CN110272547B - 一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法。首先制备普通丝素蛋白溶液与结晶的丝素蛋白颗粒溶液，然后将结晶丝素蛋白颗粒溶液与特定浓度的普通丝素蛋白溶液混合，静置，即可获得丝素蛋白触变性凝胶。本技术可通过改变丝素蛋白溶液浓度、结晶丝素蛋白颗粒溶液浓度，二者的混合比例，处理温度等参数来控制水凝胶的成胶时间、透光度等。本发明所述制备过程温和，无需任何交联剂等毒性有机试剂，制备条件绿色可控，便于大批量制备，无任何废弃残余物，绿色无污染，易于产业化。

Description

一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种触变性凝胶及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，不需要有机溶剂或其他添加物，制备具有可逆、可循环利用的凝胶的制备技术。
背景技术
组织工程是解决临床上器官缺损问题的一个有潜力的可能途径。组织工程是在人工构建的支架材料上接种并培养细胞，使之在生长因子等营养物质的作用下再生活的组织或器官，用于修复或替代受损伤组织或器官的功能。选择合适的支架材料对于组织工程技术具有重要的意义。
丝素蛋白作为一种天然蛋白质材料，不仅提纯加工方便，而且有着良好的生物相容性、生物可降解速度及可调控的理化性质，这使得这种材料作为一种组织修复支架材料获得研究者的广泛关注。
丝素蛋白水凝胶具有类似细胞外基质的结构，是一种较为理想的组织修复材料。丝素蛋白水凝胶的制备方法有多种途径，如超声处理，添加聚乙烯醇等多元醇、十二烷基硫酸钠等表面活性剂诱导，涡旋、电荷诱导以及温度处理等。但是，这些方法制备的凝胶都是单向转变的不可逆体系。相对于普通的水凝胶，具有可注射性的触变性水凝胶体系能够在缺损处原位成形，在不规则缺损的修复上具有突出的优势。
当前，以丝素蛋白可注射性凝胶的制备已有报道，例如：
(1)公开号为CN106243366A的中国发明专利“一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法”中，需要将丝素蛋白溶液浇注于模具中，并于恒温恒湿条件下进行平衡干燥，获得丝素蛋白固化物，然后将固化物溶于水，在经过离心后将上清液高温孵育处理，得到丝素蛋白触变性水凝胶。溶液成胶前的高温处理不利于生物活性分子的负载。
(2)公开号为CN103289107的中国发明专利“一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用”中，公布了一种丝素蛋白可注射水凝胶的制备方法，该方法需要将有机醇和丝素蛋白溶液混合，然后在短时间内形成凝胶。而且有机醇的使用会对材料的生物相容性带来负面影响，且不能负载蛋白类活性分子。
制备条件温和，生物相容性良好的丝素蛋白触变性水凝胶的制备仍需进一步探索。
发明内容
，本发明鉴于现有技术存在的不足提供一种无需有机溶剂、高温等极性环境处理，生物相容性好，且制备效率高的丝素蛋白触变性水凝胶的制备方法。
本发明的技术方案步骤如下：
步骤(1)按常规方法制备丝素蛋白水溶液，将得到的溶液进行结晶化处理，得到结晶型丝素蛋白颗粒溶液；
步骤(2)将普通丝素蛋白溶液用去离子水稀释处理，蛋白质量分数不高于1.5％；
步骤(3)将结晶型丝素蛋白颗粒溶液与步骤(2)得到的普通丝素蛋白溶液共混，共混后蛋白质量分数不高于1.5％，普通丝素蛋白占总蛋白的含量低于99％，在0-100℃的条件下，静置0～96小时，得到丝素蛋白触变性凝胶。
作为优选，步骤(1)中常规方法制备丝素蛋白水溶液的具体方法为：蚕丝与碳酸钠溶液按浴比1:100～1:500，将剪碎的蚕丝在浓度为0.01～0.5％w/v的碳酸钠溶液中微沸蒸煮20～60min，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，将脱胶后的蚕丝于50～80℃下烘干以上，并于40～80℃下按浴比9:100～30:100，溶于溴化锂溶液中，溶解后采用去离子水透析3d以上，得到的丝素蛋白溶液。
作为优选，步骤(1)中，将得到的溶液进行结晶化处理，处理方法包括：调节溶液pH至等电点；或将溶液成膜后再溶解，反复3次以上；或将溶液浓缩后在用去离子水稀释并高温孵育。
作为优选，步骤(1)中，结晶型丝素蛋白颗粒溶液中的蛋白二级结构为β折叠。
本发明具有以下明显优点：
(1)可在短时间内形成丝素蛋白触变性水凝胶，时间可以短至几分钟，大大增加了制备丝素蛋白触变性水凝胶的工作效率。
(2)由于本发明在制备过程是利用丝蛋白的自组装行为，改变丝素蛋白的构象，形成水凝胶网络，整个制备过程不需添加任何化学交联剂，无毒副作用，不污染环境，不会引起丝素蛋白支架生物相容性降低。
(3)由于本发明所制备的丝素蛋白触变性水凝胶经超声处理后可转变成结晶型丝素蛋白颗粒溶液，该溶液与普通丝素蛋白溶液混合后可再次制备得到丝素蛋白触变性水凝胶。因此，本发明所述方法中丝素蛋白触变性水凝胶具有循环利用性，一旦制成，后续操作极为简单。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法的流程图。
图2是实施例二所述的丝素蛋白触变性凝胶的光学图像。
图3是实施例四所述的丝素蛋白触变性凝胶超声后所得溶液的圆二色(CD)曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述：
实施例一：
制备丝素蛋白溶液。具体为：将60g蚕丝在0.02M的Na2CO3溶液中100℃煮30min,以去除蚕丝外部的丝胶蛋白，使用去离子水冲洗，重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝30g溶解于100mL浓度为9.3mol/L LiBr溶液中，60℃下溶解处理4小时。然后用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天，期间每两小时换一次水，去除溶液中的LiBr，从而得到纯净的丝素蛋白溶液。
用稀盐酸将丝素溶液的pH调整至4.0附近，用去离子水稀释到1％，在烘箱中放置24h，然后用超声细胞粉碎仪超声30s，得到结晶型丝素蛋白溶液。
将普通丝素蛋白溶液稀释到1％，然后将其与上述结晶型丝素蛋白溶液在室温下以1:1的体积比混合，30min后得到丝素蛋白触变性凝胶。
请参见图2，图2是实施例一所述的丝素蛋白触变性凝胶的光学图像。从图2可见，该凝胶透明度极高。
实施例二：
采用与实施例一相同的方法制备纯净丝素蛋白溶液。
将丝素溶液在60℃条件下浓缩48小时后，用去离子水稀释到1％，在烘箱中放置24h，然后用超声细胞粉碎仪超声30s，得到结晶型丝素蛋白溶液。
将普通丝素蛋白溶液稀释到1％，然后将其与上述丝素蛋白纳米纤维溶液在室温下以1:10的体积比混合，1h后得到丝素蛋白触变性凝胶。
请参见图2，图2是实施例一所述的丝素蛋白触变性凝胶的光学图像。从图2可见，该凝胶透明度极高。
实施例三：
采用与实施例二相同的方法制备纯净丝素蛋白溶液与丝素蛋白纳米纤维溶液。
将普通丝素蛋白溶液稀释到1.5％，然后将其与上述丝素蛋白纳米纤维溶液以90:1的体积比混合，在0℃条件下静置，96小时后得到丝素蛋白触变性凝胶。
实施例四：
采用与实施例二相同的方法制备丝素蛋白触变性凝胶。
将凝胶超声30s得到丝素蛋白纳米纤维溶液，将该溶液与1％的普通丝素蛋白溶液室温下以1:1的体积比混合，30min后得到丝素蛋白触变性凝胶。
请参见图3，图3是丝素蛋白触变性凝胶超声后所得溶液的圆二色(CD)曲线，溶液中丝素蛋白显示为β-sheet结构。
实施例五：
采用与实施例二相同的方法制备丝素蛋白触变性凝胶。
将凝胶超声30s得到丝素蛋白纳米纤维溶液，将该溶液与1％的普通丝素蛋白溶液60℃条件下以1:1的体积比混合，10min内得到丝素蛋白触变性凝胶，表明降凝胶超声所得到丝素蛋白纳米纤维溶液可代替实施例一步骤中所用方法制备的溶液，本发明所述方法是一种可逐级放大凝胶产量的方法。
实施例六：
采用与实施例一相同的方法制备纯净丝素蛋白溶液。
将丝素溶液在60℃条件下浓缩48小时后，用去离子水稀释到1.5％，在烘箱中放置24h，然后用超声细胞粉碎仪超声60s，得到结晶型丝素蛋白溶液。
将普通丝素蛋白溶液稀释到1％，然后将其与上述丝素蛋白纳米纤维溶液以1:10的体积比混合，100℃条件下静置10s后得到丝素蛋白触变性凝胶。
综上所述，本发明通过简单的温度与浓度的调控制备丝素蛋白触变性凝胶。利用丝蛋白的自组装行为，改变丝素蛋白的二级结构及蛋白形态。本发明在制备过程不需添加任何化学试剂，无毒副作用，不会引起丝素蛋白支架生物相容性降低。并且本发明可以在制备过程中，通过调节丝素蛋白溶液浓度、丝素蛋白纳米纤维浓度，二者的混合比例，处理温度等参数调控水凝胶的成胶时间，满足不同组织修复的需要。

