979抗体的CDR序列的任何组合。特别地，抗体可以包含选自SEQ ID NO：4-6和19-21的至少一个HCDR序列和/或选自SEQ ID NO：1-3、17和18的至少一个LCDR序列。
抗体可包含：
-选自SEQ ID NO：4和19的HCDR1；和/或
-选自SEQ ID NO：5和20的HCDR2；和/或
-选自SEQ ID NO：6和21的HCDR3；和/或
-SEQ ID NO：1的LCDR1；和/或
-选自SEQ ID NO：2和17的LCDR2；和/或
-选自SEQ ID NO：3和18的LCDR3。
在一些情况下，抗体不包含以下序列中的任何一个的CDR：SEQ ID NO：1至6和17-21。
抗体可以包含SEQ ID NO：8的重链可变区(HCVR)序列(CA185_01974的HCVR)。抗体可以包含SEQ ID NO：7的轻链可变区(LCVR)序列(CA185_01974的LCVR)。抗体适当地包含SEQ ID NO：8的重链可变区序列和SEQ ID NO：7的轻链可变区序列。
在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：8的HCVR和/或SEQ ID NO：7的LCVR。
抗体还可以包含SEQ ID NO：23的重链可变区(HCVR)序列(CA185_01979的HCVR)。抗体可以包含SEQ ID NO：22的轻链可变区(LCVR)序列(CA185_01979的LCVR)。抗体适当地包含SEQ ID NO：23的重链可变区序列和SEQ ID NO：22的轻链可变区序列。在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：23的HCVR和/或SEQ ID NO：22的LCVR。
抗体可以包含来自CA185_01974和CA185_01979抗体的重链和轻链可变区的组合。换句话说，抗体可以包含SEQ ID NO：8或23的重链可变区和/或SEQ ID NO：7或22的轻链可变区。
在一些情况下，抗体不包含SEQ ID NO：8或23的重链可变区和/或SEQ ID NO：7或22的轻链可变区。
抗体可以包含SEQ ID NO：12(CA185_01974 mIgG1)或13(CA185_01974mFab(无铰链))的重链(H链)序列。抗体可以包含SEQ ID NO：11的轻链(L链)序列(CA185_01974κ轻链)。抗体可以包含SEQ ID NO：12/13的重链序列和SEQ ID NO：11的轻链序列。抗体可以是嵌合、人或人源化抗体。在一些情况下，抗体不包含这些序列的重链和/或轻链。
抗体可以包含SEQ ID NO：27(CA185_01979 mIgG1)或28(CA185_01979mFab(无铰链))的重链序列。抗体可以包含SEQ ID NO：26的轻链序列(CA185_01979κ轻链)。抗体包含SEQ ID NO：27/28的重链序列和SEQ ID NO：26的轻链序列。抗体可以是嵌合、人或人源化抗体。同样，可以组合来自CA185_01974和CA185_01979的序列。在一些情况下，抗体不包含这些序列的重链和/或轻链。
备选地，抗体可以是或可以包含上述特定序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。
变体抗体可以包含来自上文讨论的特定序列的1、2、3、4、5、多至10、多至20或更多(通常多至50个)氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可以包括缺失单个氨基酸，缺失一小组的氨基酸，例如2、3、4或5个氨基酸，或缺失较大的氨基酸区域，例如缺失特定的氨基酸结构域或其他特征。“取代”变体通常涉及用相同数量的氨基酸取代一个或多个氨基酸并进行保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸，另一种酸性氨基酸，另一种中性氨基酸，另一种带电荷的氨基酸，另一种亲水性氨基酸，另一种疏水性氨基酸，另一种极性氨基酸，另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：
Ala 脂肪族，疏水性，中性 Met 疏水，中性
Cys 极性，疏水，中性 Asn 极性，亲水性，中性
Asp 极性，亲水，带电(-) Pro 疏水，中性
Glu 极性，亲水，带电(-) Gln 极性，亲水性，中性
Phe 芳香，疏水，中性 Arg 极性，亲水，带电(+)
Gly 脂肪，中性 Ser 极性，亲水性，中性
His 芳香，极性，亲水，带电(+) Thr 极性，亲水性，中性
Ile 脂肪族，疏水性，中性 Val 脂肪族，疏水性，中性
Lys 极性，亲水，带电(+) Trp 芳香，疏水，中性
Leu 脂肪族，疏水性，中性 Tyr 芳香，极性，疏水
“衍生物”或“变体”通常包括其中代替天然存在的氨基酸是出现在是其结构类似物的序列中氨基酸的那些。序列中使用的氨基酸也可以衍生化的或修饰的，例如，标记的，只要抗体的功能不会受到显著的不利影响。
如上所述的衍生物和变体可以在抗体合成期间或通过生产后修饰来制备，或者当抗体是重组形式时使用已知的定点诱变、随机诱变或核酸的酶促切割和/或连接的技术制备。
变体抗体可以具有与本文公开的氨基酸序列(特别是HCVR/LCVR序列和H链和L链序列)大于约60％，或大于约70％，例如75％或80％，大于约85％，例如大于约90或95％的氨基酸同一性的氨基酸序列。此外，抗体可以是与本文公开的HCVR/LCVR序列和H链和L链序列具有大于约60％，或大于约70％，例如75％或80％，大于约85％，例如大于约90或95％的氨基酸同一性，同时保留对于这些序列公开的确切CDR的变体。变体可以与本文公开的HCVR/LCVR序列和H链和L链序列保持至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性(在某些情况下只保留CDR)。在一些情况下，抗体不是与本文所述的任何序列具有大于60、70、75、80、85、90或95％同一性的变体(即抗体与本文所述的HCVR/LCVR序列和H链和L链序列不具有60、70、75、80、85、90或95％的同一性)。
变体保留约60％-约99％的同一性、约80％-约99％的同一性、约90％-约99％的同一性或约95％-约99％的同一性。在相关的SEQ ID NO序列的整个长度上或在序列的一部分上可以看到这种水平的氨基酸同一性，例如跨越约20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸，取决于全长多肽的大小。
关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson et al.，1994，同上)评估时,具有所述值的序列，使用以下参数：
成对比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，缺口延伸罚分：0.10；
多重比对参数–矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，延迟的同一性％：30，罚分末端缺口：开，缺口分开距离：0，负矩阵：无，缺口延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：开，亲水性缺口罚分：开，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性旨在包括简单衍生化的相同残基。
因此提供了具有维持这些链的功能或活性的特定序列和变体的抗体。
本发明还提供了编码本发明抗体分子的重链和/或轻链可变区的分离的DNA序列。
SEQ ID NO：10的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：8的重链可变区。SEQ ID NO：9的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：7的轻链可变区。
SEQ ID NO：25的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：23的重链可变区。SEQ ID NO：24的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：22的轻链可变区。
本发明还提供了编码本发明任何抗体分子的重链和/或轻链的分离的DNA序列。合适地，DNA序列编码本发明抗体分子的重链或轻链。
SEQ ID NO：15或16的分离的DNA序列分别编码SEQ ID NO：12和13的重链。SEQ IDNO：14的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：11的轻链。
SEQ ID NO：30或31的分离的DNA序列分别编码SEQ ID NO：27和28的重链。SEQ IDNO：29的分离的DNA序列编码SEQ ID NO：26的轻链。
备选地，合适的多核苷酸序列可以是这些特定多核苷酸序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述核酸序列的取代、缺失或添加变体。变体多核苷酸可以包含在序列表中给出的序列中的1、2、3、4、5、多至10、多至20、多至30、多至40、多至50、多至75或更多个核酸取代和/或缺失。通常，变体具有1-20、1-50、1-75或1-100个取代和/或缺失。
合适的变体与本文公开的任何一种核酸序列的多核苷酸可以是至少约70％同源的，通常与其至少约80或90％和至少约95％、97％或99％同源。变体可以保留至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体保留约60％-约99％的同一性、约80％-约99％的同一性、约90％-约99％的同一性或约95％-约99％的同一性。这些水平的同源性和同一性通常至少相对于多核苷酸的编码区存在。测量同源性的方法是本领域熟知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，基于核酸同一性计算同源性。这种同源性可以存在于至少约15，至少约30，例如至少约40、60、100、200或更多个连续核苷酸(取决于长度)的区域上。这种同源性可以存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度上。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性(例如，在其默认设置下使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul，S,F et al(1990)J Mol Biol215:403-10。
用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域单词得分阈值(Altschul et al，同上)。这些初始邻域字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的HSP。只要可以增加累积比对分数，单词命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。当以下情况时，停止每个方向上的字命中的扩展：由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积比对评分变为零或更小；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用11的字长(W)、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，通常小于约0.1，合适地小于约0.01，并且最合适地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。例如，最小和概率可以在约1-约0.001，通常约0.01-约0.001的范围内。
同源物可以与相关多核苷酸中的序列相差小于约3、5、10、15、20或更多个突变(每个突变可以是取代、缺失或插入)。例如，同源物可以相差3-50个突变，通常是3-20个突变。可以在同源物的至少30个，例如至少约40、60或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。
在一个实施方案中，由于遗传密码的冗余，变体序列可以与序列表中给出的特定序列不同。DNA代码具有4个主要核酸残基(A、T、C和G)，并使用它们“拼写”三字母密码子，其代表生物体基因中所编码蛋白质的氨基酸。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译成由这些基因编码的蛋白质中的氨基酸的线性序列。代码是高度简并的，其中61个密码子编码20个天然氨基酸，3个密码子代表“终止”信号。因此，大多数氨基酸由多于一个密码子编码——实际上几个氨基酸由四个或更多个不同密码子编码。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但由于使用不同的密码子编码相同的氨基酸，因此可以具有不同的核酸序列。
本发明的DNA序列可以包含合成DNA，例如通过化学处理、cDNA、基因组DNA或其任何组合产生。
编码本发明抗体分子的DNA序列可通过本领域技术人员熟知的方法获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列可以根据需要从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成。
可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”，1999，F.M.Ausubel(ed)，WileyInterscience，New York和Maniatis Manual，由Cold Spring Harbor Publishing出版。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含编码本发明抗体的一种或多种DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明抗体分子的DNA序列。可以使用细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和其他微生物系统，或者可以使用真核生物，例如也可以使用哺乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了根据本发明的抗体分子的生产方法，包括在适于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，并分离抗体分子。
如本文所述的筛选方法可以用于鉴定能够结合化合物-三聚体复合物的合适抗体。因此，可以进行本文所述的筛选方法以测试目的抗体。
可以通过例如标准ELISA或蛋白质印迹对于结合化合物-三聚体复合物来测试本发明的抗体。ELISA测定法也可用于筛选与靶蛋白显示阳性反应的杂交瘤。抗体的结合选择性还可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。因此，本发明的筛选方法可以包括通过进行ELISA或蛋白质印迹或者通过流式细胞术鉴定能够结合化合物-三聚体复合物的抗体的步骤。
本发明的抗体选择性地(或特异性地)识别TNFα三聚体-化合物复合物，即三聚体-化合物复合物内的表位。抗体或其它化合物其以优先的或高亲和力结合对该蛋白质具有选择性的蛋白质，但基本上不结合其他蛋白质或以低亲和力结合时，抗体或其它化合物“选择性地结合”或“选择性地识别”蛋白质。本发明的抗体对于靶向三聚体-化合物复合物的选择性可以通过确定抗体是否结合如上所述的其他相关三聚体-化合物复合物结合或者是否区分它们来进一步研究。
抗体可以特异性(或选择性地)结合包含其他三聚体形式的一种或多种TNF超家族成员的化合物-三聚体复合物。例如，抗体可以结合包含TNFα的化合物-三聚体复合物，包含TNFβ的化合物-三聚体复合物和包含CD40L的化合物-三聚体复合物。备选地，抗体可以特异性地(或选择性地)结合仅包含TNFα的化合物-三聚体复合物，但不结合包含任何其他TNF超家族成员的化合物-三聚体复合物。例如，抗体可以结合包含TNFα的化合物-三聚体复合物，但不结合包含TNFβ的化合物-三聚体复合物或包含CD40L的化合物-三聚体复合物。抗体可以特异性(或选择性地)结合包含多至2、3或4个或多至所有TNF超家族成员的化合物-三聚体复合物。
通过特异性(或选择性)，可以理解抗体结合目标化合物-三聚体复合物而与任何其他分子没有显著的交叉反应性，其可以包括在TNF超家族三聚体不存在的情况下的测试化合物或在测试化合物不存在的情况下的TNF超家族三聚体。可以通过本文描述的任何合适的方法评估交叉反应性。如果抗体结合另一分子的强度是其结合目标化合物-三聚体复合物的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，则可以认为抗体对于化合物-三聚体复合物与除化合物-三聚体复合物之外的分子的交叉反应性是显著的。对化合物-三聚体复合物具有特异性(或选择性)的抗体可以以其结合化合物-三聚体复合物的强度的小于约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％结合另一种分子。抗体可以以其结合化合物-三聚体复合物的强度的小于约20％，小于约15％，小于约10％或小于约5％，小于约2％或小于约1％结合另一种分子。与(i)在化合物不存在的情况下TNFα的三聚体形式和/或(ii)在TNFα三聚体不存在的情况下化合物相比，抗体特异性地(或选择性地)结合三聚体-化合物复合物。
抗体结合化合物-三聚体复合物的速率在本文中称为“结合”速率”kon-ab，并且抗体与化合物-三聚体复合物解离的速率在本文中称为“解离”速率或koff-ab。如本文所用，符号“KD-ab”表示抗体对化合物-三聚体复合物的结合亲和力(解离常数)。KD-ab定义为koff-ab/kon-ab。抗体可以具有缓慢的“结合”速率，其可通过化合物-三聚体复合物的质谱分析和抗体峰强度在几分钟内测量。可以通过在不同抗体:化合物-三聚体复合物比例下重复该测量来估计抗体的KD-ab值。
