CN105056091A - 一种小豆蔻提取物、含其制剂及治疗肥胖的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小豆蔻提取物、含其制剂及治疗肥胖的用途，属于中药领域，具体涉及一种小豆蔻提取物及含有该提取物的药物制剂，该小豆蔻提取物可以用来制备预防或治疗肥胖症的药物。本发明通过在小豆蔻药材中加入少量陈皮药材，经过提取、除杂、富集活性组分，使最终制得的提取物具有明显的治疗肥胖的作用，比单独用小豆蔻药材提取具有意想不到的效果。本发明基于充分、合理的试验设计，通过选择合适浓度的乙醇水溶液进行提取、除杂和富集，能获得治疗作用显著的小豆蔻提取物。本发明还提供了合适的液相分析方法，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批件差异。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种小豆蔻提取物及含有该提取物的药物制剂，该小豆蔻提取物可以用来制备预防或治疗肥胖症的药物。
背景技术
植物小豆蔻为多年生草本。根茎粗壮，棕红色。叶两列，叶片狭长披针状，叶鞘具棕黄色柔毛。穗状花序由茎基部抽出。花序显著伸长，花排列稀疏，花冠白色。果实长卵圆形，果皮质韧，不易开裂。种子团分3瓣，每瓣种子5～9枚，种子气味芳香而峻烈。主产越南、斯里兰卡和印度南部的马拉巴(Malabar)海岸。实成熟时收采，除去残留的果柄，晒干。使用部分为姜科植物小豆蔻的干燥果实。
药材小豆蔻为姜科植物小豆蔻Elettariacardamomum(L.)Maton的干燥近成熟果实，是藏医与维吾尔医用药，以“加素”之名始载于《四部医典》，现被多国药典收载。小豆蔻是世界著名的植物药与香料，被称为“香料之后”，原产于印度南部、斯里兰卡及瓜地马拉等地，在印度传统医学中使用历史超过两千年，具有祛风、健胃的功效。目前中医很少使用，小豆蔻曾以“豆蔻”之名收载于1953年版中国药典。
小豆蔻已报道的成分主要为挥发油，以及多糖与蛋白质，推测还含有黄酮类化合物，但目前尚未见黄酮类成分单体的分离与鉴定。挥发油是小豆蔻中重要的活性成分，含量高达7％，超声提取得到的挥发油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯为主，与超临界CO2提取所得成分类似；如以正己烷提取，挥发油组分有所不同，为柠檬烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，还含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香桧烯等。
小豆蔻药理活性多样，尤以抗肿瘤活性报道最多，涉及皮肤、肺、结肠等多个部位的肿瘤，对胃肠道也有较好的保护作用，此外，还具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小豆蔻提取物，该提取物的制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备预防或治疗肥胖症药物的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种小豆蔻提取物，该提取物由以下方法制备：
步骤一：小豆蔻药材和重量为小豆蔻药材0.05～0.09倍的陈皮药材混合粉碎；
步骤二：将粉碎的药材用浓度为60％～85％的乙醇水溶液热回流提取2～3小时，提取2～3次，每次乙醇水溶液体积为小豆蔻药材重量3～5倍；
步骤三：将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用30％～40％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用65％～85％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将65％～85％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
优选地，所述制备方法中陈皮药材重量为小豆蔻药材重量的0.06～0.08倍。
优选地，所述制备方法中步骤二所述乙醇水溶液为75％的乙醇水溶液。
优选地，所述物制备方法中步骤三用于除杂的乙醇为35％乙醇。
优选地，所述制备方法中步骤三用于富集活性组分的乙醇为70％乙醇。
为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同产地、批次药材制备的小豆蔻提取物质量，所述提取物的液相分析方法为：
色谱柱：AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至5.5)；
梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：230nm；柱温：25℃；进样量：10μL。
药物制剂，含有治疗有效量的所述小豆蔻提取物和药学上可接受的载体。
所述小豆蔻提取物在制备预防或治疗肥胖症药物中的应用。
本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
所述药物制剂含有治疗有效量的本发明小豆蔻提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
本发明的优点：本发明通过在小豆蔻药材中加入少量陈皮药材，使最终制得的提取物具有明显的治疗肥胖的作用，比单独用小豆蔻药材提取具有意想不到的效果；本发明基于充分、合理的试验设计，通过选择合适浓度的乙醇水溶液进行提取、除杂和富集，能获得治疗作用显著的小豆蔻提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的质量。
附图说明
图1为提取物HPLC液相图谱。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
主要试剂和材料：小豆蔻药材和陈皮药材购自安徽亳州中药材市场；食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级D101大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；85％磷酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。
实施例1：陈皮药材量为小豆蔻重量0.05倍
取10kg小豆蔻药材和0.5kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例2：陈皮药材量为小豆蔻重量0.06倍
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例3：陈皮药材量为小豆蔻重量0.08倍
取10kg小豆蔻药材和0.8kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例4：陈皮药材量为小豆蔻重量0.09倍
取10kg小豆蔻药材和0.9kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例5：步骤二用60％乙醇水溶液提取
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为60％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例6：步骤二用85％乙醇水溶液提取
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为85％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例7：步骤三除杂用30％乙醇
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用30％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例8：步骤三除杂用40％乙醇
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用40％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例9：步骤三富集用65％乙醇
