CN110279727B - 一种沙棘三萜酸提取物及其制备方法 - Google Patents

一种沙棘三萜酸提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙棘三萜酸提取物及其制备方法，本发明采用柱层析的方法从沙棘果渣中得到沙棘三萜酸提取物，并通过试验证明其具有有效的护肝作用，安全性高，毒副作用小，更加全面挖掘了沙棘的药用价值，实现了废物利用，降低药物生产成本。

Description

一种沙棘三萜酸提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及沙棘中有效物质的提取领域，特别是涉及沙棘三萜酸提取物及其制备方法。
背景技术
沙棘(拉丁学名：Hippophae rhamnoides Linn.)，是一种胡颓子科、沙棘属落叶性灌木，其特性是耐旱、抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。中国西北部大量种植沙棘，用于沙漠绿化。
沙棘果实营养丰富，据测定其果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮、超氧化物等活性物质和人体所需的各种氨基酸。其中维生素C含量极高，每100克果汁中，维生素C含量可达到825～1100毫克，是猕猴桃的2～3倍，素有维生素C之王的美称。现被广泛应用于沙棘果汁、沙棘原浆液的生产，在生产过程中，将沙棘榨汁后会产生大量的沙棘果渣，往往会被当作废料丢弃，或生产成干粉当作饲料，价格非常低廉。倘若能更多的开发出沙棘果渣的利用价值，将具有极大的经济意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种沙棘三萜酸提取物及其制备方法，能够从沙棘果渣中提取出具有有效护肝作用的三萜酸提取物。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
提供一种沙棘三萜酸提取物的制备方法，包括下列内容：将沙棘浸膏通过硅胶进行柱层析，以石油醚以及以不同比例混合的石油醚和乙酸乙酯的混合液为流动相进行洗脱，其中，石油醚与乙酸乙酯混合体积比比例为(9～7)：(1～3)，收集洗脱液。
进一步地，所述柱层析依次采用如下洗脱剂：100％石油醚，石油醚:乙酸乙酯为9:1，石油醚:乙酸乙酯为8:2，石油醚:乙酸乙酯为7:3；由洗脱剂石油醚:乙酸乙酯为7:3洗脱得到的组分即为沙棘三萜酸提取物。
更进一步地，所述硅胶的规格为200～300目。
在本发明的具体实施方式中，每千克沙棘浸膏对应的各个梯度的洗脱剂用量为16～24L。
进一步地，每千克沙棘浸膏对应的各个梯度的洗脱剂用量均为20L。
在本发明的具体实施方式中，所述沙棘浸膏通过乙醇提取得到。
进一步地，所述乙醇为75％～95％的乙醇水溶液。
进一步地，所述提取操作的料液比为1:(10～15)kg/L，即为，每1kg沙棘原料，采用10～15L的乙醇或乙醇水溶液进行提取。
进一步地，所述提取的时间为每次1～3h，共提取2～3次。
进一步地，所述沙棘为沙棘果渣。
在本发明的具体实施方式中，所述柱层析采用干法上样。
进一步地，所述干法上样是将浸膏与硅胶按照质量比1:(1～3)混合。
进一步地，干法上样将浸膏与硅胶混合后，再干燥、研磨、过60目筛后，再上样。
进一步地，所述干燥的温度为不大于70℃。
在本发明的具体实施方式中，所述制备方法还包括下列内容：采用MCI微孔树脂对7:3石油醚和乙酸乙酯得到的组分进行了除杂处理。
进一步地，所述除杂处理是将7:3石油醚和乙酸乙酯得到的组分用无水乙醇溶解后，通过MCI微孔树脂用100％乙醇进行洗脱。
本发明还提供了沙棘三萜酸提取物在制备保护肝脏的产品中的用途。
本发明还提供了沙棘三萜酸提取物在制备谷丙转氨酶调节剂、谷草转氨酶调节剂、SOD激动剂、CAT激动剂中的用途。
本发明还提供了一种组合物，包括质量含量50％以上的沙棘三萜酸提取物。
进一步地，包括质量含量70％以上的沙棘三萜酸提取物。
本发明还提供了上述的组合物在制备保护肝脏的产品中的用途。
进一步地，所述产品为谷丙转氨酶调节剂、谷草转氨酶调节剂、SOD激动剂、CAT激动剂中的一种或几种。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过柱层析梯度洗脱，可以从废弃的沙棘果渣中提取出沙棘三萜酸提取物，实现了废物利用，变废为宝。
(2)本发明通过试验证明本发明提取得到的沙棘三萜酸提取物具有护肝作用，安全有效，更加全面挖掘了沙棘的药用价值、拓展了其临床应用，为开发治疗肝脏疾病的潜在植物来源的药物提供更多的参考依据。