抗体对于结合化合物-三聚体复合物的KD-ab值可以比在化合物不存在的情况下抗体对于结合三聚体TNF超家族成员的KD-ab值和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体对于结合化合物的KD-ab值低至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍或400倍或更小。抗体对于结合化合物-三聚体复合物的KD-ab值可以降低为在测试化合物不存在的情况下TNF超家族三聚体结合TNF超家族受体的KD-ab值的至少约10倍，至少约100倍，至少约200倍，或至少约300倍，即抗体对于化合物-三聚体复合物的结合亲和力通常与在化合物不存在的情况下抗体对三聚体TNF超家族成员的结合亲和力和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体对化合物的结合亲和力相比，增加至少约10倍，合适地至少约100倍，更合适地至少约200倍，最合适地至少约300倍。
结合亲和力可以以结合亲和力(KD-ab)给出，并且可以以任何合适的单位给出，例如μM、nM或pM。KD-ab值越小，抗体与化合物-三聚体复合物的结合亲和力越大。
抗体对于结合化合物-三聚体复合物的KD-ab值可以是比在化合物不存在的情况下抗体对于结合三聚体TNF超家族成员的KD-ab值和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体对于结合化合物的KD-ab值低至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更低。
与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员的KD-ab值和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体对于结合化合物的KD-ab值相比，抗体对于结合化合物-三聚体复合物的KD-ab值降低可能是由于与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的结合速率(kon-ab)的增加；和/或与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的解离速率(koff-ab)的降低。
与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物的结合速率相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的抗体的结合速率(kon-ab)增加。与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物的解离速率相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的的解离速率(koff-ab)降低。与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的抗体的结合速率(kon-ab)增加，并且抗体结合化合物-三聚体复合物的的解离速率(koff-ab)降低。
与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物的kon-ab值相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的kon-ab值可以增加至少约1.5倍或至少2倍并且至少约3倍，和/或与在化合物不存在的情况下抗体结合三聚体TNF超家族成员和/或在三聚体TNF超家族成员不存在的情况下抗体结合化合物的koff-ab值相比，抗体结合化合物-三聚体复合物的koff-ab值可以降低至少约2倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，更合适地至少约90倍。
kon-ab、koff-ab和KD-ab值可以使用任何适当的技术确定，例如表面等离子共振、质谱和等温量热法。
抗体结合化合物-三聚体复合物的KD-ab值可以是1nM、900pM、700pM、500pM、100pM、10pM或更小(通常低至约1pM)。本发明的抗体将以高亲和力结合本发明的化合物-三聚体复合物，例如皮摩尔范围。抗体结合化合物-三聚体复合物的的KD-ab值可以是1nM或更小、900pM或更小、700pM或更小、500pM或更小、400pM或更小、300pM或更小、200pM或更少、100pM或更小、90pM或更小、80pM或更小、70pM或更小、60pM或更小、50pM或更小、40pM或更小、30pM或更小、20pM或更小、10pM或较少(再次低至约1pM)。
一旦鉴定和选择了合适的抗体，就可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。可以使用简并引物克隆编码抗体的基因。可以通过常规方法重组地产生抗体。
抗体可竞争与TNFα的结合，或结合与上述H链/L链、HCVR/LCVR或CDR序列相同的表位。特别地，抗体可以与包含SEQ ID NO：4/5/6/1/2/3或SEQ ID NO：19/20/21/1/17/18的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列组合的抗体竞争与TNFα的结合，或与所述抗体结合相同的表位。抗体可以与包含SEQ ID NO：8/7或SEQ ID NO：23/22的HCVR和LCVR序列对的抗体竞争与TNFα的结合，或与相同的表位结合。
术语“表位”是抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构表位的子集，并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位也可以是构象性的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括分子的化学活性表面基团的决定簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的带电特征。
可以通过使用本领域已知的常规方法确定抗体是否结合与参考抗体相同的表位，或竞争与参照抗体的结合。例如，为了确定测试抗体是否结合与本发明的参照抗体相同的表位抗体，使参考抗体在饱和条件下结合蛋白质或肽。接下来，评估测试抗体结合蛋白质或肽的能力。如果测试抗体在与参考抗体饱和结合后能够结合蛋白质或肽，则可以得出结论，测试抗体结合与参考抗体不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗体饱和结合后不能结合蛋白质或肽，则测试抗体可以结合与本发明的参照抗体所结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否竞争与参考抗体的结合，上述结合方法以两个方向进行。在第一个方向，使参照抗体在饱和条件下结合蛋白质/肽，然后评估测试抗体与蛋白质/肽分子的结合。在第二方向，使测试抗体在饱和条件下结合蛋白质/肽，然后评估参照抗体与蛋白质/肽的结合。如果在两个方向上仅第一(饱和)抗体能够结合蛋白质/肽，则得出结论测试抗体和参照抗体竞争与蛋白质/肽的结合。如本领域技术人员所理解的，竞争与参考抗体结合的抗体可能不一定结合与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参照抗体的结合。
如果每种抗体竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，在竞争性结合测定法中测量，一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、75％、90％或甚至99％(参见，例如，Junghans et al.，Cancer Res，1990：50：1495-1502)。备选地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
然后可以进行额外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的测试抗体缺乏结合是否实际上是由于结合参考抗体的相同表位或者是否是空间阻断(或另一个现象)导致观察到的结合不足。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或者本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行这种实验。
本发明的抗体结合包含三聚体TNFα的至少下列残基的表位：(a)Y115；(b)Q149；(c)N137和/或K98(即N137或K98或N137和K98两者)，其中Y115和Q149存在于三聚体TNFα的C链上，N137和K98存在于三聚体TNFα的A链上，并且其中残基编号对应于(根据)SEQ ID NO：36的TNFα。如下文进一步讨论的，SEQ ID NO：36代表人可溶性TNFα的序列。在一些情况下，抗体结合包含Y115、Q149、N137和K98的全部的表位。
尽管为人可溶性TNFα的特定序列提供了这些残基，但本领域技术人员可以使用常规技术容易地将这些残基的位置外推至其他TNFα序列(小鼠或大鼠)。因此，本发明还提供了结合包含这些其他TNF序列内的相应残基的表位的抗体。
在化合物不存在的情况下，Y115和Q149在TNFα三聚体内是隐藏的(并且是不可接近的)。然而，当TNF三聚体被本文公开的化合物结合时，这些残基在三聚体的扭曲构象内变得可接近。因此，结合包含至少Y115和Q149的表位的本发明的抗体将识别三聚体的扭曲构象(其调节TNF信号传导)，但不识别在化合物不存在的情况下三聚体的正常构象。K98也在某种程度上被掩埋在对称TNF三聚体中。
“A”和“C”链是指构成TNF三聚体的第一和第三单体。因此，本发明的抗体识别跨越TNF三聚体的两个单体的构象表位。
更详细地，当从侧面观察TNFα三聚体的晶体结构时，其大致形状像金字塔/锥形。当你向下看三聚体轴时，单体末端的N-和C-末端指向你，那么你正在观察三聚体的“宽大”末端。在具有化合物的扭曲结构中，裂缝在A和C亚基之间开口，不受理论束缚，本发明的抗体结合其中。
哪个链是A、B或C可以通过测量三个相同残基的三个C-α原子之间的三个距离来确定——例如，每条链中的P117(G121也是合适的)。
三个距离形成三角形，其在apo TNF中是等边的，但是当化合物结合时扭曲。最短距离在BC之间并且最长距离在AC之间(例如 )；因此，向下看通过分子的轴线，N/C末端指向你，最长距离定义C然后A链逆时针方向，然后B和C再次继续逆时针方向。
本发明的抗体可结合另外包含三聚体TNFα的C链上的E146、三聚体TNFα的C链上的P117或E146和P117两者的表位。P117也基本上掩埋在TNF三聚体的apo形式中(在化合物不存在的情况下)。在一些情况下，本发明的抗体结合包含E146和P117两者的表位。
本发明的抗体还可以结合进一步包含A145的表位，该残基存在于三聚体TNFα的C链上。
本发明的抗体还可以结合进一步包含Q88的表位，该残基存在于TNFα的A链上。
表位还可以进一步包含选自以下的一个或多个残基：
(a)L63；
(b)L94；
(c)S95；和
(d)A96；
其中L63存在于三聚体TNFα的C链上，并且L94、S95和A96存在于三聚体TNFα的A链上。这些残基都在一定程度上掩埋在TNF三聚体的apo形式中。
在一些情况下，本发明的抗体结合进一步包含L63、L94、S95和A96的全部的表位。
表位还可以进一步包含选自以下的一个或多个残基：
(a)I97；
(b)L93；和
(c)S81；
其中I97、L93和S81都存在于三聚体TNFα的A链上。在一些情况下，抗体与进一步包含所有这些残基的表位结合。
另外，抗体可以结合进一步包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)K65；
(b)Q67；
(c)P113；
(d)D143；
(e)T77；
(f)T79；
(g)I83；
(h)T89；
(g)K90；
(ⅰ)V91；
(j)N92；
(k)E135；
(l)I136；和
(m)R138；
其中K65、Q67、P113和D143存在于三聚体TNFα的C链上，并且T77、T79、I83、T89、K90、V91、N92、E135、I136和R138存在于三聚体TNFα的A链上。在一些情况下，本发明的抗体结合进一步包含所有这些残基的表位。
本发明的抗体还可以结合进一步包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)Y119；
(b)Q47；和
(c)S133；
其中Y119、Q47和S133全部存在于三聚体TNFα的A链上。在一些情况下，本发明的抗体可以结合进一步包含所有这些残基的表位。
在一些情况下，本发明的抗体可以结合其进一步包含Q27或R131，或者Q27和R131两者的表位，其中这些残基存在于三聚体TNFα的A链上。
如上所讨论的，残基编号根据SEQ ID NO：36给出。
本发明的抗体可以结合包含SEQ ID NO：36的TNFα的所有以下残基的表位：
(a)T77、T79、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，和K65、Q67、Y115、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；
(b)T77、T79、I83、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，和L63、K65、Q67、P113、Y115、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；
(c)T77、T79、S81、I83、Q88、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，和L63、K65、Q67、P113、Y115、P117、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；
(d)Q27、Q47、T77、T79、S81、I83、Q88、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、Y119、R131、S133、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，和L63、K65、Q67、P113、Y115、P117、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上。
为了筛选结合特定表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定法，例如Antibodies，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)中所述的。其他方法包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)或肽切割分析。另外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。这些方法在本领域中是公知的。
抗体表位也可以通过X射线晶体学分析来确定。因此，可以通过对结合TNFα三聚体的抗体进行X射线晶体学分析来评估本发明的抗体。特别地，通过确定抗体互补位残基的内TNFα上的残基，可以以这种方式鉴定表位。也可以使用限制来确定残基。
本发明的抗体还可以与结合包含本文所述TNFα残基的表位的抗体竞争。在本发明中讨论了鉴定此类抗体的方法。
本发明的抗体可以用于鉴定本文所述的本发明化合物。本发明的抗体也可用作靶标接合生物标志物。靶标接合生物标志物可用于检测接合，即配体与目标靶标的结合。在本发明的情况下，本发明的抗体仅结合本发明化合物与三聚体TNFα的复合物。因此，如果本发明的抗体能够结合化合物-三聚体复合物，则证明配体(化合物)已结合目标靶标(TNFα三聚体)。可以修饰本发明的抗体以添加如本文所述的可检测标记物。因此，可以使用这种抗体检测本发明化合物与靶TNFα的接合。
使用本发明的抗体作为靶标接合生物标记物在临床或临床前环境中可能是有用的，其中样品可以取自根据本发明进行治疗的受试者。可以用本发明的抗体处理从受试者获得的样品，以确定用于治疗受试者的化合物是否已经结合靶TNFα。从受试者获得的样品可以是任何合适的组织或液体，例如血液、血浆或尿液。受试者可以是任何哺乳动物，包括人。
因此，本发明提供了本发明的抗体作为靶标接合生物标志物的用途，用于检测包含三聚体TNFα和能够结合三聚体TNFα的化合物的化合物-三聚体复合物，由此在受试者获得的样品中化合物-三聚体复合物结合必需TNFα受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导。调控是对TNFR1信号传导的适当拮抗。
类似地，本发明提供了检测化合物与三聚体TNFα的靶标接合的方法，其中化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，所述方法包括：
(a)从施用所述化合物的受试者获得样品；
(b)使本发明的抗体与所述样品和对照样品接触，其中所述抗体是可检测的；
(c)确定所述可检测抗体与所述样品和所述对照样品的结合量，
其中所述可检测抗体与所述样品的结合大于所述可检测抗体与所述对照样品的结合，表明所述化合物与所述三聚体TNFα的靶标接合。
检测抗体和测量抗体与靶标接合的量的方法是本领域熟知的。通常，可以标记抗体。这些标记包括酶、生物素/链霉亲和素、荧光蛋白和荧光染料。
可以例如通过免疫测定方法测量抗体与靶标的结合。免疫测定法包括蛋白质印迹、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞术。可以使用任何适当的技术来测量抗体与TNFα的结合。
将可检测抗体与来自已施用化合物的受试者的样品的结合与抗体与对照样品的结合进行比较。对照样品可以是任何合适的样品。对照样品通常是“阴性对照”，其代表在化合物不存在的情况下抗体与三聚体TNFα的结合。例如，可以在施用化合物之前从患者获得样品。对照也可以基于先前确定的测量值，例如，来自在化合物不存在的情况下不同受试者的许多样品。来自约5、10、20、50或100个受试者的测量值可以用于确定对照值。对照可以是平均值，或所有获得的值的范围。
实验条件，例如对于来自施用化合物的受试者和对照样品的样品，检测方法是相同的。两种情况下抗体也相同。
与抗体与对照样品的结合相比，可检测抗体与施用化合物的患者的样品的更大结合(结合增加)表明化合物与三聚体TNFα的靶标接合。换句话说，相对于对照，来自施用化合物的患者的样品的等同或更小结合(降低的结合)表明所述化合物没有靶标接合。换句话说，两个量之间没有显著差异表明没有靶标接合。
本领域技术人员可以容易地确定相对于对照何时存在增加的结合。例如，当对照是一系列数据时，可以基于数据的扩散、对照数据与检测到的样品中抗体的结合之间的差异以及计算的置信水平来确定靶标接合。当对于样品检测到的结合高于在任何阴性对照中检测到的最大结合量时，也可以鉴定靶标接合。
如果抗体的结合相对于对照范围中的最高量增加约30％或更多，则可以检测靶标接合。如果抗体的结合相对于对照范围增加约40％或更多，或约50％或更多，也可以检测靶标接合。当对照是平均值时，或者在施用化合物之前基于来自患者的样品的单个值，同样适用。当然，相对于对照的百分比增加没有上限。
本发明的抗体可用于筛选引发三聚体TNFα中构象变化的化合物，其中所述构象变化调控必需TNFα受体对三聚体TNFα结合的信号传导。在一个非限制性实例中，调控可以是TNFR1信号传导的拮抗作用。
本发明的抗体可以用于治疗和/或预防病理状况。因此，提供了本发明的抗体，其用于在人体或动物体上实施的治疗方法。本发明还提供了治疗方法，包括向受试者施用本发明的抗体。本发明的抗体可以用于本文所述的任何治疗适应症和/或药物组合物中。
抗体测定法
如本文所述，本发明提供了抗体，其相对于它们单独结合化合物或在化合物不存在的情况下结合TNFα，选择性结合至少一种本文所述的化合物-三聚体复合物。这些抗体可以用于鉴定具有相同特性的其他化合物或化合物类别。
可以使用本文描述的标准技术产生针对TNFα的单克隆抗体。然后可以针对结合本发明的化合物-三聚体复合物的抗体，或者针对其与TNFα的结合被本文所述的化合物抑制的单克隆抗体，筛选这些抗-TNFα抗体。
备选地，可以针对特定的TNFα三聚体-化合物复合物产生单克隆抗体。然后可以针对相对于在化合物不存在的情况下它们与TNFα的结合，在化合物存在的情况下选择性地结合TNFα的单克隆抗体，筛选这些抗体。
一旦产生了相对于其单独结合化合物或在化合物不存在的情况下结合TNFα，选择性结合本发明的至少一种化合物-三聚体复合物的抗体，它可以用于筛选具有与测试化合物相同的活性的其他化合物。例如，如本文所述的化合物(1)-(7)可以用于筛选其他化合物。
因此，本发明提供了用于鉴定本发明化合物的测定法，包括以下步骤：
a)进行结合测定法以测量测试化合物-三聚体复合物与本发明抗体的结合亲和力；
b)比较步骤(a)中测量的结合亲和力与已知以高亲和力结合步骤(a)中提到的抗体的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力；和
c)如果根据步骤(b)中提到的比较考虑其测量的结合亲和力是可接受的，则选择步骤(a)的化合物-三聚体复合物中存在的化合物。
可以理解，上述步骤(b)中提到的“不同”化合物-三聚体复合物通常是含有与步骤(a)的化合物-三聚体复合物相同的TNFα三聚体的复合物，但是是不同的化合物。步骤(b)的化合物可以是化合物(1)-(7)中的任何一种。
步骤(c)中的“可接受的”是指步骤(a)中提到的化合物-三聚体复合物的结合亲和力和步骤(b)中提到的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力至少是可比较的。步骤(a)中提到的化合物-三聚体复合物的结合亲和力可以至少等于步骤(b)中提到的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力。与步骤(b)中的化合物相比，对于步骤(a)中的化合物的结合亲和力甚至可以更高(即，更低的KD值)。相对于在化合物不存在的情况下所述抗体与TNFα的结合或在TNFα不存在的情况下与化合物的结合来测量所述抗体与所述复合物的选择性结合。
步骤(a)中提到的化合物-三聚体复合物的结合亲和力通常优于步骤(b)中提到的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力。步骤(a)中提到的化合物-三聚体复合物的结合亲和力相对于步骤(b)中提到的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力的差异将在10倍、20倍、50倍、100倍、200倍或500倍的范围内。
可以使用本发明的抗体测定化合物文库。可以在TNFα存在和不存在的情况下将文库化合物与所述抗体孵育。仅在TNFα和化合物两者存在的情况下形成结合本发明抗体的化合物-三聚体复合物的一部分的化合物可能是具有与本文所述化合物相同的活性的候选者。然后可以使用本文公开的测定法来验证测试化合物是否是如本文所述的化合物。
本发明的一种或多种抗体可以用于测定法。能够结合本发明的任何化合物与特定TNFα的复合物的通用抗体可以用于本发明的抗体测定法。
可以在本发明的抗体测定法中使用对不同化合物-三聚体复合物具有特异性的本发明的多种抗体组。该组抗体可包括至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少30种、至少40种或至少50种抗体(例如至多75种抗体)。
本发明的抗体测定法可以是高通量测定法，其能够在短时间内筛选大量的测试化合物以鉴定本发明的化合物。
TNFα及其受体可以纯化或存在于混合物中，例如在培养的细胞、组织样品、体液或培养基中。可以开发定性或定量的测定法，后者可用于测定测试化合物与三聚体形式的TNFα的结合参数(亲和常数和动力学)，以及化合物-三聚体复合物与必需TNF受体的结合参数。
包含TNFα和化合物的样品可以进一步包含去稳定剂。去稳定剂，也称为离液剂，包括低摩尔浓度(例如1M)的尿素、胍或乙腈，这些试剂的高浓度(例如6M或更高)将导致TNFα三聚体的完全解离和组成TNFα单体亚基的解折叠。去稳定剂可以是DMSO，通常浓度为5％、10％或更高。
测试化合物可具有上述任何或所有性质。
TNF超家族及其受体
目前已知22种TNF超家族成员：TNFα(TNFSF1A)、TNFβ(TNFSF1B)、CD40L(TNFSF5)、BAFF(TNFSF13B/BlyS)、APRIL(TNFSF13)、OX40L(TNFSF4)、RANKL(TNFSF11/TRANCE)、TWEAK(TNFSF12)、TRAIL(TNFSF10)、TL1A(TNFSF15)、LIGHT(TNFSF14)、淋巴毒素、淋巴毒素β(TNFSF3)、4-1BBL(TNFSF9)、CD27L(TNFSF7)、CD30L(TNFSF8)、EDA(外异蛋白)、EDA-A1(外异蛋白A1)、EDA-A2(外异蛋白A2)、FASL(TNFSF6)、NGF和GITRL(TNFSF18)。
在本发明中，TNF超家族成员是TNFα。TNFα以可溶性(TNFαs)和膜结合形式(TNFαm)存在。当本文提及TNFα时，涵盖TNFαs和TNFαm形式。TNFα通常为TNFαs形式。TNFαs可以包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36的序列，或其变体(如上所述)。
本发明的测定法可以用于鉴定TNFα的调控剂。具体地，本发明的测定法可以用于鉴定结合TNFα的化合物，特别是TNFα的三聚体形式，并且稳定化这些三聚体以能够结合必需TNF受体的构象，并通过所述受体调控信号传导。TNFα可以是TNFαs。
本文描述的化合物可以是至少TNFα的调节剂。TNFα通常是TNFαs。
本发明的化合物-三聚体复合物包括TNFα的三聚体形式。TNFα通常是TNFαs。
TNF超家族的成员结合TNF受体并通过TNF受体启动信号传导。目前有34种已知的TNF受体：4-1BB(TNFRSF9/CD137)、NGF R(TNFRSF16)、BAFF R(TNFRSF13C)、骨保护素(TNFRSF11B)、BCMA(TNFRSF17)、OX40(TNFRSF4)、CD27(TNFRSF7)、RANK(TNFRSF11A)、CD30(TNFRSF8)、RELT(TNFRSF19L)、CD40(TNFRSF5)、TACI(TNFRSF13B)、DcR3(TNFRSF6B)、TNFRH3(TNFRSF26)、DcTRAIL R1(TNFRSF23)、DcTRAIL R2(TNFRSF22)、TNF-R1(TNFRSF1A)、TNF-R2(TNFRSF1B)、DR3(TNFRSF25)、TRAIL R1(TNFRSF10A)、DR6(TNFRSF21)、TRAIL R2(TNFRSF10B)、EDAR、TRAIL R3(TNFRSF10C)、Fas(TNFRSF6/CD95)、TRAIL R4(TNFRSF10D)、GITR(TNFRSF18)、TROY(TNFRSF19)、HVEM(TNFRSF14)、TWEAK R(TNFRSF12A)、TRAMP(TNFRSF25)、淋巴毒素βR(TNFRSF3)和XEDAR。
当在本文中提及TNF-R时，其涵盖TNF-R1和TNF-R2，包括TNF-R1和TNF-R2的细胞外结构域(ECD)。本发明的测定法可以用于鉴定调控TNFα通过任何必需TNF受体的信号传导的化合物。本发明的测定法可以用于鉴定调控TNFα通过通过TNF-R1或TNF-R2的信号传导的化合物。TNF超家族成员可以是TNFα并且TNF受体可以是TNF-R1。在本发明的一个实施方案中，TNF超家族成员可以是TNFαs并且TNF受体可以是TNF-R1。本发明的测定法可以用于鉴定通过特异性调控TNFα通过TNF-R1的信号传导而起作用的化合物。特别地，化合物可通过调控TNFα通过TNF-R1的信号传导而起作用，但对TNFα通过TNF-R2的信号传导没有影响。
治疗适应症
TNFα是TNF超家族的原型成员。TNFα是介导免疫调节和炎症应答的多效细胞因子。在体内，还已知TNFα参与对细菌、寄生虫和病毒感染的应答。特别地，已知TNFα在类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(包括克罗恩病)、牛皮癣、阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、疼痛、癫痫、骨质疏松症、哮喘、败血症、发热、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症(MS)以及癌症起作用。还已知TNFα在肌萎缩侧索硬化症(ALS)、缺血性中风、免疫复合物介导的肾小球肾炎、狼疮性肾炎(LN)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA-)相关性肾小球肾炎、微小病变、糖尿病肾病(DN)、急性肾损伤(AKI)、阻塞性尿路病、肾同种异体移植排斥反应、顺铂诱导的AKI和阻塞性尿路病中起作用。
已知TNF超家族的其他成员参与自身免疫疾病和免疫缺陷。特别地，已知TNF超家族的成员参与RA、SLE、癌症、MS、哮喘、鼻炎、骨质疏松症和多发性骨髓瘤(MM)。已知TL1A在器官移植排斥中起作用。
本文描述的化合物可用于治疗，预防或改善可由常规TNF超家族成员调控剂治疗、预防或改善的任何病况。化合物可以单独使用或与常规TNF超家族成员调控剂组合使用。通过TNF超家族成员通过TNF受体的致病性信号传导或通过TNF受体通过TNF超家族成员的信号传导缺陷部分地或全部地导致的任何病况原则上可以被治疗、预防或改善。通过TNF受体通过TNF超家族成员的致病性信号传导包括但不限于通过TNF受体的信号传导增加超过正常生理信号水平，通过正常启动的TNF受体的信号传导，但不停止响应通过TNF受体的正常生理信号和信号传导，其在正常生理范围内，但是通过非生理学手段引发。本发明涉及TNFα介导或影响的病症的治疗、预防或改善。
因此，与TNFα相互作用的化合物有益于治疗和/或预防多种人类疾病。这些包括自身免疫和炎症性病症；神经和神经退行性病症；疼痛和伤害性病症；和心血管病症。
炎症和自身免疫病症包括系统性自身免疫病症、自身免疫内分泌病症和器官特异性自身免疫病症。系统性自身免疫病症包括系统性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣、血管炎、多发性肌炎、硬皮病、多发性硬化、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎和舍格伦综合征。自身免疫内分泌病症包括甲状腺炎。器官特异性自身免疫病症包括艾迪生病、溶血性或恶性贫血、肾小球肾炎(包括肺出血肾炎综合征)、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、青少年糖尿病、葡萄膜炎、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、天疱疮、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肺炎、自身免疫心脏炎、重症肌无力、自发性不孕症、骨质疏松症、哮喘和肌营养不良症(包括杜氏肌营养不良症)。
神经和神经退行性病症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、中风、肌萎缩侧索硬化、脊髓损伤、头部创伤、猝发和癫痫。
心血管疾病包括血栓形成、心脏肥大、高血压、心脏的不规则收缩性(例如在心力衰竭期间)和性功能障碍(包括勃起功能障碍和女性性功能障碍)。
化合物可用于治疗或预防炎性病症、CNS病症、免疫病症和自身免疫病症、疼痛、骨质疏松症、发热和器官移植排斥。化合物可以用于治疗或预防类风湿性关节炎、炎性肠病(包括克罗恩病)、牛皮癣、阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫、哮喘、败血症、系统性红斑狼疮、多发性硬化、哮喘、鼻炎、癌症和骨质疏松症。化合物可以用于治疗或预防类风湿性关节炎(RA)、非特异性炎性关节炎、糜烂性骨病、软骨炎、软骨变性和/或破坏、青少年炎性关节炎、斯蒂尔病(青少年和/或成人发病)、幼年特发性关节炎、青少年特发性关节炎(低关节和多关节形式)、炎症性肠病(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、不确定性结肠炎、脓包皮炎)、牛皮癣、银屑病、强直性脊柱炎、干燥综合征、阿尔茨海默病(AD)、白塞病、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、缺血性中风、疼痛、癫痫、骨质疏松症、骨质减少、慢性病贫血、恶病质、糖尿病、血脂异常、代谢综合征、哮喘、慢性阻塞性气道(或肺)疾病、败血症、发烧、呼吸窘迫综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)免疫复合物-介导的肾小球肾炎、狼疮性肾炎(LN)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA-)相关性肾小球肾炎、微小病变、糖尿病肾病(DN)、急性肾损伤(AKI)、阻塞性尿路病、肾移植排斥反应、顺铂诱导的AKI和阻塞性尿路病变、眼疾(包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、增殖性和/或非增殖性视网膜病变、角膜血管形成包括新生血管形成、视网膜静脉阻塞、多种形式的葡萄膜炎和角膜炎)、类风湿性关节炎、纤维化疾病包括多种形式的肝纤维化、多种形式的肺纤维化、系统性硬化、硬皮病、癌症和癌症相关并发症(包括骨骼并发症、恶病质和贫血)。
如上所述，本发明的抗体可用作靶标接合生物标志物，以评估用本文所述的化合物或复合物治疗的有效性。在一个实施方案中，取自用本文所述化合物或复合物治疗的受试者的样品可以与本发明的抗体接触。然后可以使用抗体测定样品中存在的TNFα-化合物复合物的量。使用抗体确定的复合物的量可能与治疗的有效性有关。例如，通过本发明的抗体检测越复杂，治疗越有效。使用抗体测定的复合物的量与治疗的有效性成正比。例如，使用抗体确定的复合物的量加倍可以指示治疗有效性加倍。
本发明的抗体可以用于使用任何适当的技术确定化合物-三聚体复合物的量。标准技术在本领域中是已知的并且在本文中公开。例如，用本发明的抗体进行ELISA和蛋白质印迹可用于确定化合物-三聚体复合物的量。
化合物-三聚体复合物的量可以通过测量化合物-三聚体复合物的质量，化合物-三聚体复合物的浓度和化合物-三聚体复合物的摩尔浓度来确定。该量可以以任何适当的单位给出。例如，化合物-三聚体复合物的浓度可以以pg/ml、ng/ml或μg/ml给出。化合物-三聚体复合物的质量可以以pg、ng或μg给出。
可以将目的样品中的化合物-三聚体复合物的量与另一样品(例如对照样品)中的化合物-三聚体复合物的水平进行比较，如本文所述。在这种方法中，可以评估化合物-三聚体复合物的实际量，例如样品中化合物-三聚体复合物的质量、摩尔量、浓度或摩尔浓度。可以将化合物-三聚体复合物的量与另一样品中的量进行比较，而不定量化合物-三聚体复合物的质量、摩尔量、浓度或摩尔浓度。因此，基于比较，可以将根据本发明的样品中的化合物-三聚体复合物的量评估为相对量，例如基于两个或更多样本之间比较的化合物-三聚体复合物的相对质量、相对摩尔量、相对浓度或相对摩尔浓度。
药物组合物、剂量和剂量方案
本发明的抗体、化合物或复合物可以以药物组合物的形式提供。药物组合物通常是无菌的，并且通常包括药学上可接受的载体和/或辅剂。本发明的药物组合物可以另外包含药学上可接受的辅剂和/或载体。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体可以适用于肠胃外，例如施用的静脉内、肌肉内、皮内、眼内、腹膜内、皮下、脊柱或其他胃肠外途径，例如通过注射或输注。备选地，载体可以适用于非肠胃外给药，例如施用的局部、表皮或粘膜途径。载体可以适用于口服施用。取决于施用途径，调控剂可以涂覆在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其它天然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学作用的盐。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。
药学上可接受的载体包括含水载体或稀释剂。可用于本发明药物组合物的合适含水载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。在许多情况下，希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。
本发明的药物组合物可以包含另外的活性成分。
包含本发明的抗体、化合物和/或复合物的试剂盒和使用说明书也在本发明的范围内。试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，例如上面讨论的另外的治疗剂或预防剂。
可以施用通过本发明的方法和/或抗体鉴定的化合物和本发明的抗体或其制剂或组合物用于预防性和/或治疗性处理。
在治疗性应用中，化合物以足以治愈、缓解或部分地停滞病况或其一种或多种症状的量给予已经患有上述病症或病况的受试者。这种治疗性处理可导致疾病症状的严重性降低，或无症状期的频率或持续时间的增加。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效量”。
在预防性应用中，将制剂施用于具有如上所述的病症或病况风险的受试者，其量足以预防或减少病症或其一种或多种症状的后续影响。足以实现此目的的量被定义为“预防有效量”。每种目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
施用的受试者可以是人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。本发明的一个实施方案是对人的施用。
可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种给药途径施用本发明的化合物或药物组合物。如本领域技术人员所理解的，施用的途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明化合物或药物组合物的施用途径的实例包括施用的静脉内、肌肉内、皮内、眼内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外给药，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射。备选地，本发明的化合物或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用，例如施用的局部、表皮或粘膜途径。本发明的化合物或药物组合物可用于口服施用。
本发明化合物或药物组合物的合适剂量可以由熟练的医师确定。可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的所需治疗应答，对病人无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的相似因素。
合适的剂量可以是，例如，待治疗患者的约0.01μg/kg至约1000mg/kg体重，或约0.1μg/kg至约100mg/kg体重。作为非限制性实例，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单剂量，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以按照治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。
施用可以是单剂量或多剂量。多剂量可以通过相同或不同的途径施用并且至相同或不同的位置。备选地，剂量可以通过持续释放制剂，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率可以根据患者中拮抗剂的半衰期和所需治疗的持续时间而变化。
如上所述，本发明的化合物或药物组合物可以与一种或多种其他治疗剂共同施用。例如，其他试剂可以是镇痛剂、麻醉剂、免疫抑制剂或抗炎剂。
可以以多种不同方式实现两种或更多种试剂的组合施用。两者可以在单一组合物中一起施用，或者它们可以作为组合疗法的一部分在单独的组合物中施用。例如，可以在另一个之前、之后或同时施用。
以下实施例如下，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明方法和组合物的完整公开和描述。这些实施例不是要限制发明人认为是其发明的范围。
实施例
实施例1——化合物的合成
化合物(1)的合成公开在WO2013/186229中(实施例44)。
化合物(2)的合成公开在WO2013/186229中(实施例89)。
化合物(3)的合成公开在WO2014/009295中(实施例129)。
化合物(4)的合成公开在WO2014/009295中(实施例173)。
化合物(5)的合成公开在WO2014/009295中(实施例319)。
化合物(6)的合成公开在WO2013/186229中(实施例490)。
化合物(7)的合成公开在WO2013/186229中(实施例156)。
实施例2——抗体衍生化
在用与苯并咪唑化合物(1)复合的人TNFα免疫5只Sprague Dawley大鼠后，在96孔板中培养免疫B细胞以诱导克隆扩增和抗体分泌(Tickle，S.et al.，High throughputscreening for high affinity antibodies Journal of Laboratory Automation 200914:303-307)。在基于均匀珠子的FMAT测定法中，与apo人TNFα相比，针对优先结合与化合物(1)复合物(复合的人TNFα与50倍摩尔过量)的IgG抗体筛选培养物上清液。使用与生物素化的抗人Fc结合(Jackson目录号109-066-098)结合的人TNF-Receptor I-Fc融合蛋白(R&DSystems目录号372-Rl-050)通过捕获系统将人TNFα(+/-化合物(1))呈递在珠表面(超级生物素包被的Bangs Beads，目录号CP01N)上。
证明优先结合TNFα-化合物(1)复合物的抗体被称为“构象选择性”并且被推进用于克隆。使用Fluorescent Foci方法(美国专利7993864/欧洲EP1570267B1)从阳性孔中鉴定和分离抗原特异性B细胞，并通过逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收特异性抗体可变区基因。
两种代表性抗体CA185_01974和CA185_01979的氨基酸序列如下所示，其表现出对人和小鼠TNFα+化合物的构象选择性结合：
CA185_01974.0(VR0001837)
轻链可变区(LCVR)SEQ ID NO：7(CDR下划线)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
重链可变区(HCVR)SEQ ID NO：8(CDR下划线)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEA YGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS
CA185_01979.0(VR0001842)
轻链可变区(LCVR)SEQ ID NO：22(CDR下划线)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK
重链可变区(HCVR)SEQ ID NO：23(下划线的CDR)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS
实施例3——衍生的抗体的潜在表位
鉴于大鼠来源的抗体在化合物存在下结合人和小鼠TNFα的能力，对大鼠、小鼠和人氨基酸序列以及TNFα的X射线晶体结构进行了详细分析，以确定是否可以确定可能的表位。
大鼠UniProt P16599(SEQ ID NO:32)
小鼠UniProt P06804(SEQ ID NO:33)
人UniProt P01375(SEQ ID NO:34)
从大鼠、小鼠和人TNFαUniProt序列的比对和比较，大鼠氨基酸序列与人不同的实例，以及人和小鼠序列在成熟的切割产物中相同的实例包括N168、I194，F220和A221(来自人序列的残基和编号)。
这些残基在人TNFα(1TNF)的晶体结构上突出显示(图1)。这些氨基酸中的任何一种都可以包含在抗体CA185_01974和CA185_01979靶向的表位中。
在将抗体可变区克隆到小鼠IgG和小鼠Fab(无铰链)载体中后，使用多种与TNFα结合的测试化合物，在HPLC、BIAcore、ELISA和基于细胞的测定法中确认了抗体CA185_01974和CA185_01979结合的构象选择性性质。
对于CA185_01979的表位的更全面的分析在下面的实施例9和10中给出。
实施例4——测定抗体特征的高效液相色谱(HPLC)
通过使用尺寸排阻色谱法在CA185_01974和与化合物(1)复合的人TNFα之间形成复合物来证明小鼠Fab片段的特异性结合。结果显示在图2中。如该图所示，具有0.5倍摩尔过量的Fab，主要峰对应于结合的Fab和三聚体-化合物复合物(尽管存在小峰，表明存在一些三聚体-化合物复合物不结合Fab)。在1.0倍摩尔过量的Fab，存在对应于结合三聚体-化合物复合物的Fab的单个较高分子量峰。在1.5倍和2倍摩尔过量的Fab，存在对应于未结合的Fab的增长的较低分子峰。
因此确定化学计量为1Fab:1TNFα三聚体，过量的Fab出现在1.5倍和2倍摩尔过量。
还使用尺寸排阻色谱法研究了CA185_01979对与化合物(1)复合的人TNFα的结合。结果显示在图3中。对于CA185_01974，确定化学计量为1Fab:1TNFα三聚体，过量的Fab出现在1.5倍和2倍摩尔过量。
实施例5——测定抗体特征的BIAcorec测定法
使用BIAcore T200(GE Healthcare)在25℃进行表面等离子体共振。通过胺偶联化学将抗小鼠Fc(Jackson 115-006-071)固定化在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上至～6000应答单位的捕获水平。HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％(v/v)表面活性剂P20-GE Healthcare)+1％DMSO用作运行缓冲液。以1μg/ml注射10μl每种IgG用于通过固定化的抗小鼠Fc捕获以产生TNFα结合表面。将50nM的人或小鼠TNFα(内部)与2μM化合物在HBS-EP+(1％DMSO)中预孵育5小时。
将3分钟注射的人或小鼠TNFα+/-测试化合物以30μl/min的流速通过每个捕获的IgG。通过60秒注射40mM HCl x2和30s 5mM NaOH，以10μl/min的流速再生表面。使用T200Evaluation软件(版本1.0)按照标准程序分析双参考背景扣除的结合曲线。从拟合算法确定动力学参数。
在来自两个化学系列的测试化合物存在和不存在的情况下，人和小鼠TNFα的动力学结合数据显示在下表1和2中。
表1-与人TNFα的BIAcore数据
抗体 人TNFα ka(M-<sup>1</sup>s<sup>-1</sup>) kd(s-<sup>1</sup>) KD(M)
CA185_01974 +化合物(2) 4.2x10<sup>5</sup> 3.9x10<sup>-5</sup> 9.4x10<sup>-11</sup>
CA185_01974 +化合物1 3.2x10<sup>5</sup> 3.8x10<sup>-5</sup> 1.2x10<sup>-10</sup>
CA185_01974 apo 6.6x10<sup>4</sup> 1.3x10<sup>-3</sup> 1.9x10<sup>-8</sup>
CA185_01979 +化合物(2) 5.7x10<sup>5</sup> 3.3x10<sup>-5</sup> 5.8x10<sup>-11</sup>
CA185_01979 +化合物(1) 4.7x10<sup>5</sup> 1.6x10<sup>-5</sup> 3.4x10<sup>-11</sup>
CA185_01979 apo 1.1x10<sup>5</sup> 7.1x10<sup>-4</sup> 6.7x10<sup>-9</sup>
对于化合物扭曲的人TNFα，CA185_01974和CA185_01979均显示出>2log选择性结合，具有来自两个化学系列的代表性测试化合物。
表2-用小鼠TNFα的BIAcore数据
抗体 小鼠TNFα ka(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) kd(s<sup>-1</sup>) KD(M)
CA185_01974 +化合物(2) 6.7x10<sup>4</sup> 4.8x10<sup>-5</sup> 7.1x10<sup>-10</sup>
CA185_01974 +化合物(1) 5.8x10<sup>4</sup> 8.8x10<sup>-5</sup> 1.5x10<sup>-9</sup>
CA185_01974 apo 4.2x10<sup>4</sup> 4.9x10<sup>-3</sup> 1.2x10<sup>-7</sup>
CA185_01979 +化合物(2) 1.9x10<sup>5</sup> 3.5x10<sup>-5</sup> 1.9x10<sup>-10</sup>
CA185_01979 +化合物(1) 1.6x10<sup>5</sup> 6.3x10<sup>-5</sup> 3.8x10<sup>-10</sup>
CA185_01979 apo 7.2x10<sup>4</sup> 2.0x10<sup>-3</sup> 2.7x10<sup>-8</sup>
对于化合物扭曲的小鼠TNFα，CA185_01974和CA185_01979均显示>1.5和>2对数选择性结合，具有来自两个化学系列的代表性测试化合物。
实施例6——ELISA确定抗体特征
使用抗体CA185_01974.0开发夹心ELISA以测量与本发明化合物结合的TNFα的浓度，所述抗体CA185_01974.0在与这些化合物复合时特异性检测TNFα的构象。简而言之，用CA185_01974.0包被微量滴定板以固定化与测试化合物复合的TNFα。将TNFα在2-8℃与50x摩尔过量的测试化合物孵育过夜。在此过夜孵育后，在嗜异性抗体阻断剂存在下，将TNFα在缺乏内源性TNFα的纯人血浆中连续稀释，并加入到包被的平板中。使用0.78pg/ml-50pg/mlTNFα的浓度范围产生曲线。使用生物素化的多克隆抗TNFα抗体检测结合的TNFα，用链霉亲和素-过氧化物酶和TMB底物，得到比色信号。使用来自Perkin Elmer的ELAST试剂盒，使用酪胺信号放大增加了测定法的灵敏度，作为链霉亲和素-过氧化物酶和底物之间的额外步骤。
还开发了ELISA以平行测量总TNFα(与测试化合物复合的游离TNFα+TNFα)。对于该测定法，用商业抗TNFα多克隆抗体(Invitrogen AHC3812)替换包被抗体。样品培养时间也增加至3小时。所有其他步骤与构象特异性测定法相同。这使得与测试化合物复合的TNFα的量能够计算为总TNFα的比例。
化合物(3)、(4)和(5)的总TNFαELISA的结果显示在图4中。
具有CA185_01974.0和化合物(3)、(4)和(5)的构象特异性TNFαELISA的结果显示在图5中。Apo TNFα在该测定法中未给出信号，证明抗体CA185_01974与化合物结合的TNFα结合的特定性质。该抗体能够识别来自不同化学系列的多种测试化合物结合的TNFα。
实施例7——基于细胞的测定法以确定抗体特征
还使用人胚胎肾(HEK)JumpIn细胞在FACS测定法中测试重组抗体对于与化合物扭曲的TNFα的结合，所述JumpIn细胞在用强力霉素以1μg/ml诱导2.5小时后过表达TNF-RI。用胰蛋白酶消化HEK细胞并在培养基中孵育2小时以回收消化的TNFRI水平。将2μg/mL的人TNFα与40μM化合物(1)或0.4％DMSO在37℃预孵育1小时。将预孵育混合物在冰上加入细胞1小时(稀释度1:4，终浓度：0.5μg/mL人-TNFα+/-10μM化合物(1)或0.1％DMSO)。洗涤细胞，固定(1.5％PFA)并用1或10μg/mL抗体在冰上染色1小时。(二抗:抗小鼠-Alexa488)，在分析受体结合的TNFα之前。
如图6所示，用1和10μg/ml的CA185_01974和CA185_01979染色的FACS直方图显示抗体仅识别已与化合物(1)预孵育的TNFα。DMSO对照没有染色。
此外，用化合物扭曲的膜结合的TNFα证明了CA185_01974和CA185-01979Fab片段的特异性结合。由于敲除TACE切割位点而过表达膜TNFα的工程化改造NS0细胞系与0.001-10μM化合物(1)或0.1％DMSO在37℃孵育1小时。洗涤细胞，固定并用抗体Fab片段以0.01或0.1μg/ml在冰上染色1小时。(二抗是来自Jackson ImmunoResearch的抗小鼠Fab-DyeLight488)。
用CA185_01974(图7)和CA185_01979 Fab片段染色的FACS直方图显示抗体仅识别已与化合物(1)预孵育的TNF。DMSO对照没有染色。
实施例8——抗体CA185_01974显示出对于人TNF-化合物(4)复合物的300倍的选 择性
将化合物(4)与人和食蟹猴TNF孵育，并在小鼠全长抗体CA185_01974上滴定，以确定准确的亲和力值。该实验包括以下对照：(i)在1974上的人或食蟹猴TNF+DMSO；(ii)无抗体的人或食蟹猴TNF+DMSO；(iii)无抗体的人或食蟹猴TNF+化合物(4)。每个样品和对照一式两份进行，并在每个重复中使用四种浓度。
如图8和9所示，在测定法的过程中，hTNF+化合物(4)和cTNF+化合物(4)的背景结合增加了5-10RU。这可见于在第二个重复中h/cTNF+化合物(4)结合CA185_01974的更高应答。在化合物(4)不存在的情况下hTNF和cTNF的结合始终非常低。
hTNF+DMSO结合小鼠全长IgG CA185_1974_P8的动力学在该测定法中与先前的单一浓度分析非常相似。食蟹猴TNF对于小鼠全长IgG CA185_1974_P8的亲和力相似，但动力学不同。
表3给出了每种分析物结合CA185_1974_P8的动力学。表4给出了对于CA185_1974_p8的TNF动力学的平均值和倍数差异+/-化合物(4)。图8给出了cTNF+/-化合物(4)的两个重复的传感图。图9给出了hTNF+/-化合物(4)的两个重复的传感图。
表3：hTNF和cTNF+/-化合物(4)与CA185_1974_P8抗体的结合动力学
表4：CA185_1974_p8的hTNF和cTNF动力学的平均值和倍数差异+/-化合物(4)。
重复的平均 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) KD(pM)
cyno TNF 1.14E+05 1.90E-03 1.68E-08 16810
cyno TNF+化合物(4) 1.93E+05 1.76E-05 9.09E-11 90.92
倍数差异 1.69 107.81 184.89 184.89
人TNF 9.27E+04 1.72E-03 1.90E-08 19000
人TNF+化合物(4) 3.06E+05 1.86E-05 6.08E-11 60.76
倍数差异 3.31 92.43 312.70 312.70
实施例9——Ma et al(2014)和Silvian et al(2011)的化合物和复合物具有与 本发明不同的特征
如Ma et al.(2014)JBC 289:12457-12466的第12458页所述，通过虚拟筛选发现C87，试图在其与TNFβ的外表面的相互作用中找到符合来自TNFR1的环2/结构域2的7个氨基酸肽占据的空间的分子。本发明人测试了来自Ma et al.的C87化合物和来自Silvian etal.(2011)ACS Chemical Biology 6:636-647的BIO8898化合物。
发现的概述
Ma et al.描述的对于C87的Biacore观察结果无法重复。
没有观察到细胞中TNF特异性抑制的证据。
另外，通过质谱法未观察到C87结合，质谱法对毫摩尔亲和力敏感。
广泛的结晶学试验仅产生apo-TNF(不含化合物的TNF)。
在荧光偏振(FP)测定法中，C87在具有荧光读数的化合物的干扰水平之上没有显示出显著的抑制。
测量TNFα的热熔温度稳定性的Thermofluor确实显示出对于C87的小稳定性。
总之，没有证据表明C87在三聚体的中心结合。绝大多数数据表明与TNFα没有直接相互作用。也发现BIO8898不结合TNFα。
细胞——TNF诱导的HEK NFκB报告基因测定法
将C87与TNFα预孵育1小时，然后加入用在NFκB控制下的SEAP稳定转染的HEK-293细胞。还测试了适当的反筛选以检测非TNF相关(脱靶)活性。将测定法孵育过夜，然后测量抑制，与对照化合物的100％阻断比较。最大C87浓度为10,000nM，连续稀释3倍。
没有检测到不能归因于脱靶活性的抑制作用。
Biacore
使用avi-tag接头固定化TNF，并使C87通过芯片。在一个实验中，进行了来自最高浓度为10μM的C87的剂量应答。没有观察到结合。
在第二个实验中，降低C87通过芯片的流速。观察到一个小的变化，但整体结合可忽略不计。
Ma et al描述的C87与TNF的结合可能是基于Y轴上的RU值的超化学计量。在芯片上的标准TNF密度下，该值是简单1:1结合的预期值的30倍。
在另一个实验中，在Biacore 4000机器上通过SPR针对固定化的可溶形式的CD40L和可溶形式的TNFα测试BIO8898。对于针对CD40L的结合，测定17μM的几何IC50，而在该测定法中，在对于TNFα的浓度高达100μM时未检测到结合。
质谱
没有证据表明C87在400μM浓度结合人TNFα(20μM)。一种较低分子量的物质(～473Da似乎以低于5％的占有率结合)。C87的分子量为503Da。基于400μM浓度的占有率，预测低分子量物质的亲和力超过1mM。
结晶学
总体而言，大量努力用于结晶具有TNFα的C87，包括常规用本申请中描述的化合物的测试条件。这包括在不同的配体浓度、不同的蛋白质浓度和不同的浸泡时间进行大量的结晶试验。观察到少量晶体，经分析，证明是盐或没有化合物的TNF。
荧光偏振(FP)
在进行针对荧光化合物(探针)的测定法之前，将C87与TNFα预孵育1小时。通过FP的降低来检测与荧光化合物的直接地(在相同位点结合)或间接地竞争(破坏TNF)。
抑制曲线的外推产生约100μM的IC50。然而，在最高浓度的抑制剂观察到荧光猝灭，当减去时，在该测定法中导致C87的抑制可忽略不计。
Thermofluor
Thermofluor测量由于化合物稳定化或破坏蛋白质而引起的TNFα的解链温度(Tm)的变化。在500μM C87的浓度观察到3.8℃的稳定化作用，表明弱结合的可能性，其可能不是特异性的。
实施例10——hTNFα和Fab1974复合结构
1)蛋白质表达和纯化
人TNFα(CID2043，UniProt P01375，残基77-233)的可溶形式在大肠杆菌中表达为融合蛋白，并具有最终序列：
SVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQ ID NO:35)
SEQ ID NO：35的起始“S”是克隆假象，而不是TNF的天然序列的一部分。因此，SEQID NO：35的残基编号从V开始，即V1、R2、S3等。SEQ ID NO：36代表SEQ ID NO：35，但没有该起始“S”残基，即
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQ ID NO:36)
将细胞在富含培养基中于37℃预培养，加入0.1％阿拉伯糖进行诱导，并在25℃在载体pEMB54中表达过夜。该载体引入了可切割的N-末端His6Smt-标签。裂解细胞并通过Ni-NTA螯合色谱法纯化。用含有咪唑的缓冲液洗脱融合蛋白，并通过加入蛋白酶进行切割。通过消减Ni螯合色谱步骤纯化最终切割的TNFα蛋白以除去融合标签，并通过尺寸排阻色谱进一步纯化以除去剩余的杂质。最终的TNFα产物通常浓缩至20.0mg/ml并在液氮中快速冷冻。
具有N54D和C182S突变的人TNFR1(CID5602，UniProt P19438，残基42-184)的细胞外结构域在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达为分泌蛋白，并具有最终序列：
GSVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN(SEQID NO:37)
SEQ ID NO：37的起始“G”是克隆假象，而不是TNFR1的天然序列的一部分。因此，SEQ ID NO：37的残基编号从S开始，即S1、V2、C3等。SEQ ID NO：38代表SEQ ID NO：37，但没有该起始“G”残基，即
SVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN(SEQ ID NO:38)
将融合蛋白质粒克隆到pEMB50表达载体中，该载体编码可切割的N-末端分泌信号和His-标记的融合蛋白。使用杆状病毒表达系统产生病毒。受感染的昆虫细胞将融合蛋白分泌到培养基中。通过Ni-NTA螯合色谱法纯化融合蛋白，并使用咪唑梯度从Ni柱洗脱。用蛋白酶切割洗脱的蛋白质以释放N-末端His-融合标签。随后通过消减Ni螯合色谱步骤纯化切割的TNFR1，并通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。最终的TNFR1产物通常浓缩至10.0mg/ml并在液氮中快速冷冻。
为了形成复合物，将333μl的300mM纯化的人TNFα与4,567μl的SEC缓冲液(10mMHEPES，pH 7.5、150mM NaCl)和100μL化合物(2)(10mM在DMSO中，约10摩尔过量)混合，并在4℃孵育过夜。第二天，通过向700μl TNFR1、5,000μl的TNFα/UCB1478733混合物和220μl的500mM Fab1974添加4080μl的SEC缓冲液来形成复合物；反应总体积为10ml，最终摩尔比为3TNFα单体(相当于1个三聚体):2.5TNFR1受体:1.2Fab。将四元复合物(细胞因子、配体、受体和Fab)在4℃孵育1小时。然后将样品浓缩至1.5ml并在Superdex 200 16/600尺寸排阻柱(120ml)上以单次注射加载，该柱用10mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl预平衡。选择四元复合物的峰值级分并浓缩至13.7mg/ml并立即用于结晶试验。
2)结晶
通过将0.5μl的复合物与0.5μl的Wizard III/IV:0.1M HEPES，pH7.0、10％PEG6,000(条件B8)在80μl相同的结晶溶液中混合，通过静滴蒸气扩散使四元复合物结晶。在初始设置后约2个月收获晶体用于数据收集。它们在5-10-15％的步骤中在甘油中进行冷冻保护，然后在2016年6月8日在Argonne National Laboratory,Life SciencesCollaborative Access Team(LS-CAT),beamline 21-ID-F的Advanced Photon Source在液氮中直接冷冻用于数据收集。
3)结构测定
与配体化合物(2)的人TNFα(CID2043)、人TNFR1(CID5602)和Fab1974复合物的结构通过使用Phenix.Phaser进行分子置换来解析，其中输入模型基于先前确定的与UCB1478733结合的人TNFα、人TNFR1、Fab1979的结构和分开确定的分离的Fab1974结构。数据集成在XDS中并使用XSCALE 1进行缩放。初始结构确定和细化使用来自单晶的分辨率的数据。使用Coot 3和Phenix.Refine 2的迭代手动模型构建持续直到R和Rfree达到R＝0.201，Rfree＝0.259。使用Coot和MolProbity 4验证模型质量。最终数据处理和细化统计数据列于表1中。
4)参考文献
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数据收集和细化统计
6)结构讨论和附图
图11显示了结合人TNFα不对称三聚体、化合物(2)和2种人TNFR1受体的复合物的Fab1974的结构。
TNFα和Fab之间的主要接触是通过重链和被取代的TNFα单体A。重链CDR2和3与单体A的外表面形成接触，并且CDR3深深地突出到扭曲A/C受体结合位点的开口裂缝中。CDR3在该裂缝中的定位导致CA1974重链和TNFα单体C之间的唯一接触，其中在CDR3的Tyr103和单体C的Tyr115之间发生pi堆叠。
CA1974的轻链还与TNFα形成实质性接触，桥接扭曲的A/C受体结合裂缝。轻链CDR2仅与单体C接触，朝向裂缝的底部。只有CDR1的两个残基在裂缝的内表面上接触TNFα，一个结合单体C和另一个单体A。轻链CDR3仅与单体A缔合，与朝向裂缝顶部的残基相互作用。
图12显示了与图11相同的结构，但是在计算上模拟了对称三聚体(即在没有配体的情况下未扭曲的三聚体)。使用这种对称三聚体，三聚体的A链保留与Fab片段的相互作用。然而，Fab片段和三聚体的C链之间存在空间冲突。
实施例11——表位残基的鉴定
程序NCONT(CCP4晶体学套件的一部分)用于鉴定Fab1974和TNF不对称三聚体之间的残基，距离为来自该距离内的残基的TNFα中的任何原子被鉴定为表位残基。将表位定义为在抗原原子的 内的抗原原子是本领域常规的(参见例如Andersen et al(2006)，Protein Science，15,2258-2567)。
该实验确定的表位的结果如图13所示。以这种方式鉴定的TNFαA链上的残基是T77、T79、I83、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、E135、I136、N137和R138。以这种方式鉴定的TNFα的C链上的残基是L63、K65、Q67、P113、Y115、D143、A145、E146和Q149。残基编号基于SEQ ID NO：36(缺乏“S”克隆假象的可溶性人TNFα序列)。
鉴定了附近以内的以下额外的A链残基(也可能形成更宽的表位的一部分)：Q27、Q47、S81、Q88、Y119、R131和S133。鉴定了附近以内的以下额外C链残基(也可能形成更宽表位的一部分)：P117。同样，残基编号基于SEQ ID NO：36。这些4.0和残基总结在下表中，以及Fab 1974上的残基：
实施例12——评估1974作为靶标占用试剂
测试了CA1974检测与饱和水平的小分子预孵育的一系列不同重组人TNFα浓度的能力。通过将10μg/ml TNFα与1％(v/v)DMSO或10μM化合物(2)在0.1％(w/v)BSA/PBS中混合，实现TNFα与过量化合物的预孵育，得到相对于TNFα大约50倍摩尔过量的小分子抑制剂。
孵育过夜后，使用内部抗TNFα单克隆抗体，通过免疫沉淀将复合物稀释至已经耗尽内源性TNFα的人血浆中的浓度范围。使用夹心ELISA测量小分子结合的TNFα。将96孔ELISA板(Nunc)用PBS中的0.1μg/ml CA1974在4℃包被过夜。在洗涤缓冲液(0.05％(v/v)Tween-20/PBS)中洗涤三次后，将板在2％(w/v)BSA/PBS中在室温封闭至少1小时。将100μl的每种样品加载到封闭的ELISA板中，并在室温以200rpm振荡孵育30分钟。将板在洗涤缓冲液中洗涤3次，然后每孔加入100μl生物素化的抗TNFα检测抗体(BAF210，R&D Systems)，浓度为0.1μg/ml在1％(w/v)BSA/洗涤缓冲液中，在室温以200rpm振荡1小时。洗涤3次后，加入100μl/孔的100ng/ml链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP，Sigma)在1％BSA/洗涤缓冲液中，并在室温以200rpm振荡孵育45分钟。将板在洗涤缓冲液中洗涤3次，然后使用PerkinElmer的ELAST系统进行生物素-酪酰胺(B-T)扩增步骤以提供额外的扩增。将B-T溶液在ELAST缓冲液中以1:100稀释，每孔加入100μl，并将板在室温以200rpm振荡孵育恰好15分钟，然后在洗涤缓冲液中洗涤4次。与ELAST SA-HRP孵育，然后进行4次洗涤，每孔加入100μlTMB(双组分，KPL)。当达到适当的颜色变化时，通过每孔加入100μl的2.5M硫酸终止反应。使用具有Ascent软件版本2.6(Thermo)的Multiskan EX板读数器测量450nm处的吸光度。
为了确定在apoTNFα背景之上可以检测到TNFα+过量小分子抑制剂的浓度，将TNFα+DMSO OD结果的3个标准偏差加到这些值的平均值上。所有大于该值的TNFα+小分子加标结果被认为以至少为0.999的概率与apoTNFα显著不同。
从图14中可以看出，TNFα-小分子复合物可以在纯血浆中检测到25pg/ml及以上(概率至少为0.999)，并且没有观察到与apoTNFα的背景交叉反应性。这表明CA1974可能是用于测量复杂生物样品中靶标占据的有用试剂。
实施例13——化合物(1)结合直接固定化的或通过用CA1974捕获的人TNFα的单循 环动力学
对于单循环动力学，化合物(1)与直接固定化的TNFα或CA1974捕获的TNFα表面等离子体共振在25℃使用BIAcore T200(GE Healthcare)进行。将人TNFα拴在流动通道(Fc)2(～2000RU)上。通过胺偶联化学将CA1974IgG(>10,000个应答单位)拴系到固定化在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上的Fc3,4和Fc1空白上。使表面稳定在HBS-P缓冲液(10mMHEPES，pH7.4、0.15M NaCl、0.0005％(v/v)表面活性剂P20-GE Healthcare)+5％DMSO中，用作运行缓冲液。使人TNFα流过Fc4至～2,000RU的捕获水平。使化合物(1)以100μl/分钟流过所有四个流动池(1.875μM、3.75μM、7.5μM和30μM)。使用T200Evaluation软件(版本1.0)按照标准程序产生双参考背景扣除的结合曲线。结果如图15所示。
如所指出的，当通过构象选择性抗体CA1974捕获时，动力学从直接固定化的apo-TNF的“缓慢结合-缓慢解离”变为“快速结合-快速解离”。这表明抗体能够稳定另一种可能是开放的构象，这种构象可能有助于鉴定在正常情况下对熵不利的新化学物质。
有趣的是，尽管结构模型揭示了与apoTNFα的对称形式的主要侧链冲突(图12)，Biacore和SE-HPLC实验均表明CA1974能够与apoTNFα相互作用。相互作用的亲和力通常比用TNFα-小分子复合物观察到的亲和力低>100倍。SE-HPLC表明CA1974与apoTNFα的一小部分(21％)相互作用，并产生具有与1:1(Fab:apo TNFα三聚体)复合物一致的洗脱特征的复合物。总之，这些观察结果支持这样的假设：apo TNFα天然采用“开放”构象，其允许抗体识别而不是抗体结合对称分子上的部分表位。与Fab-TNFα-小分子复合物相比，SE-HPLC实验中存在的较低量的复合物和对apoTNFα的较低观察到的亲和力可能暗示这种“开放”构象是自然取样的，但仅存在于瞬时，并且apoTNFα的这形式比小分子稳定化形式的能量稳定性低得多，因此抗体相互作用受到损害。这些发现支持以前的分子动态模拟研究和使用自旋标记的TNFα的DEER实验得出的结论，该实验预测任何时候6％的三聚体采用自然取样的不对称开放状态。在SEC HPLC实验中CA1974的存在可能使构象取样的平衡朝向开放状态，增加不对称三聚体的百分比。
这突出了很少限定靶标蛋白采样构象的抗体如何通过使其他熵不利的化合物结合可以促进小分子片段的筛选(图15)，或作为‘传感器’来检测能够稳定化预定的非活性构象的新化学物质。相反，很少稳定化靶标蛋白采样构象的小分子可以增加识别诱导的新表位的抗体的产生。
序列表
SEQ ID NO:1(1974的LCDR1)
QASQDIGN
SEQ ID NO:2(1974的LCDR2)
GATSLAD
SEQ ID NO:3(1974的LCDR3)
LQGQSTPYT
SEQ ID NO:4(1974的HCDR1)
AYYMA
SEQ ID NO:5(1974的HCDR2)
ASINYDGANTFYRDSVKG
SEQ ID NO:6(1974的HCDR3)
EAYGYNSNWFGY
SEQ ID NO:7(1974的LCVR)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:8(1974的HCVR)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:9(1974的LCVR DNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCTGCCTGCATCCCCGGAAGAAATTGTCACCATCACATGCCAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCGCCTCAGCTCCTGATCTATGGTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGCCAGTAGATCTGGCACACAGTACTCTCTTAAGATCAGCAGACTGCAGGTTGAAGATTTTGGAATCTTTTACTGTCTACAGGGTCAAAGTACTCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA
SEQ ID NO:10(1974的HCVR DNA)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTGTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCGAGC
SEQ ID NO:11(1974LCκ全长)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:12(1974HC mIgG1全长)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:13(1974HC mFab无铰链，全长)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
SEQ ID NO:14(1974LC DNAκ全长)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCCTCCCTGCCTGCATCCCCGGAAGAAATTGTCACCATCACATGCCAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCGCCTCAGCTCCTGATCTATGGTGCAACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGCCAGTAGATCTGGCACACAGTACTCTCTTAAGATCAGCAGACTGCAGGTTGAAGATTTTGGAATCTTTTACTGTCTACAGGGTCAAAGTACTCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGTACGGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO:15(1974HC DNA mIgG1全长)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTGTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
SEQ ID NO:16(1974HC DNA mFab无铰链，全长)
GACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGCCTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAATTATGATGGTGCTAACACTTTCTATCGCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTGTCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTACAACAGAGGCTTACGGATATAACTCAAATTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTGCAATCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
SEQ ID NO:17(1979的LCDR2)
GTTSLAD
SEQ ID NO:18(1979的LCDR3)
LQAYSTPFTF
SEQ ID NO:19(1979的HCDR1)
NSYWD
SEQ ID NO:20(1979的HCDR2)
YINYSGSTGYNPSLKS
SEQ ID NO:21(1979的HCDR3)
GTYGYNAYHFDY
SEQ ID NO:22(1979的LCVR)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:23(1979的HCVR)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS
SEQ ID NO:24(1979的LCVR DNA)
GACATCCAAATGACACAGTCTCCTGCCTCCCTGTCTGCATCTCTGGAAGAAATTGTCACCATTACATGCCAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCACCTCCTGATCTATGGTACCACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGTACACAGTATTCTCTTAAGATCAGCGGACTACAGGTTGCAGATATTGGAATCTATGTCTGTCTACAGGCTTATAGTACTCCATTCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:25(1979的HCVR DNA)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAGTGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATTAGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATGGTCACAGTCTCGAGC
SEQ ID NO:26(1979LCκ全长)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:27(1979HC mIgG1全长)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:28(1979HC mFab无铰链，全长)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
SEQ ID NO:29(1979LC DNAκ全长)
GACATCCAAATGACACAGTCTCCTGCCTCCCTGTCTGCATCTCTGGAAGAAATTGTCACCATTACATGCCAGGCAAGCCAGGACATTGGTAATTGGTTATCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCACCTCCTGATCTATGGTACCACCAGCTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGTACACAGTATTCTCTTAAGATCAGCGGACTACAGGTTGCAGATATTGGAATCTATGTCTGTCTACAGGCTTATAGTACTCCATTCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAAATAAAACGTACGGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO:30(1979HC DNA mIgG1全长)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAGTGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATTAGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATGGTCACAGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
SEQ ID NO:31(1979HC DNA mFab无铰链，全长)
GAGGTGCACCTGGTGGAGTCTGGACCTGGCCTTGTGAAACCCTCACAGTCACTCTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGTTACTCCATCACTAATAGTTACTGGGACTGGATCCGGAAGTTCCCAGGAAATAAAATGGAGTGGATGGGATACATAAACTACAGTGGTAGCACTGGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATTAGTAGAGACACATCGAACAATCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACTCTATAACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGAGGGACCTATGGGTATAACGCCTACCACTTTGATTACTGGGGCCGAGGAGTCATGGTCACAGTCTCGAGTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTGCAATCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT
SEQ ID NO:32–大鼠TNFα
MSTESMIRDVELAEEALPKKMGGLQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPNKEEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQAEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLIYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVSLLSAIKSPCPKDTPEGAELKPWYEPMYLGGVFQLEKGDLLSAEVNLPKYLDITESGQVYFGVIAL
SEQ ID NO:33–小鼠TNFα
MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL
SEQ ID NO:34–人TNFα
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
SEQ ID NO:35–可溶形式的人TNFα
SVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
SEQ ID NO:36-可溶形式的人TNFα，但不包括SEQ ID NO：35的起始“S”，其是克隆假象VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
SEQ ID NO:37–具有N54D和C182S突变的人TNFR1的细胞外结构域(包括起始“G”，其是克隆假象)
GSVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN
SEQ ID NO:38–具有N54D和C182S突变的人TNFR1的细胞外结构域(包括起始“G”，其是克隆假象)
SVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN
序列表
<110> UCB生物制药私人有限公司
萨诺费公司
<120> 抗体表位
<130> N409657WO
<150> GB 1621907.3
<151> 2016-12-21
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的LCDR1
<400> 1
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的LCDR2
<400> 2
Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的LCDR3
<400> 3
Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的HCDR1
<400> 4
Ala Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的HCDR2
<400> 5
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的HCDR3
<400> 6
Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的LCVR
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的HCVR
<400> 8
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的LCVR DNA
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tcctgcctcc ctgcctgcat ccccggaaga aattgtcacc 60
atcacatgcc aggcaagcca ggacattggt aattggttat catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatcgc ctcagctcct gatctatggt gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagcg ccagtagatc tggcacacag tactctctta agatcagcag actgcaggtt 240
gaagattttg gaatctttta ctgtctacag ggtcaaagta ctccgtacac gtttggagct 300
gggaccaagc tggaactgaa a 321
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974的HCVR DNA
<400> 10
gacgtgcagc tggtggaatc tggaggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt gcctattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attaattatg atggtgctaa cactttctat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactgtc tccagagata atgcaagaag cagcctatac 240
ctacaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac aacagaggct 300
tacggatata actcaaattg gtttggttac tggggccaag gcactctggt cactgtctcg 360
agc 363
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 LCκ全长
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 12
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 HC mIgG1全长
<400> 12
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 HC mFab无铰链，全长
<400> 13
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210 215 220
<210> 14
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 LC DNAκ全长
<400> 14
gacatccaga tgacccagtc tcctgcctcc ctgcctgcat ccccggaaga aattgtcacc 60
atcacatgcc aggcaagcca ggacattggt aattggttat catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatcgc ctcagctcct gatctatggt gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagcg ccagtagatc tggcacacag tactctctta agatcagcag actgcaggtt 240
gaagattttg gaatctttta ctgtctacag ggtcaaagta ctccgtacac gtttggagct 300
gggaccaagc tggaactgaa acgtacggat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642
<210> 15
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 HC DNA mIgG1全长
<400> 15
gacgtgcagc tggtggaatc tggaggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt gcctattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attaattatg atggtgctaa cactttctat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactgtc tccagagata atgcaagaag cagcctatac 240
ctacaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac aacagaggct 300
tacggatata actcaaattg gtttggttac tggggccaag gcactctggt cactgtctcg 360
agtgccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020
ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320
cactctcctg gtaaa 1335
<210> 16
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1974 HC DNA mFab无铰链，全长
<400> 16
gacgtgcagc tggtggaatc tggaggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt gcctattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attaattatg atggtgctaa cactttctat 180
cgcgactccg tgaagggccg attcactgtc tccagagata atgcaagaag cagcctatac 240
ctacaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac aacagaggct 300
tacggatata actcaaattg gtttggttac tggggccaag gcactctggt cactgtctcg 360
agtgccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccggctgt cctgcaatct 540
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660
agggattgt 669
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的LCDR2
<400> 17
Gly Thr Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的LCDR3
<400> 18
Leu Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe
1 5 10
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的HCDR1
<400> 19
Asn Ser Tyr Trp Asp
1 5
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的HCDR2
<400> 20
Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的HCDR3
<400> 21
Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的LCVR
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Leu Gln Val
65 70 75 80
Ala Asp Ile Gly Ile Tyr Val Cys Leu Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的HCVR
<400> 23
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的LCVR DNA
<400> 24
gacatccaaa tgacacagtc tcctgcctcc ctgtctgcat ctctggaaga aattgtcacc 60
attacatgcc aggcaagcca ggacattggt aattggttat catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctcacctcct gatctatggt accaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtagatc tggtacacag tattctctta agatcagcgg actacaggtt 240
gcagatattg gaatctatgt ctgtctacag gcttatagta ctccattcac gttcggctca 300
gggacaaagc tggaaataaa a 321
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979的HCVR DNA
<400> 25
gaggtgcacc tggtggagtc tggacctggc cttgtgaaac cctcacagtc actctccctc 60
acctgttctg tcactggtta ctccatcact aatagttact gggactggat ccggaagttc 120
ccaggaaata aaatggagtg gatgggatac ataaactaca gtggtagcac tggctacaac 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccattagt agagacacat cgaacaatca gttcttcctg 240
cagctgaact ctataactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcacg agggacctat 300
gggtataacg cctaccactt tgattactgg ggccgaggag tcatggtcac agtctcgagc 360
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 LCκ全长
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Leu Gln Val
65 70 75 80
Ala Asp Ile Gly Ile Tyr Val Cys Leu Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 27
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 HC mIgG1全长
<400> 27
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 28
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 HC mFab无铰链，全长
<400> 28
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210 215 220
<210> 29
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 LC DNAκ全长
<400> 29
gacatccaaa tgacacagtc tcctgcctcc ctgtctgcat ctctggaaga aattgtcacc 60
attacatgcc aggcaagcca ggacattggt aattggttat catggtatca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctcacctcct gatctatggt accaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtagatc tggtacacag tattctctta agatcagcgg actacaggtt 240
gcagatattg gaatctatgt ctgtctacag gcttatagta ctccattcac gttcggctca 300
gggacaaagc tggaaataaa acgtacggat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642
<210> 30
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 HC DNA mIgG1全长
<400> 30
gaggtgcacc tggtggagtc tggacctggc cttgtgaaac cctcacagtc actctccctc 60
acctgttctg tcactggtta ctccatcact aatagttact gggactggat ccggaagttc 120
ccaggaaata aaatggagtg gatgggatac ataaactaca gtggtagcac tggctacaac 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccattagt agagacacat cgaacaatca gttcttcctg 240
cagctgaact ctataactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcacg agggacctat 300
gggtataacg cctaccactt tgattactgg ggccgaggag tcatggtcac agtctcgagt 360
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 420
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 480
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 540
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 600
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 660
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 720
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 780
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 840
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 900
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 960
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 1020
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 1080
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1140
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 1200
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1260
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1320
tctcctggta aa 1332
<210> 31
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1979 HC DNA mFab无铰链，全长
<400> 31
gaggtgcacc tggtggagtc tggacctggc cttgtgaaac cctcacagtc actctccctc 60
acctgttctg tcactggtta ctccatcact aatagttact gggactggat ccggaagttc 120
ccaggaaata aaatggagtg gatgggatac ataaactaca gtggtagcac tggctacaac 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccattagt agagacacat cgaacaatca gttcttcctg 240
cagctgaact ctataactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcacg agggacctat 300
gggtataacg cctaccactt tgattactgg ggccgaggag tcatggtcac agtctcgagt 360
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 420
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 480
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cggctgtcct gcaatctgac 540
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 600
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 660
gattgt 666
<210> 32
<211> 235
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 32
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Met Gly Gly Leu Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Asn Lys Glu Glu Lys Phe
50 55 60
Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu
65 70 75 80
Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
85 90 95
Ala Asn His Gln Ala Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala
100 105 110
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val
115 120 125
Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
130 135 140
Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg
145 150 155 160
Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Ser Leu Leu Ser Ala Ile Lys
165 170 175
Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp
180 185 190
Tyr Glu Pro Met Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
195 200 205
Leu Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Ile Thr Glu
210 215 220
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
225 230 235
<210> 33
<211> 235
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 33
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu
65 70 75 80
Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
85 90 95
Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala
100 105 110
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val
115 120 125
Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
130 135 140
Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg
145 150 155 160
Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys
165 170 175
Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp
180 185 190
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
195 200 205
Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
210 215 220
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
225 230 235
<210> 34
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 35
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Ser Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
1 5 10 15
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
20 25 30
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
35 40 45
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
50 55 60
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65 70 75 80
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
85 90 95
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
100 105 110
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
115 120 125
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
130 135 140
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 36
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 37
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N54D和C182S突变的人TNFR1的细胞外结构域
<400> 37
Gly Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asp Asn Ser
1 5 10 15
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
20 25 30
Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
35 40 45
Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
50 55 60
Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp
65 70 75 80
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
85 90 95
Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
100 105 110
Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys
115 120 125
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Ser Ser Asn
130 135 140
<210> 38
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N54D和C182S突变的人TNFR1的细胞外结构域
<400> 38
Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro
20 25 30
Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe
35 40 45
Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys
50 55 60
Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg
65 70 75 80
Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser
85 90 95
Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr
100 105 110
Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His
115 120 125
Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Ser Ser Asn
130 135 140

Claims (43)

1.结合表位的抗体，其包含三聚体TNFα的至少以下残基：
(a)Y115；
(b)Q149；和
(c)N137或K98，或两者；
其中Y115和Q149存在于三聚体TNFα的C链上，并且N137和K98存在于三聚体TNFα的A链上，并且其中残基编号是根据SEQ ID NO：36。
2.根据权利要求1所述的抗体，其结合还包含在三聚体TNFα的C链上的E146或在三聚体TNFα的C链上的P117，或E146和P117两者的表位。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其结合还包含A145的表位，该残基存在于三聚体TNFα的C链上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其结合还包含Q88的表位，该残基存在于TNFα的A链上。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其结合还包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)L63；
(b)L94；
(c)S95；和
(d)A96；
其中L63存在于三聚体TNFα的C链上，并且L94、S95和A96存在于三聚体TNFα的A链上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其结合还包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)I97；
(b)L93；和
(c)S81；
其中I97、L93和S81都存在于三聚体TNFα的A链上。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其结合还包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)K65；
(b)Q67；
(c)P113；
(d)D143；
(e)T77；
(f)T79；
(g)I83；
(h)T89；
(g)K90；
(i)V91；
(j)N92；
(k)E135；
(l)I136；和
(m)R138；
其中K65、Q67、P113和D143存在于三聚体TNFα的C链上，并且T77、T79、I83、T89、K90、V91、N92、E135、I136和R138存在于三聚体TNFα的A链上。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其结合还包含选自以下的一个或多个残基的表位：
(a)Y119；
(b)Q47；和
(c)S133；
其中Y119、Q47和S133全部存在于三聚体TNFα的A链上。
9.根据权利要求1所述的抗体，其结合包含SEQ ID NO：36的TNFα的以下残基的表位：
(a)T77、T79、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，以及K65、Q67、Y115、A145，E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；
(b)T77、T79、I83、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，以及L63、K65、Q67、P113、Y115、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；
(c)T77、T79、S81、I83、Q88、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，以及L63、K65、Q67、P113、Y115、P117、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上；或
(d)Q27、Q47、T77、T79、S81、I83、Q88、T89、K90、V91、N92、L93、L94、S95、A96、I97、K98、Y119、R131、S133、E135、I136、N137和R138，这些残基存在于三聚体TNFα的A链上，以及L63、K65、Q67、P113、Y115、P117、D143、A145、E146和Q149，这些残基存在于三聚体TNFα的C链上。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其具有1nM或更小的亲和力(KD-ab)。
11.根据权利要求10所述的抗体，其具有200pM或更小的亲和力。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其是人源化抗体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其是Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体或scFv。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其结合三聚体TNFα和化合物(1)-(7)中的任一种的复合物：
15.根据权利要求14所述的抗体，其对于三聚体-化合物复合物具有1nM或更小的亲和力(KD-ab)。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中亲和力为200pM或更小。
17.抗体，其与根据前述权利要求中任一项所定义的抗体竞争结合TNFα。
18.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体。
19.根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
20.药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体和药学上可接受的辅剂和/或载体。
21.根据权利要求1至17中任一项所定义的抗体作为靶标接合生物标志物的用途，用于检测从受试者获得的样品中的化合物-三聚体复合物；其中所述抗体是可检测的并且所述复合物包含三聚体TNFα和能够结合三聚体TNFα的化合物，由此化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导。
22.检测化合物与三聚体TNFα的靶标接合的方法，其中化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，所述方法包括：
(a)从施用所述化合物的受试者获得样品；
(b)将根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体与所述样品和对照样品接触，其中所述抗体是可检测的；
(c)确定所述可检测抗体与所述样品和所述对照样品的结合量，
其中所述可检测抗体与所述样品的结合大于所述可检测抗体与所述对照样品的结合表明所述化合物与所述三聚体TNFα的靶标接合。
23.根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体在筛选引发TNFα三聚体中构象变化的化合物中的用途，其中所述构象变化调控必需受体对三聚体TNFα结合的信号传导。
24.包含TNFα三聚体和与其结合的化合物的复合物，其中化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中所述复合物以1nM或更小的KD-ab与根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体结合。
25.能够结合TNFα三聚体以形成复合物的化合物，其中所述化合物-三聚体复合物结合必需受体并调控三聚体通过受体诱导的信号传导，其中所述化合物-三聚体复合物以1nM或更小的KD-ab与根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体结合。
26.鉴定能够结合TNFα三聚体并调控三聚体通过必需受体诱导的信号传导的化合物的方法，包括以下步骤：
(a)进行结合测定法以测量包含TNFα三聚体和测试化合物的测试化合物-三聚体复合物与根据权利要求1-17中任一项所定义的抗体的结合亲和力，所述抗体选择性地结合所述复合物；
(b)比较步骤(a)中测量的结合亲和力和已知以高亲和力结合步骤(a)中提到的抗体的不同化合物-三聚体复合物的结合亲和力；和
(c)如果根据步骤(b)中提到的比较考虑其测量的结合亲和力是可接受的，则选择步骤(a)的化合物-三聚体复合物中存在的化合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中与TNFα三聚体不存在的情况下结合化合物和/或在化合物不存在的情况下结合TNFα三聚体相比，抗体选择性结合TNFα三聚体-化合物复合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中抗体结合TNFα三聚体-化合物复合物，其KD-ab比在化合物不存在的情况下结合TNFα三聚体和/或在TNFα三聚体不存在的情况下结合化合物的KD-ab低至少100倍。
29.根据权利要求28所述的方法，其中抗体结合TNFα三聚体-化合物复合物，其KD-ab比在化合物不存在的情况下结合TNFα三聚体和/或在TNFα三聚体不存在的情况下结合化合物的KD-ab低至少200倍。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其是高通量测定法。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中与化合物不存在的情况下TNFα三聚体的稳定性相比，测试化合物增加TNFα三聚体的稳定性。
32.根据权利要求31所述的方法，其中稳定性的增加导致TNFα三聚体的热转变中点(Tm)增加至少1℃。
33.根据权利要求32所述的方法，其中稳定性的增加导致TNFα三聚体的热转变中点(Tm)增加至少10℃。
34.根据权利要求33所述的方法，其中TNFα三聚体的Tm的增加是10℃至20℃。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的方法，其中与在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体的结合亲和力相比，测试化合物增加TNFα三聚体对必需受体的结合亲和力。
36.根据权利要求35所述的方法，其中通过与对于在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体结合的结合速率(kon-r)和解离速率(koff-r)值相比增加kon-r和/或降低koff-r，测试化合物增加TNFα三聚体对必需受体的结合亲和力。
37.根据权利要求35所述的方法，其中通过与对于在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体结合的结合速率(kon-r)值相比增加kon-r，测试化合物增加TNFα三聚体对必需受体的结合亲和力。
38.根据权利要求35、36或37所述的方法，其中与在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体的KD-r相比，测试化合物降低TNFα三聚体对必需受体的KD-r，其中：
a)与在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体的KD-r相比，化合物降低TNFα三聚体对必需受体的KD-r至少10倍；
b)在化合物存在的情况下TNFα三聚体对必需受体结合的KD-r值小于10nM。
39.根据权利要求35、36或37所述的方法，其中与在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体的KD-r相比，测试化合物降低TNFα三聚体对必需受体的KD-r，其中：
a)与在化合物不存在的情况下TNFα三聚体对其受体的KD-r相比，化合物降低TNFα三聚体对必需受体的KD-r至少4倍；
b)在化合物存在的情况下TNFα三聚体对必需受体结合的KD-r值小于600pM。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在化合物存在的情况下TNFα三聚体与必需受体结合的KD-r值小于200pM。
41.根据权利要求26-40中任一项所述的方法，其中所述测试化合物具有的IC50值为500nM或更小。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的化合物选自化合物(1)-(7)，或者其盐或溶剂化物。
43.根据权利要求26-42中任一项所述的方法，其中受体是TNF受体。
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