Claims (4)

1.一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：
步骤(1)按常规方法制备丝素蛋白水溶液，将得到的溶液进行结晶化处理，得到结晶型丝素蛋白颗粒溶液；
步骤(2)将普通丝素蛋白溶液用去离子水稀释处理，蛋白质量分数不高于1.5％；
步骤(3)将结晶型丝素蛋白颗粒溶液与步骤(2)得到的普通丝素蛋白溶液共混，共混后蛋白质量分数不高于1.5％，普通丝素蛋白占总蛋白的含量低于99％，在0-100℃的条件下，静置10分钟～96小时，得到丝素蛋白触变性凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中常规方法制备丝素蛋白水溶液的具体方法为：蚕丝与碳酸钠溶液按浴比1:100～1:500，将剪碎的蚕丝在浓度为0.01～0.5％w/v的碳酸钠溶液中微沸蒸煮20～60min，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，将脱胶后的蚕丝于50～80℃下烘干以上，并于40～80℃下按浴比9:100～30:100，溶于溴化锂溶液中，溶解后采用去离子水透析3d以上，得到的丝素蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将得到的溶液进行结晶化处理，处理方法包括：调节溶液pH至等电点；或将溶液成膜后再溶解，反复3次以上；或将溶液浓缩后再用去离子水稀释并高温孵育。
4.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白触变性凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，结晶型丝素蛋白颗粒溶液中的蛋白二级结构为β折叠。
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