(3)本发明使用沙棘成品产品加工过程中产生的废弃物沙棘果渣作为原料，得到具有保护肝脏作用的提取物，可有效的降低药物的成本。
附图说明
图1是不同实验组小鼠喂养期间的体重变化量；
图2是不同实验组小鼠心脏系数；
图3是不同实验组小鼠肝脏系数；
图4是不同实验组小鼠脾脏系数；
图5是不同实验组小鼠肾脏系数；
图6是不同实验组小鼠血清中ALT；
图7是不同实验组小鼠血清中AST；
图8是不同实验组小鼠血清中SOD活力；
图9是不同实验组小鼠血清中CAT。
图中：NG:正常组；MG:模型组；PG：阳性对照组；HRL：沙棘低剂量组；HRM：沙棘中剂量组；HRH：沙棘高剂量组；
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取沙棘果渣5kg，95％乙醇在中药煎药机中进行提取，每次2h，料液比为1:10kg/L，共提取3次，合并3次提取液减压浓缩后得到浸膏约500g。将所获得的浸膏与200～300目硅胶按照质量比1:2混合后进行拌样，放入55℃烘箱中烘干后于研钵中研磨，过60目筛，干法上样过硅胶柱。分别采用100％石油醚、9:1石油醚:乙酸乙酯，8:2石油醚:乙酸乙酯，7:3石油醚:乙酸乙酯，6:4石油醚:乙酸乙酯，5:5石油醚:乙酸乙酯，4:6石油醚:乙酸乙酯，3:7石油醚:乙酸乙酯，2:8石油醚:乙酸乙酯，1:9石油醚:乙酸乙酯，100％乙酸乙酯，进行冲柱处理。各个梯度的洗脱体积为10L。将齐墩果酸作为标准品与所分离得到的组分一起点样结果发现，三萜酸部位主要集中在7:3石油醚和乙酸乙酯部位。
将所获得7:3石油醚:乙酸乙酯部位用无水乙醇溶解后，上MCI微孔树脂进行除杂，用100％乙醇体系进行洗脱，洗脱液处理后得到14.5g样品作为目标样品应用后续的动物实验中。
下面通过试验例证明本发明沙棘三萜酸提取物的护肝效果。
试验例1
一、材料
试验动物：清洁级小鼠72只，雄性和雌性各半，体重(20±2g)，均自由进食、饮水。
实验药品：沙棘三萜酸提取物、水飞蓟素(美仑生物)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒：购买于南京建成生物工程研究所，四氯化碳(CCl4)、花生油、生理盐水等。
其它：1mL注射器、灌胃针、秒表、试管、手术刀、剪子等。
二、试验方法
1、统计学方法
本实验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，数据均以X(—)±SD表示，检验水准p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
2、动物试验
2.1动物分组及适应性饲养
将72只小鼠雌性雄各半随机分为6组，即正常对照组(NG)，模型组(MG)、阳性对照组(PG)、沙棘三萜酸低剂量组(HRL)(100mg/kg)、中剂量(HRM)(200mg/kg)、高剂量组(HRH)(400mg/kg)，每组6只，进行一周的适应性饲养，饲养环境适宜，通风，安静，温度为18～25℃，湿度为35％～50％，每日光照12h，换气次数大于10h每次，雌雄分养，每隔2d换一次垫料，自由饮水，每日颗粒饲料喂养。
通过图1结果显示，在整个小鼠饲养的30天内，各组实验小鼠的体重在试验期间都有明显增长的趋势，与正常对照组比较，模型组小鼠体重未见明显差异(p>0.05)；与模型组比较，阳性对照组、沙棘三萜酸各剂量组的体重未见明显差异(p>0.05)。
2.2动物给药
在试验期间正常对照组和模型组均给予一定剂量的NaCl溶液(0.9％)，阳性药组给予水飞蓟素溶液(200mg/kg)，三个剂量组分别给予沙棘三萜酸低(100mg/kg)、中(200mg/kg)和高(400mg/kg)浓度，每日进行一次灌胃，灌胃体积为0.5mL，各组连续灌胃给药21d，各组均自由进食、饮水。实验过程中小鼠定期称重量。每3d测1次。具体如下：
(1)阳性药物的配制：称取水飞蓟素80.00mg，用10mL吐温80(0.1％)进行溶解。
(2)沙棘三萜酸提取物溶液的配制：称取沙棘三萜酸提取物320mg，加入20mL蒸馏水进行溶解，即得高剂量组溶剂，中剂量组由高剂量组稀释两倍(从高剂量组吸取10mL溶液加入10mL蒸馏水)，低剂量组由中剂量组稀释两倍(从中剂量组吸取10mL溶液加入10mL蒸馏水)。
2.3CCl4急性肝损伤模型的建立
本实验在末次给药2h后，除正常组外，其余5个组分别一次性腹腔注射0.10％的CC14花生油10mL/kg，诱导急性化学性肝损伤，正常对照组腹腔注射同剂量的花生油，然后禁食不禁水，16h后通过眼球取血，获得血清，然后脱臼处死小鼠，同时立即剖腹取心脏、肝脏、脾脏和肾脏，然后用0.9％的NaCl溶液冲洗器官中残血，滤纸拭干，称质量，计算器官系数。其中：
脏器系数＝脏器重量/小鼠重量
通过图2～5可以看出，模型组小鼠注射CCl4后肝脏系数极显著的增高(p<0.01)，而沙棘三萜酸低剂量组可显著的降低肝脏系数(p<0.05),中、高剂量组可极显著的降低肝脏系数(p<0.01)。而其各小组之间心脏系数、脾脏系数、肾脏系数差别不大，在统计学上无显著性差异。
2.4小鼠血清采集及制备
小鼠眼球取血，然后3000r/min离心10min，取上清液保存备用。
2.5小鼠血清中各项指标检测
小鼠血清中ALT、AST、SOD和CAT酶的活性均按照所购买的试剂盒的方法进行操作，用酶标仪测定，对照标准曲线得其含量。
根据图6、图7所示，与正常对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST水平明显升高(p<0.01)，表明CCl4急性化学性肝损伤造模成功。而各剂量组与模型组比较，ALT均有所下降，其中阳性对照组、沙棘三萜酸中高剂量组与模型组相比差异极显著(p<0.01)。AST也是均有所下降，其中阳性对照组、沙棘三萜酸中和高剂量组差异极显著(p<0.01),其低剂量组差异显著(p<0.05)，表明沙棘三萜酸对小鼠肝损伤有保护作用。
根据图8、图9所示，CCl4致小鼠急性肝损伤后，SOD活性降低，模型组与正常对照组相比较，差异极显著(p<0.01)；而各剂量组与模型组比较，SOD活性均升高，差异极显著(p<0.01)，与低剂量组比较，中、高剂量组的活性依次升高，呈现一定的量效关系，说明了一定的剂量依赖性。另外，与模型组相比，沙棘三萜酸组的CAT活性均明显升高，与模型组相比，低剂量组表现出显著性差异，而阳性对照组、沙棘三萜酸中和高剂量组与模型组相比差异极显著(p<0.01)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种用于保护肝脏的沙棘三萜酸提取物的制备方法，其特征在于，包括下列内容：将沙棘浸膏通过硅胶进行柱层析，以石油醚以及以不同比例混合的石油醚和乙酸乙酯的混合液为流动相进行洗脱，依次采用如下洗脱剂：100％石油醚，石油醚:乙酸乙酯为9:1，石油醚:乙酸乙酯为8:2，石油醚:乙酸乙酯为7:3；由洗脱剂石油醚:乙酸乙酯为7:3洗脱得到的组分，采用MCI微孔树脂进行除杂处理后，即为沙棘三萜酸提取物；
其中，所述沙棘为沙棘果渣，所述沙棘浸膏为沙棘果渣通过75％～95％的乙醇水溶液提取得到；
所述除杂处理是将7:3石油醚和乙酸乙酯得到的组分用无水乙醇溶解后，通过MCI微孔树脂用100％乙醇进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的沙棘三萜酸提取物的制备方法，其特征在于，每千克沙棘浸膏对应的各个梯度的洗脱剂用量为16～24L。
3.根据权利要求2所述的沙棘三萜酸提取物的制备方法，其特征在于，每千克沙棘浸膏对应的各个梯度的洗脱剂用量均为20L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取操作的料液比为1:(10～15)kg/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述提取的时间为每次1～3h，共提取2～3次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析采用干法上样，所述干法上样是将浸膏与硅胶按照质量比1:(1～3)混合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，干法上样将浸膏与硅胶混合后，再干燥、研磨、过60目筛后，再上样。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述干燥的温度为不大于70℃。
9.权利要求1-8任意一项所述方法得到的沙棘三萜酸提取物在制备保护肝脏的产品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述产品为谷丙转氨酶调节剂、谷草转氨酶调节剂、SOD激动剂、CAT激动剂中的任一种。
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GR01 Patent grant
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