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用65％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将65％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例10：步骤三富集用85％乙醇
取10kg小豆蔻药材和0.6kg陈皮药材混合粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用85％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将85％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例11：对比实施例(不加陈皮)
取10kg小豆蔻药材粉碎；用浓度为75％的乙醇水溶液热回流提取3次，第一次用50L提取3小时，第二、三次用30L提取2小时；将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用35％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用70％乙醇富集，洗脱至洗脱液无色，将70％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
实施例12：液相色谱分析
供试品溶液配制：取实施例2方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL20％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加20％乙腈水溶液定容。
分析方法：
高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；
色谱柱：AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至5.5)；
梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：230nm；柱温：25℃；进样量10μL。
对用10批不同产地、批次小豆蔻和陈皮制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹配，结果1～9号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定9个峰为共有指纹峰，据此建立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。
实施例13：片剂的制备
按实施例2方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例14：口服液的制备
按实施例2方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。
实施例15：胶囊剂或颗粒剂的制备
按实施例2方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例16：注射液的制备
按实施例2方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例17：无菌粉针的制备
按实施例2方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例18：小豆蔻提取物对胰脂肪酶的抑制活性测定
首先底物p-Nitrophenylacetate(sigma公司)用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)配成1.35M；猪胰脂肪酶(sigma公司)用磷酸缓冲液配成10mg/mL；将根据实施例2的方法制得的小豆蔻提取物用磷酸缓冲液配制成不同浓度的溶液。然后在96孔板中依次加入50μL稀释20倍后的酶溶液、40μL稀释1000倍后的底物溶液以及10μL不同浓度的受试样品，混匀。25℃下反应20分钟，每隔2分钟在405nm下检测每孔的吸光度。
根据在405nm下的吸光度计算受试样品对胰脂肪酶的抑制率(％)，以蒸馏水为对照，将酶活性抑制率(％)达到50％时抑制剂的浓度测定为IC50值。抑制率(％)根据下式计算：
抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％
上式中，A表示反应后空白孔在405nm下的吸光度，B表示反应前空白孔在405nm下的吸光度，C表示反应后样品孔在405nm下的吸光度，D表示反应前样品孔在405nm下的吸光度。
检测小豆蔻提取物对胰脂肪酶的抑制作用结果，IC50为10.65±0.139μg/mL，表明小豆蔻提取物对胰脂肪酶具有显著的抑制作用。
实施例19：小豆蔻提取物对肥胖大鼠的减肥作用
Zucker大鼠(遗传性肥胖大鼠)由中国科学院上海药物所动物房繁殖，雄性，8周龄。取正常Zucker大鼠6只，作为空白对照组。将肥胖Zucker大鼠分成12组，即模型对照组、小豆蔻提取物组(共10组)和对比实施例组，每组6只。将根据实施例2的方法制得的小豆蔻提取物用0.5％CMC-Na助溶，剂量为1g/kg；空白和模型对照组给予同等体积的0.5％CMC-Na，口服灌胃给药二周。定期检测饮食和体重。结果见表1。
表1小豆蔻提取物对Zucker大鼠体重和饮食的影响(±SE)
与模型对照组相比，**P＜0.05。
结论：从表1可以看出，与模型对照组相比，本发明小豆蔻提取物组大鼠体重增加明显下降，对饮食没有显著性影响，而且大鼠粪便正常。
脂肪摄入过多可能导致肥胖以及与肥胖相关的糖尿病、高脂血症、脂肪肝等代谢失调性疾病。抑制胰脂肪酶可以抑制脂肪在小肠的分解，从而抑制脂肪的吸收。小豆蔻提取物作为胰脂肪酶抑制剂，并具有减肥作用，可用于预防或治疗肥胖症等疾病。
Claims (8)
1.一种小豆蔻提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：
步骤一：小豆蔻药材和重量为小豆蔻药材0.05～0.09倍的陈皮药材混合粉碎；
步骤二：将粉碎的药材用浓度为60％～85％的乙醇水溶液热回流提取2～3小时，提取2～3次，每次乙醇水溶液体积为小豆蔻药材重量3～5倍；
步骤三：将所得提取液浓缩至无醇味，用D101型大孔树脂富集，先用30％～40％乙醇除杂，洗脱至洗脱液无色，再用65％～85％乙醇富集活性部分，洗脱至洗脱液无色，将65％～85％乙醇洗脱液浓缩，喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：陈皮药材重量为小豆蔻药材重量的0.06～0.08倍。
3.根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：步骤二所述乙醇水溶液为75％的乙醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：步骤三用于除杂的乙醇为35％乙醇。
5.根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：步骤三用于富集活性组分的乙醇为70％乙醇。
6.根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：
色谱柱：AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至5.5)；
梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：230nm；柱温：25℃；进样量：10μL。
7.药物制剂，其特征在于：所述制剂含有治疗有效量的权利要求1所述的小豆蔻提取物和药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的小豆蔻提取物在制备预防或治疗肥胖药物中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151118 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |