CN110234771A - 单光源双光通道测序 - Google Patents

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Abstract

公开了用于测定多核苷酸的核苷酸序列的系统。所述系统可以包括配置成生成预定波长的光的光源，诸如激光器或LED。所述系统的检测器可以检测在第一波长和第二波长处的荧光发射。如果至少一个检测器没有检测到荧光发射，则所述系统的处理器将核苷酸鉴定为第一类型；如果至少一个检测器检测到光在第一波长处的荧光发射，则将核苷酸鉴定为第二类型；如果至少一个检测器检测到光在第二波长处的荧光发射，则将核苷酸鉴定为第三类型；和如果至少一个检测器检测到光在第一波长和第二波长处的荧光发射，则将核苷酸鉴定为第四类型。

Description

单光源双光通道测序
相关申请
本申请要求2017年3月7日提交的美国临时申请第62/468242号的优先权。该相关申请的内容通过引用整体并入本文。
背景
领域
本公开总的来说涉及DNA测序领域，并且更具体地涉及利用单光源和至少两种染料诸如两种荧光标签进行DNA测序的系统和方法。
相关技术的描述
现有的DNA测序系统和方法利用两个或更多个光源来激发与荧光标签缀合的脱氧核糖核酸类似物。然而，在操作中，光源具有高功率消耗并且可以产生需要消散的大量热量。可以被一个光源有效激发的荧光标签可以经受串扰，从而每个标签以与其他标签重叠的波长发射光。当未校正时，这个串扰可能使DNA测序系统难以在测序运行期间正确识别正确的核苷酸碱基。
概述
本文公开了用于测定多核苷酸的核苷酸序列的系统和方法。在一个实例中，系统可以包括配置成生成光诸如预定波长处的光的单光源，诸如激光器或发光二极管；至少一个检测器，其配置成检测连接至核苷酸的荧光团的荧光发射，所述至少一个检测器配置成检测在第一波长和第二波长处的荧光发射；处理器，其配置成执行进行方法的指令，所述方法包括：从光源生成光至核苷酸上；当至少一个检测器没有检测到荧光发射时，鉴定核苷酸为第一类型；当至少一个检测器检测到光的第一波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第二类型；当至少一个检测器检测到光的第二波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第三类型；和当至少一个检测器检测到光的第一波长和第二波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第四类型。
另一个实例是计算机实施的方法，其包括使用光源生成光至连接至核苷酸的荧光团上；使用至少一个检测器检测连接至核苷酸的荧光团在第一波长和第二波长处的荧光发射；和鉴定核苷酸，其包括：当至少一个检测器没有检测到荧光发射时，鉴定核苷酸为第一类型；当至少一个检测器检测到光的第一波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第二类型；当至少一个检测器检测到光的第二波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第三类型；和当至少一个检测器检测到光的第一波长和第二波长处的荧光发射时，鉴定核苷酸为第四类型。
在另一实例中，系统包括：单光源，其配置成生成光；至少一个检测器，其配置成检测连接至核苷酸的不同荧光团的四种基本上不同的荧光发射；处理器，其配置成执行进行方法的指令，所述方法包括：从光源生成光至核苷酸上；当至少一个检测器检测到第一荧光发射时，鉴定核苷酸为第一类型；当至少一个检测器检测到第二荧光发射时，鉴定核苷酸为第二类型；当至少一个检测器检测到第三荧光发射时，鉴定核苷酸为第三类型；和当至少一个检测器检测到第四荧光发射时，鉴定核苷酸为第四类型，其中第一荧光发射、第二荧光发射、第三荧光发射和第四荧光发射具有基本上不同的波长。
附图简述
图1是示出示例单光源、双光通道测序仪的示意图。
图2示出了用于执行单光源、双光通道测序的示例计算机系统的功能框图。
图3是利用单光源、双光通道测序进行的边合成边测序的示例方法的流程图。
图4是用于对单光源、双光通道测序进行碱基识别的示例方法的流程图。
图5是用于进行单光源、双光通道测序的示例方法的流程图。
图6显示了核酸集群及其使用单光源、双光通道测序进行测序的概要。
图7A-D是示出对单光源、双光通道测序进行的颜色校正和相位校正的示意图。
详述
在以下详述中，参考了形成了其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有指示，否则类似的符号通常标识类似的组件。在详述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以使用其他实施方案，并且可以进行其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开的各方面可以在各种各样的不同构造中被布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都是本文明确考虑的。
本发明的实施方案涉及下一代核苷酸测序系统，其可以使用单光源和仅两个不同的光通道鉴定所有四种核苷酸碱基。测序系统可以利用边合成边测序过程。在每个测序循环期间，可以将四种类型的核苷酸类似物并入与待测序的多核苷酸杂交的生长引物上。在一些实施方案中，四种类型的核苷酸类似物可包括不与任何荧光染料缀合的脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)类似物、与第一荧光染料缀合的脱氧胸苷三磷酸(dTTP)类似物、与第二荧光染料缀合的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物和与两种荧光染料缀合的脱氧腺苷三磷酸(dATP)类似物(或两种dATP类似物的混合物，一种dATP类似物与第一荧光染料缀合和另一种dATP类似物与第二荧光染料缀合)。缀合至四种类型的核苷酸类似物的荧光染料仅是说明性的，并非旨在限制。例如，dTTP类似物可以不与任何荧光染料缀合，dCTP类似物可以与第一荧光染料缀合，dATP类似物可以与第二荧光染料缀合，并且dGTP类似物可以与两种荧光染料缀合(或两种dGTP类似物的混合物，一种dGTP类似物与第一荧光染料缀合和另一种dGTP类似物与第二荧光染料缀合)。作为另一个实例，dCTP类似物可以不与任何荧光染料缀合，dATP类似物可以与第一荧光染料缀合，dTTP类似物可以与第二荧光染料缀合，并且dGTP类似物可以与两种荧光染料缀合(或两种dGTP类似物的混合物，一种dGTP类似物与第一荧光染料缀合和另一种dGTP类似物与第二荧光染料缀合)。作为又一个实例，未与任何荧光染料缀合的核苷酸类似物可以是dGTP、dTTP、dCTP或dATP。与第一荧光染料或第二荧光染料缀合的核苷酸类似物可以是dGTP、dTTP、dCTP或dATP。与两种荧光染料缀合的核苷酸类似物可以是dGTP、dTTP、dCTP或dATP。dGTP、dTTP、dCTP或dATP类似物可包括两种类似物的混合物，一种类似物含第一荧光染料和另一种类似物含第二荧光染料。
光源(如，激光器或发光二极管)可以激发两种荧光染料。第一荧光染料在第一波长处发荧光，并且可以在第一荧光图像中捕获。第二荧光染料在第二波长处发荧光，并且可以在第二荧光图像中捕获。从两个荧光图像中提取捕获的荧光发射的强度。在一些实施方案中，两种荧光染料可以经受串扰，并且dTTP类似物和dCTP类似物的荧光发射可以在两个荧光图像中捕获。因此，提取的强度需要通过例如颜色校正来校正。在一些实施方案中，两种荧光染料可能具有大的斯托克斯位移，并且荧光发射可能具有最少串扰或没有串扰。
在一些实施方案中，两种荧光染料中的一种可以是正常的斯托克斯位移染料并且另一种荧光染料可以是长的斯托克斯位移染料。正常的斯托克斯位移染料的非限制性实例包括Alexa 488或其染料类似物(诸如美国专利第8,754,244号中公开的3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-5-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-3)和3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-4-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-4)，其内容整体并入本文)。正常的斯托克斯位移染料可以用波长为488nm的激光器或发光二极管(LED)光源激发，并且可以在520nm处具有发射峰。长的斯托克斯位移染料可以是PCT专利申请号PCT/GB2016/051474中的染料NR520LS，其内容整体并入本文)。长的斯托克斯位移染料可以在590nm处具有发射峰。在一些实施方案中，两种荧光染料可以是Cy3(在575nm附近具有发射峰)和荧光共振能量转移(FRET)对染料Cy3-Cy5(在670nm处具有发射峰)。
颜色校正可利用颜色矩阵来利用每个荧光图像内的基础的强度分布的性质来调节所提取的强度。颜色矩阵可以通过绘制从第一荧光图像中提取的强度相对于从第二荧光图像中相应位置提取的强度在位置(xi，yi)处来估计。xi和yi分别表示在第二荧光图像和第一荧光图像中从生长的引物-多核苷酸的位置i提取的强度。将位置(xi，yi)处的绘制强度转换为极坐标(ri，θi)，并计算角度θi的半径加权直方图。半径加权直方图中的两个局部最大值θ1和θ2可用于估计颜色矩阵。颜色矩阵可以是
在将颜色矩阵的倒数应用于位置(xi，yi)处的绘制强度之后，可以确定掺入的核苷酸的碱基。例如，如果没有检测到荧光发射，则掺入的核苷酸可以是dGTP类似物。如果在第二荧光图像而不是第一荧光图像中检测到荧光发射，则掺入的核苷酸可以是dTTP类似物。如果在第一荧光图像而不是第一荧光图像中检测到荧光发射，则掺入的核苷酸可以是dCTP类似物。如果在两个荧光图像中检测到荧光发射，则掺入的核苷酸可以是dATP类似物。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见，如Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY1989)。为了本公开的目的，下面将定义以下术语。
单光源、双光通道测序仪
本文公开了使用单光源(如，激光器或LED)测定多核苷酸的核苷酸序列的系统和方法。在一个实施方案中，存在至少两种用于对多核苷酸进行测序的染料。图1是示出示例单光源、双光通道测序系统100的示意性说明。单光源、双光通道测序系统100可以配置成利用基于两种染料(例如第一荧光标签和第二荧光标签)的测序方法。所利用的测序方法的非限制性实例可包括边合成边测序和Heliscope单分子测序。单光源、双光通道测序系统100可包括光学系统102，所述光学系统102配置成使用由作为单光源、双光通道测序系统100一部分的射流系统104供应的测序试剂来生成原始测序数据。原始测序数据可包括由光学系统102捕获的荧光图像。作为单光源、双光通道测序系统100一部分的计算机系统106可以配置成经由通信信道108A和108B来控制光学系统102和射流系统104。例如，光学系统102的计算机界面110可以配置成通过通信信道108A与计算机系统106通信。
在测序反应期间，射流系统104可以将试剂流引导通过一个或多个试剂管112，进出位于安装台116上的流动池114。试剂可以是例如荧光标记的核苷酸、缓冲液、酶和裂解试剂。流动池114可包括至少一个流体通道。流动池114可以是图案化阵列流动池或随机阵列流动池。流动池114可以包括待在至少一个流体通道中测序的多个单链多核苷酸集群。多核苷酸的长度可以在例如200个碱基至1000个碱基的范围内变化。多核苷酸可以连接至流动池114的一个或多个流体通道。在一些实施方案中，流动池114可以包括多个珠，其中每个珠可以包括多个拷贝的待测序的多核苷酸。安装台116可以配置成允许流动池114相对于光学系统102的其他部件适当地对齐和移动。在一个实施方案中，安装台116可用于将流动池114与透镜118对齐。
光学系统102可以包括配置成生成预定波长(例如532nm)的光的单光源120，诸如单个激光器或单个LED源。由光源120生成的光可以穿过光纤电缆122以在流动池114中激发荧光标签。安装在聚焦器124上的透镜118可以沿z轴移动。聚焦的荧光发射可以由检测器126，例如电荷耦合器件(CCD)传感器或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器来检测。
光学系统102的滤波器组件128可以配置成对流动池114中的荧光标签的荧光发射进行过滤。滤波器组件128可包括第一滤波器和第二滤波器。每个滤波器可以是长通滤波器、短通滤波器或带通滤波器，这取决于系统中使用的荧光分子的类型。第一滤波器可以配置成由检测器126检测第一荧光标签的荧光发射。第二滤波器可以配置成由检测器126检测第二荧光标签的荧光发射。利用滤波器组件128中的两个滤波器，检测器126可以检测两种不同波长的光。两种波长的光可以来自相同的荧光标签或不同的荧光标签。两种波长的光可以相隔例如至少20nm。
在一些实施方案中，光学系统102可以包括配置成分离荧光发射的二向色镜。光学系统102可包括两个检测器，与第一滤波器耦合的第一检测器用于检测第一波长处的荧光发射，和与第二滤波器耦合的第二检测器用于检测第二波长处的荧光发射。在用二向色镜分离荧光发射之后，光学系统102可以使用耦合有不同滤波器的两个检测器在两个波长处同时(或接近时间)检测荧光发射。这种构造可以加速成像过程。因此，可以同时处理多个流动池，其中一个流动池进行成像，同时将核苷酸类似物掺入一个或多个其他流动池的多核苷酸集群中。
在使用中，将具有待测序的多核苷酸的样品加载到流动池114中并放置在安装台116中。然后计算机系统106激活射流系统104以开始测序循环。在测序反应期间，计算机系统106通过通信界面108B指导射流系统104以向流动池114供应试剂诸如核苷酸类似物。通过通信界面108A和计算机界面110，计算机系统106配置成控制光学系统102的光源120以生成预定波长的光并照射到掺入杂交至待测序的多核苷酸的生长引物中的核苷酸类似物上。计算机系统106控制光学系统102的检测器126以捕获荧光图像中的核苷酸类似物的发射光谱。计算机系统106从检测器126接收荧光图像并处理接收的荧光图像以确定正在测序的多核苷酸的核苷酸序列。
光源和滤波器
单光源、双光通道测序系统100可以利用能够激发具有足够不重叠的发射光谱的两个荧光标签的一个光源，诸如激光器或LED。由光源120生成的光的波长可以在例如400nm到800nm范围内变化。在一些实施方案中，由光源120生成的光的波长可以是或大约是400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，由光源120生成的光的波长可以是至少或至多400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800nm。
检测器126以及滤波器组件128可以配置成检测为或约为两个不同波长的光，例如第一波长和第二波长。第一波长和第二波长可以彼此间隔，例如，范围为10nm至100nm。在一些实施方案中，第一波长和第二波长可以间隔或大约间隔10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，第一波长和第二波长可以间隔至少或至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100nm。
滤波器组件128中的滤波器的数量可以变化，范围从1到10。在一些实施方案中，滤波器组件128中的滤波器的数量可以是或大约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，滤波器组件128中的滤波器的数量可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
滤波器可以是带通滤波器，并且可以具有400nm至800nm范围内的不同波长的峰值透射率。在一些实施方案中，峰值透射率可以是或大约是400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，峰值透射率可以是至少或至多400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800nm。滤波器的宽度可以变化，例如，范围从1nm至50nm。在一些实施方案中，滤波器的宽度可以是或大约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，滤波器的宽度可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50nm。
荧光标签
由本文公开的系统和方法使用的荧光标签可以具有不同的峰值吸收波长，例如，范围为400nm至800nm。在一些实施方案中，荧光标签的峰值吸收波长可以是或大约是400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，荧光标签的峰值吸收波长可以是至少或至多400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800nm。
荧光标签可以具有不同的峰值发射波长，例如，范围为400nm至800nm。在一些实施方案中，荧光标签的峰值发射波长可以是或大约是400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，荧光标签的峰值发射波长可以是至少或至多400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800nm。
荧光标签可以具有不同的斯托克斯位移，例如，范围为10nm至200nm。在一些实施方案中，斯托克斯位移可以是或大约是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，斯托克斯位移可以是至少或至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm。
本文公开的系统和方法可以利用两种荧光标签，例如第一荧光标签和第二荧光标签，可以具有重叠的发射光谱并且可以经受串扰。在一些实施方案中，两种荧光标签的峰值发射波长可以变化，例如，范围为从10nm至200nm。在一些实施方案中，两种荧光标签的峰值发射波长可以是或大约是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，两种荧光标签的峰值发射波长可以是至少或至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm。具有滤波器组件128中的一个滤波器的检测器126可以检测第一荧光标签的荧光发射。具有滤波器组件128中的另一个滤波器的检测器126可以检测第二荧光标签的荧光发射。
在一些实施方案中，两种荧光染料中的一个可以是正常的斯托克斯位移染料，而另一种荧光染料可以是长的斯托克斯位移染料。正常的斯托克斯位移染料的非限制性实例包括Alexa 488或其染料类似物(诸如美国专利第8,754,244号中的3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-5-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-3)和3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-4-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-4))。正常的斯托克斯位移染料可以用激光器或LED光源以波长为488nm激发，并且可以在520nm处具有发射峰。长的斯托克斯位移染料可以是PCT专利申请号PCT/GB2016/051474中的染料NR520LS。长的斯托克斯位移染料可以在590nm处具有发射峰。在一些实施方案中，两种荧光染料可以是Cy3(在575nm附近具有发射峰)和荧光共振能量转移(FRET)对染料Cy3-Cy5(在670nm处具有发射峰)。
计算机系统
如上所讨论，单光源、双光通道测序系统100的计算机系统106可以配置成控制光学系统102和射流系统104。虽然计算机系统106可以有许多构造，但是图2中示出了一个实施方案。如图2所示，计算机系统106可包括处理器202，其与存储器204、存储206和通信界面208电通信。
处理器202可以配置成执行使得射流系统104在测序反应期间向流动池114供应试剂的指令。处理器202可以执行控制光学系统102的光源120以生成预定波长的光的指令。处理器202可以执行控制光学系统102的检测器126并从检测器126接收数据的指令。处理器202可以执行指令以处理从检测器126接收的数据例如荧光图像，并且基于从检测器126接收的数据确定多核苷酸的核苷酸序列。
存储器204可以配置成存储用于配置处理器202以在单光源、双光通道测序系统100通电时执行计算机系统106的功能的指令。当单光源、双光通道测序系统100断电时，存储206可以存储用于配置处理器202以执行计算机系统106的功能的指令。通信界面208可以配置成便于计算机系统106、光学系统102和射流系统104之间的通信。
计算机系统106可以包括用户界面210，其配置成与用于显示单光源、双光通道测序系统100的测序结果的显示设备(未示出)通信。用户界面210可以配置成接收来自单光源、双光通道测序系统100的用户的输入。计算机系统106的光学系统界面212和射流系统界面214可以配置成通过图1中所示的通信链路108A和108B来控制光学系统102和射流系统104。例如，光学系统界面212可以通过通信链路108A与光学系统102的计算机界面110通信。
计算机系统106可包括配置成使用从检测器126接收的数据以确定多核苷酸的核苷酸序列的核碱基测定仪216。核碱基测定仪216可包括以下中的一种或多种：模板生成仪218、位置登记仪220、强度提取仪222、强度校正仪224、碱基识别仪226和质量评分测定仪228。模板生成仪218可以配置成使用由检测器126捕获的荧光图像生成流动池114中的多核苷酸集群的位置的模板。位置登记仪220可以配置成基于由模板生成仪218生成的位置模板，在由检测器126捕获的荧光图像中登记流动池114中多核苷酸集群的位置。强度提取仪222可以配置成从荧光图像提取荧光发射的强度以生成经提取的强度。强度校正仪224可以配置成例如通过对提取的强度进行颜色校正以减少或消除荧光标签之间的串扰，从而生成经校正的强度。在一些实施方案中，强度校正仪224可以相位校正或预先准备正确的提取强度。在一些实施方案中，强度校正仪224可以相位校正或预相位校正(prephase correct)提取的强度。碱基识别仪226可以配置成从校正的强度确定多核苷酸的碱基。由碱基识别仪226确定的多核苷酸的碱基可以与由质量评分测定仪228确定的质量评分相关联。
边合成边测序
图3是利用测序系统100进行边合成边测序的示例方法300的流程图。在方法300开始于框305处之后，在框310处接收流动池114，其包括片段化的多核苷酸片段(如，片段化的单链或双链多核苷酸片段)。片段化的多核苷酸片段可以由脱氧核糖核酸(DNA)样品生成。DNA样品可以来自各种来源，例如，生物样品、细胞样品、环境样品或其任何组合。DNA样品可以包括来自患者的生物液体、组织和细胞中的一种或多种。例如，DNA样品可以取自或包括血液、尿液、脑脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活检样品或其任何组合。
DNA样品可包括来自目标细胞的DNA。目标细胞可以变化，并且在一些实施方案中，表达恶性表型。在一些实施方案中，目标细胞可包括肿瘤细胞、骨髓细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、病毒感染的细胞、致病性、寄生生物体细胞或其任何组合。
片段化的多核苷酸片段的长度可以在200个碱基至1000个碱基的范围内。一旦在框310处接收包括片段化的多核苷酸片段的流动池114，则过程300移动到框320，其中多核苷酸片段被桥式扩增成连接至流动池(例如流动池114)的一个或多个通道的内表面的多核苷酸片段集群。流动池的一个或多个通道的内表面可以包括两种类型的引物，例如第一引物类型(P1)和第二引物类型(P2)，并且DNA片段可以通过公知的方法扩增。
在流动池114内生成集群之后，过程300可以开始边合成边测序过程。边合成边测序过程可以包括测定单链多核苷酸片段集群的核苷酸序列。为了测定具有序列5’-P1-F-A2R-3’的单链多核苷酸片段集群的序列，可以在框325处用具有零个、一个或两个标签的核苷酸类似物通过DNA聚合酶加入和延伸具有与序列A2R互补的序列A2F的引物以形成生长的引物-多核苷酸。
在每个测序循环期间，可以将四种类型的核苷酸类似物加入并掺入生长的引物-多核苷酸上。四种类型的核苷酸类似物可以具有不同的修饰。例如，第一类型的核苷酸可以是未与任何荧光标签缀合的脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的类似物。第二类型的核苷酸可以是经由接头与第一类型的荧光标签缀合的脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的类似物。第三类型的核苷酸可以是经由接头与第二类型荧光标签缀合的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)的类似物。第四类型的核苷酸可以是经由一个或多个接头与第一类型的荧光标签和第二类型的荧光标签两者缀合的脱氧腺苷三磷酸(dATP)的类似物。接头可包含一个或多个切割基团。在随后的测序循环之前，可以从核苷酸类似物中去除荧光标签。例如，将荧光标签连接至核苷酸类似物的接头可以例如在相同的碳上包含叠氮基和/或烷氧基基团，使得接头可以在每次掺入循环后被磷化氢试剂切割，从而从后续的测序循环释放荧光标签。
可以在3’位置处可逆地阻断核苷酸三磷酸，从而控制测序，并且可以在每个循环中将不超过一个核苷酸类似物加入到每个延伸的引物-多核苷酸上。例如，核苷酸类似物的3’核糖位置可包含烷氧基和叠氮基官能团，其可通过用磷化氢试剂切割去除，从而产生可进一步延伸的核苷酸。在掺入核苷酸类似物后，射流系统104可以洗涤流动池114的一个或多个通道，以去除任何未掺入的核苷类似物和酶。在随后的测序循环之前，可以去除可逆的3’阻断物，使得可以将另一种核苷酸类似物加入到每个延伸的引物-多核苷酸上。
在框330处，单光源诸如激光器120或LED源可以在预定波长处激发两种荧光标签。在一些实施方案中，单个激光器或LED源可以是不可调的。在框335处，可以检测来自荧光标签的信号。检测荧光标签可以包括使用两个滤波器由例如检测器126在第一波长和第二波长处捕获在两个荧光图像中的荧光发射。第一荧光标签的荧光发射可以在第一波长处或周围，并且第二荧光标签的荧光发射可以在第二波长处或周围。可以存储荧光图像以供以后离线处理。在一些实施方案中，可以处理荧光图像以实时测定每个集群中生长的引物-多核苷酸的序列。
可以在决策框340处确定是否基于例如信号的质量或在预定数量的碱基之后检测更多核苷酸。如果要检测更多的核苷酸，则可以在框325处用添加以延伸引物-多核苷酸的具有零个、一个或两个标签的核苷酸类似物再次开始下一个测序循环的核苷酸测定。在下一个测序循环之前，可以从掺入的核苷酸类似物中去除荧光标签，并且可以去除可逆的3’阻断物，使得可以将另一种核苷酸类似物加入到每个延伸的引物-多核苷酸上。
在离线荧光成像处理中，如果在决策框340处没有要检测的另外核苷酸，则可以在框345处处理包括所检测的荧光信号的荧光图像，并且可以确定所掺入的核苷酸的碱基。对于确定的每个核苷酸碱基，可以在框350处确定质量评分。在处理完所有荧光图像之后，过程300可以在框355处终止。
碱基识别
碱基识别已描述于美国专利第8,965,076号中，其内容以其整体并入本文。简而言之，碱基识别可以指确定掺入被测序的生长的引物-多核苷酸集群中的核苷酸碱基为鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)的过程。图4是用于利用测序系统100进行碱基识别的示例方法400的流程图。在图3中所示的框345处处理检测到的信号可以包括进行方法400的碱基识别。在框405处开始之后，预定波长的光可以使用光源生成，并且可以在框410处照射到核苷酸类似物上。例如，计算机系统106通过其光学系统界面212和通信信道108A，可以使光源120生成预定波长的光。
光源-生成的光可以照射到掺入连接在流动池(例如流动池114)的一个或多个通道的内表面上的生长的引物-多核苷酸中的核苷酸类似物上。引物-多核苷酸可以包括杂交至测序引物的单链多核苷酸片段集群。核苷酸类似物各自可包含零个、一个或两个荧光标签。两个荧光标签可以是第一荧光标签和第二荧光标签。荧光标签在被光源-生成的光激发后，可以发出荧光发射。例如，第一荧光标签可以在第一波长处产生荧光发射，其可以在例如第一荧光图像中捕获。第二荧光标签可以在第二波长处产生荧光发射，其可以在例如第二荧光图像中捕获。
核苷酸类似物可包括第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸、第三类型的核苷酸和第四类型的核苷酸。第一类型的核苷酸，例如脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的类似物，不缀合至第一荧光标签或第二荧光标签。第二类型的核苷酸，例如脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的类似物，可以与第一类型的荧光标签而不是第二类型的荧光标签缀合。第三类型的核苷酸，例如脱氧胞苷三磷酸(dCTP)的类似物，可以与第二类荧光标签而不是第一类型的荧光标签缀合。第四类型的核苷酸，例如脱氧腺苷三磷酸(dATP)的类似物，可以与第一类型的荧光标签和第二类型的荧光标签两者缀合。
在框415处，可以使用至少一个检测器来检测第一波长和第二波长处的核苷酸类似物的荧光发射。例如，检测器126可以捕获两个荧光图像，即第一波长处的第一荧光图像和第二波长处的第二荧光图像。在从光学系统102接收到两个荧光图像之后，核碱基测定仪216可以确定两个荧光图像中荧光发射的存在或不存在。
因为第一类型的核苷酸不缀合至第一荧光标签或第二荧光标签，所以第一类型的核苷酸可以在第一波长或第二波长处不产生荧光发射或产生最少的荧光发射。在决策框420处，如果没有检测到荧光发射，则可以确定核苷酸是第一类型的核苷酸，例如dGTP。如果检测到任何荧光发射或多于最少的荧光发射，则方法400可以进行到决策框425。
因为第二类型的核苷酸与第一类型的荧光标签而不是第二类型的荧光标签缀合，所以第二类型的核苷酸可以在第一波长处产生荧光发射，并且在第二波长处不产生荧光发射或产生最少的荧光发射。在决策框425处，如果在第二荧光图像中没有检测到在第二波长处的荧光发射，并且根据决策框420，在第一荧光图像中检测到在第一波长处的荧光发射，则可以确定核苷酸为第二类型的核苷酸，例如dTTP。如果在第二波长处检测到荧光发射，则方法400可以进行到决策框430。
由于第三类型的核苷酸与第二类型的荧光标签而不是第一类型的荧光标签缀合，所以第三类型的核苷酸可以在第二波长处产生荧光发射，并且在第一波长处不产生荧光发射或产生最少的荧光发射。在决策框430处，如果在第一荧光图像中没有检测到在第一波长处的荧光发射，并且根据决策框425，在第二荧光图像中检测到在第二波长处的荧光发射，则可以确定核苷酸为第三类型的核苷酸，例如dCTP。
由于第四类型的核苷酸与第一类型的荧光标签和第二类型的荧光标签两者缀合，所以第四类型的核苷酸可以在第一波长或第二波长处产生荧光发射。在决策框430处，如果在第一荧光图像中检测到在第一波长处的荧光发射，并且根据决策框425，可在第二荧光图像中检测到在第二波长处的荧光发射，则可以确定核苷酸为第四类型的核苷酸，例如dATP。
流动池114可包括待测序的生长的引物-多核苷酸的集群。在决策框435处，如果针对给定的测序循环还存在待处理的至少一个具有荧光发射的集群，则方法400可以在框415处继续。如果不再处理单链多核苷酸集群，则方法400可以在框440处结束。
单光源、双光通道测序的工作流程
循环1：模板生成、位置登记和强度提取
图5是用于进行单光源、双光通道测序的示例方法500的流程图。单光源、双光通道测序系统100可以进行方法500。在框505处开始之后，在框510处，光源可以生成预定波长的光到核苷酸上。在框515处，可以使用例如至少一个检测器来检测来自第一荧光标签在第一波长处和来自第二荧光标签在第二波长处的荧光发射，以生成第一荧光图像和第二荧光图像。检测荧光发射可以包括确定荧光发射的强度。在接收到两个荧光图像之后，在框520处可以由例如模板生成仪218生成位置模板。
在第一测序循环期间生成位置模板可能是必要的，以确定单链多核苷酸集群的位置。图6显示了核酸集群及其使用单光源、双光通道测序进行测序的概要。在第一测序周期期间，集群的位置是未知的。流动池可包括四个集群，集群1-4。在第一测序循环期间，模板生成仪218可以确定流动池中的集群1、2和4的存在。
在第一测序循环期间，可以生成处于第一状态606(其对应于第一测序循环)的流动池的第一荧光图像602和第二荧光图像604。掺入生长的引物-多核苷酸集群中的核苷酸类似物可以变化。例如，掺入集群1中的核苷酸可以是与第一类型的荧光标签和第二类型的荧光标签两者缀合的脱氧腺苷三磷酸(dATP)的类似物。第一荧光图像602可以捕获dATP类似物上的第一类型的荧光标签的荧光发射。第二荧光图像604可以捕获dATP类似物上的第二类型的荧光标签的荧光发射。模板生成仪218可以从第一荧光图像602或第二荧光图像604确定在特定集群1位置处集群1的存在。
掺入集群2中的核苷酸可以是与第二类型的荧光标签、而不是第一类型的荧光标签缀合的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)的类似物。第二荧光图像可以捕获dCTP类似物上的第二类型的荧光标签的荧光发射。如果第一荧光标签和第二荧光标签经受串扰，则集群2可以在第一荧光图像上具有一些荧光发射。模板生成仪218可以从第二荧光图像604确定在特定集群2位置处的集群2的存在。
掺入集群3中的核苷酸可以是未与第一荧光标签或第二荧光标签缀合的脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的类似物。因此，第一荧光图像602和第二荧光图像604没有来自集群3的荧光发射或具有最少的来自集群3的荧光发射。模板生成仪218可能无法从第一荧光图像602和第二荧光图像604确定在特定集群3位置处的集群3的存在。
掺入集群4中的核苷酸可以是与第一类型的荧光标签、而不是第二类型的荧光标签缀合的脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的类似物。第一荧光图像602可以捕获dTTP类似物上的第一类型的荧光标签的荧光发射。如果第一荧光标签和第二荧光标签经受串扰，则集群4可以在第二荧光图像604上具有一些荧光发射。模板生成仪218可以从第一荧光图像确定在特定集群4位置处的集群4的存在。
模板生成仪218可以基于第一测序循环中的第一荧光图像602和第二荧光图像604生成集群1、2和4的位置模板。在一些实施方案中，生成位置模板可以包括检测第一荧光标签和第二荧光标签之间的串扰。串扰可以有利地使图像登记更加稳健，尤其是在低多样性背景下，因为荧光标签的发射可以在第一荧光图像602和第二荧光图像604两者中捕获。
循环2：模板生成和位置登记
当使用随机流动池时，在第二测序循环期间可能必需生成位置模板，以确定单链多核苷酸集群的位置。在第一测序循环之后，集群3的位置可能是未知的。在第二测序循环期间掺入集群3中的核苷酸可以是与第一类型的荧光标签而不是第二类型的荧光标签缀合的脱氧胞苷三磷酸(dTTP)的类似物。第一荧光图像612可以捕获dTTP类似物上的第一类型的荧光标签的荧光发射。在第二测序循环期间，模板生成仪218可以从第一荧光图像612确定在特定集群3位置处的集群3的存在。使用图案化的流动池时的模板生成已在美国专利申请第14/530,299号中描述，其内容整体并入本文。
位置登记和强度提取
参考图5，在框525处，位置模板中的集群位置可以被登记至针对第一测序循环和随后的测序循环捕获的荧光图像。可以在框530处提取在登记位置(例如位置1、2和4)处的生长的引物-多核苷酸集群的荧光强度。可以在535处校正经提取的强度以生成经校正的强度。由例如强度校正仪224校正经提取的强度可以包括框540处的空间归一化、框545处的颜色校正或框550处的相位校正中的一个或多个。
空间归一化、颜色校正和相位校正
空间归一化可以包括归一化在测序循环的不同荧光图像中的荧光发射的强度以生成空间归一化的强度。例如，在每个测序循环，可以将第一荧光图像和第二荧光图像的5％和95％的强度归一化至零和一。如果测序循环在索引读段内，那么来自非索引读段的最后一个循环的第95个百分位数可用于归一化。空间归一化可以减少循环依赖性强度变化。
图7A-D是示出单光源、双光通道测序的颜色校正和相位校正的示意图。图7A是当第一荧光标签和第二荧光标签之间没有串扰时，在位置(xi，yi)处来自第一荧光图像的经提取的强度或空间归一化的强度相对于来自第二荧光图像中的相应位置的经提取的强度的散点图。xi表示第二荧光图像中生长的引物-多核苷酸的集群i的空间归一化的强度。yi表示第一荧光图像中生长的引物-多核苷酸的集群i的空间归一化的强度。因为dGTP类似物既不包含第一荧光标签也不包含第二荧光标签，因此其在第一荧光图像或第二荧光图像中没有荧光发射。因此，dGTP类似物的群体位于散点图的位置(0,0)处。因为dTTP类似物包含第一荧光标签，所以它在第一荧光图像而不是第二荧光图像中具有荧光发射。因此，dTTP类似物的群体位于散点图的位置(0,1)处。因为dCTP类似物包含第二荧光标签，所以它在第二荧光图像而不是第一荧光图像中具有荧光发射。因此，dCTP类似物的群体位于散点图的位置(1,0)处。因为dATP类似物包含第一荧光标签和第二荧光标签，所以它在第一荧光图像和第二荧光图像中具有荧光发射。dATP类似物的群体位于散点图的位置(1,1)处，因为第一荧光标签和第二荧光标签之间没有串扰。
图7B示出了当两个荧光标签具有重叠的发射光谱并且经受串扰时的散点图的示意性说明。由于第一荧光标签和第二荧光标签经受串扰，因此dTTP类似物在第一荧光图像中具有更强的发射，并且在第二荧光图像中具有更弱的发射。因此，对应于来自dTTP类似物群体的荧光发射的云位于(0,1)周围的位置处，例如(0.2,0.8)。dCTP类似物在第二荧光图像中具有更强的发射，并且在第一荧光图像中具有更弱的发射。因此，对应于来自dCTP类似物群体的荧光发射的云位于(1,0)周围的位置处，例如(0.8,0.2)。对应于来自dATP类似物群体的荧光发射的云位于(1,1)周围的位置处，例如(0.9,0.9)。
为了减少或消除第一荧光标签和第二荧光标签之间的串扰，可以在545处对提取的强度或空间归一化的强度进行颜色校正。颜色校正可以利用颜色矩阵，利用每个荧光图像内基础的强度分布的性质来调节所提取的强度。
双通道颜色矩阵可以是2x2矩阵，其用于校正两个通道捕获之间的串扰，例如第一通道和第二通道。第一通道可以在测序循环时捕获第一荧光图像和第二荧光图像。例如，当集群在对应于第一荧光图像的第一通道中亮起时，一些发射也被收集在对应于第二荧光图像的第二通道中。颜色校正可以包括使用双通道颜色矩阵来生成矩阵校正的强度，其可以减少或消除串扰。颜色矩阵还可以平衡颜色通道之间的总强度的任何差异。颜色矩阵，M
具有串扰系数Mj,k，其表示在捕获荧光标签k的荧光发射的通道j中观察到的强度的量。例如，M1,1表示在捕获第一荧光标签(即荧光标签1)的荧光发射的第一荧光图像(即通道1)中观察到的强度的量。例如，M1,2表示在捕获第二荧光标签(即荧光标签2)的荧光发射的第一荧光图像(即通道1)中观察到的强度的量，因为第一荧光标签和第二荧光标签之间的重叠发射光谱。
可以基于在可配置的一组早期测序循环(例如测序循环1-10)期间收集的集群强度来估计颜色矩阵。该颜色矩阵可以用于剩余的测序循环，其中相对强度的归一化是循环依赖性的。
颜色矩阵可用于估计通道对之间的串扰，因为它们具有重叠的发射光谱。在一些实施方案中，估计颜色矩阵可以包括将位置(ai，通道2，ai，通道1)处的绘制强度转换成极坐标，其中i表示集群编号，ai，通道1表示第一通道中的第i个集群的强度，并且ai，通道2表示第二通道中第i个集群的强度。估计颜色矩阵可以包括根据位置(ai，通道2，ai，通道1)处的绘制强度计算范围[0,90]中的角度θi的半径加权直方图。对于在第二荧光图像中具有ai，通道2的强度和在第一荧光图像中具有ai，通道1的强度的集群i，幅度ri可以基于强度ai，通道1和ai，通道2，例如(ai，通道1 2+ai，通道2 2)1/2。角度θi可以是tan-1(ai，通道1/ai，通道2)。图7C示出了当两个荧光标签具有重叠的发射光谱并且经受串扰时半径加权直方图的示意性说明。图7B中的位置(ai，通道1，ai，通道2)处的强度可以被转换成图7C中的半径加权角度直方图。对于单光源、双通道测序，半径加权角度直方图包括三个峰，分别对应于图7B中的dTTP类似物、dATP类似物和dCTP类似物的云。对应于dATP类似物的云的中心峰值是大约45°的角度。
估计颜色矩阵可以包括在半径加权直方图中鉴定两个外局部最大值θ1和θ2。对于没有串扰的通道，θ1为0°，并且θ2为90°。矩阵中的串扰系数M1,2可以是例如tan(θ1)。矩阵中的串扰系数M2,1可以是例如tan(90-θ2)。在一些实施方案中，如果可以用四种核苷酸中的一种识别不足数量的集群，则颜色矩阵估计可能不是理想的，并且可以使用单位矩阵(identity matrix)替代。矩阵的对角元素可以是1，并且颜色矩阵可以是
可以将颜色矩阵归一化为具有1的行列式。在一些实施方案中，较早的测序循环的颜色矩阵可以用于随后的测序循环。可以通过将图7B中的绘制强度乘以颜色矩阵的倒数以生成颜色校正的强度来计算经校正的强度。图7D示出了在颜色校正之后图7B中的强度的散点图的示意性说明。通过经校正的强度，可以更好地分离对应于dGTP、dTTP、dCTP和dATP的单个集群。在一些实施方案中，可以将荧光图像划分为区块，并且可以为每个区块估计颜色矩阵。在一些实施方案中，可以使用多个测序循环的强度来估计颜色矩阵。图7B和7D中荧光发射的云的大小和形状仅用于说明。例如，对应于在图7D中的颜色校正之后的dATP类似物的群体的云可以大于对应于在图7B中的颜色校正之前的dATP类似物的群体的云。
参考图5，可以在框550处对经颜色校正的强度进行相位校正。在边合成边测序期间，引物-多核苷酸集群中的每个引物或延伸引物可以每个循环延伸一个碱基。一小部分的链可能与当前的测序循环异相，落后一个碱基(定相)或者向前运行一个碱基(预定相)。对于测序的每个循环，可以计算相位校正以最大化数据质量，例如，通过确定定相矩阵并将定相矩阵应用于提取的强度。
碱基识别
在框555处，掺入生长的引物-核苷酸的集群中的核苷酸的碱基可以由例如碱基识别仪226确定。可以为识别的每个碱基确定质量评分。参考图6，在第一测序循环，因为集群1在第一荧光图像和第二荧光图像中都具有荧光发射，所以掺入的核苷酸是dATP类似物。因为集群2仅在第二荧光图像中具有荧光发射，所以掺入的核苷酸是dCTP类似物。因为集群4仅在第一荧光图像中具有荧光发射，所以掺入的核苷酸是dTTP类似物。
在第二测序循环中，掺入集群1-4中的核苷酸可以分别是dGTP、dCTP、dTTP和dATP。在确定集群3的存在之后，在第一测序循环期间掺入集群3中的核苷酸可以是在第一荧光图像或第二荧光图像中没有荧光发射的dGTP。在第三测序循环之后，可以确定集群1-4分别具有AGT、CCA、GTA和标签的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在框555处的碱基识别可以基于来自框535的经校正的强度。核苷酸与图7D中的散点图上的群体之间的对应关系可以定义如下：如果群体在第一通道中关闭并且在第二通道中关闭，则掺入的核苷酸是dGTP类似物；如果群体在第二通道中关闭并且在第一通道中开启，则掺入的核苷酸是dTTP类似物；如果群体在第二通道中开启并且在第一通道中关闭，则掺入的核苷酸是dCTP类似物；和如果群体在第一通道和第二通道中开启，则掺入的核苷酸的碱基识别是dATP类似物。
碱基识别可以包括将经校正的强度通过第5个和第95个百分位数归一化至(0,1)。可以经由期望最大化算法将四个高斯分布(dGTP、dTTP、dCTP和dATP各一个)拟合到经校正和归一化的强度的数据。期望最大化算法可以确定哪种均值和分布与数据最拟合。在计算高斯分布后，对于每个群体，可以计算属于每个高斯的群体的可能性。碱基识别可以基于属于特定高斯的群体的最大可能性。对于低多样性样品，期望最大化算法可用于鉴定协方差矩阵以避免过度拟合数据。为了精确起见，可以增加子抽样目标以抽样更多的数据。
在一些实施方案中，群体可以通过贞洁度量(chastity metric)进行过滤。贞洁度量可以是例如D1/(D1+D2)。D1可以是到最近的高斯平均值的距离，并且D2可以是到下一个最近距离的距离。距离可以使用例如马哈拉诺比斯方法来测量，该方法可以考虑沿着由每个高斯中心和所考虑的点确定的线的分布宽度。
在框560处，在方法在框565处结束之前，可以确定一个或多个质量度量。测序质量度量可以提供关于在这个过程中的每个步骤的精确度的重要信息，包括文库制备、碱基识别、读段比对和变体识别。通过Phred质量评分(Q评分)测量的碱基识别精确度可用于评估测序平台的精确度。它可以指示测序仪错误地识别给定碱基的概率。Q评分可以是–10log10P，其中P是碱基识别错误概率。
集群缩放
在一些实施方案中，校正强度可包括集群缩放。集群可以具有不同的亮度。例如，一些集群可以是明亮的，而一些集群可以是暗淡的。集群亮度可以由样品的片段长度分布引起。集群群体的变化亮度可以具有延长碱基识别散点图中‘开启’群体的效果。通过在前10个循环中的平均强度来归一化每个集群的强度以减少群体强度变化可能是有利的。例如，在前10个循环中，对于每个非鸟嘌呤(G)碱基识别，可以计算两个半径：群体强度与原点的距离，以及相应的高斯平均值与原点的距离。集群缩放可以包括归一化至这两个半径的比率在例如前10个循环期间平均的平均值。在进行相位校正和碱基识别之前，可以通过该缩放因子对所有集群强度进行归一化。群集缩放可以有利地增加通量并降低错误率，例如，对于具有大片段长度分布的样品。
单光源、多光通道测序仪
本文公开了用于测定多核苷酸的核苷酸序列的系统或方法的实施方案。在一个实施方案中，系统包括单光源或者与单光源通信，所述单光源诸如激光器或LED光源，其配置成生成光，诸如预定波长的光。系统可以包括至少一个检测器，或者与至少一个检测器通信，所述检测器配置成检测连接至核苷酸的不同荧光团的四种基本上不同的荧光发射。系统可以使光源生成光在核苷酸上。当至少一个检测器检测到第一荧光发射时，核苷酸可以被鉴定为第一类型。当至少一个检测器检测到第二荧光发射时，核苷酸可以被鉴定为第二类型。当至少一个检测器检测到第三荧光发射时，核苷酸可以被鉴定为第三类型。当至少一个检测器检测到第四荧光发射时，核苷酸可以被鉴定为第四类型。第一荧光发射、第二荧光发射、第三荧光发射和第四荧光发射中的至少两种可以具有基本上不同的波长。
不同类型的核苷酸可以连接至不同的荧光团或不连接荧光团。例如，第一类型的核苷酸可以不连接单光源可激发的荧光团，并且第一荧光发射包括不发射。在另一个实例中，第一类型的核苷酸可以连接至两种不同的荧光团，并且第一荧光发射包括来自两种不同荧光团的发射。
在又一个实例中，第一荧光发射来自连接至第一类型的第一核苷酸的第一荧光团，第二荧光发射来自连接至第二类型的第二核苷酸的第二荧光团，第三荧光发射来自连接至第三类型的第三核苷酸的第三荧光团，并且第四荧光发射来自连接至第四类型的第四核苷酸的第四荧光团。可以使用光源激发四种荧光团。在一个实施方式中，第一荧光团、第二荧光团、第三荧光团和第四荧光团中的所有四种都是不同的。例如，核苷酸序列可以基于四个不同波长的四种染料的发射来测定。在另一个实施方式中，第一荧光团、第二荧光团、第三荧光团和第四荧光团中的三种是不同的。例如，核苷酸序列可以基于三个不同波长的三种染料的发射来测定。在另一个实施方式中，第一荧光团、第二荧光团、第三荧光团和第四荧光团中的两种是相同的。例如，核苷酸序列可以基于两个不同波长的两种染料的发射来测定。
测序方法
本文所述的方法可以与各种核酸测序技术结合使用。特别适用的技术是其中核酸连接至阵列中的固定位置处使得它们的相对位置不会改变并且其中阵列被重复成像的那些技术。这样的实施方案是特别适用的：其中图像是在例如与用于区分一种核苷酸碱基类型与另一种的不同标签重合的不同的颜色通道中获得的。在一些实施方案中，测定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。优选的实施方案包括边合成边测序(“SBS”)技术。
“边合成边测序(“SBS”)技术”通常涉及通过针对模板链迭代加入核苷酸而进行的新生核酸链的酶促延伸。在SBS的传统方法中，可以在每次递送中存在聚合酶的情况下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。然而，在本文所述的方法中，可以在递送中存在聚合酶的情况下将多于一种类型的核苷酸单体提供给靶核酸。
术语
在至少一些先前描述的实施方案中，实施方案中使用的一个或多个要素可以互换地用于另一实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员视上下文和/或应用可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，本文中可明确阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员通常将理解，本文并且尤其是所附权利要求(如所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图引入特定数量的权利要求陈述，则在权利要求中将明确地陈述这样的意图，并且在没有这样的陈述的情况下，不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下附加的权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”，以引入权利要求陈述。然而，这样的短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一”或“一个”引入的权利要求陈述将任何含有此类引入的权利要求陈述的具体权利要求限制为仅含有一个这样的叙述的实施方案，即使相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词诸如“一”或“一个”(如，“一”和/或“一个”应意指“至少一个”或“一个或多个”)；对于使用用于引入权利要求陈述的定冠词也是如此。此外，即使明确地陈述了特定数量的引入的权利要求陈述，本领域技术人员将认识到这样的陈述应该被解释为表示至少所述的数目(如，简单陈述“两个陈述”而没有其他修饰语，意指至少两个陈述，或两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这样的构造意图在本领域技术人员理解该惯例的意义上(如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这样的构造意图在本领域技术人员理解该惯例的意义上(如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，无论在说明书、权利要求书或附图中，实际上任何呈现两个或更多替代术语的分隔性词语和/或短语应被理解为考虑包括术语之一、任一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，如果按照马库什组描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到本公开还因此按照马库什组的任何个别成员或成员亚组进行了描述。
如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，诸如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被认为充分描述并且使得这样的相同的范围成为可能：该相同的范围被分成至少相同的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括陈述的数目并且是指可以随后被分成如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，以此类推。
虽然本文已经公开了各个方面和实施方案，但是其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的而并非意图限制性的，真正的范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (42)

1.用于测定多核苷酸的核苷酸序列的系统，其包括：
单光源，其配置成刺激荧光的发射；
至少一个检测器，其配置成检测连接至核苷酸的荧光团的荧光发射，所述至少一个检测器配置成检测在第一波长和第二波长处的荧光发射；
处理器，其配置成执行进行方法的指令，所述方法包括：
从所述光源生成光至核苷酸上；
当所述至少一个检测器没有检测到荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第一类型；
当所述至少一个检测器检测到光在第一波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第二类型；
当所述至少一个检测器检测到光在第二波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第三类型；和
当所述至少一个检测器检测到光在第一波长和第二波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第四类型。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述处理器还配置成确定所述荧光发射中的一种或多种的强度。
3.如权利要求2所述的系统，其中所述处理器还配置成通过颜色校正所述强度来确定所述荧光发射中的一种或多种的强度。
4.如权利要求3所述的系统，其中颜色校正所述强度包括估计颜色矩阵。
5.如权利要求4所述的系统，其中估计所述颜色矩阵包括：
从在两个通道中观察到的强度的散点图生成半径加权的角度直方图；和
估计半径加权的角度直方图中的两个外局部最大值θ1和θ2的角度
其中所述颜色矩阵是
6.如权利要求1所述的系统，其中所述系统包括用于具有至少一个流体通道的流动池的安装台。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述光源是激光器，并且其中由所述激光器生成的光的预定波长为400nm至800nm。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述光源是发光二极管，并且其中由所述发光二极管生成的光的预定波长为400nm至800nm。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述至少一个检测器配置成检测来自相同荧光标签的光的至少两种波长。
10.如权利要求1所述的系统，其中所述第一波长和所述第二波长彼此间隔至少10nm。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述第一波长和所述第二波长彼此间隔至多100nm。
12.如权利要求1所述的系统，其中所述处理器还配置成鉴定所述荧光发射中的所述第一波长和所述第二波长之间的串扰。
13.用于测定多核苷酸的核苷酸序列的计算机实施的方法，其包括：
使用光源生成荧光发射至连接至核苷酸的荧光团上；
使用至少一个检测器检测连接至所述核苷酸的荧光团在第一波长和第二波长处的荧光光发射；和
鉴定所述核苷酸，其包括：
当所述至少一个检测器没有检测到荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第一类型；
当所述至少一个检测器检测到光在第一波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第二类型；
当所述至少一个检测器检测到光在第二波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第三类型；和
当所述至少一个检测器检测到光在第一波长和第二波长处的荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第四类型。
14.如权利要求13所述的方法，其中检测荧光发射包括颜色校正荧光发射。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述光源是激光器，并且其中由所述激光器生成的光的预定波长为450nm至490nm。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述光源是发光二极管，并且其中由所述发光二极管生成的光的预定波长为450nm至490nm。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述第一波长和所述第二波长彼此间隔至少20nm。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述第一波长和所述第二波长彼此间隔至多200nm。
19.如权利要求13所述的方法，其中检测荧光发射包括接收第一荧光图像和第二荧光图像，并且其中所述第一荧光图像由第一荧光标签生成，并且其中所述第二荧光图像由第二荧光标签生成。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一荧光标签包括Alexa488、3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-5-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-3)或3,6-双(乙基氨基)-2,7-二甲基-[2-羧根基-4-(3-羧丙基氧基)苯基]呫吨鎓甜菜碱(染料I-4)，并且其中所述第二荧光标签包括染料NR520LS。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述第一荧光标签包括Cy3染料，并且其中所述第二荧光标签包括Cy3-Cy5染料对。
22.如权利要求19所述的方法，其还包括：
从所述荧光图像提取强度以生成经提取的强度；和
校正经提取的强度以生成校正的强度，其中校正经提取的强度包括颜色校正经提取的强度，并且其中鉴定所述核苷酸包括基于校正的强度鉴定所述核苷酸。
23.如权利要求22所述的方法，其还包括在从所述荧光图像提取强度之前：
生成位置模板；和
将所述位置模板中的位置登记至所述荧光图像。
24.如权利要求23所述的方法，其中校正经提取的强度还包括：
在空间上归一化所述经提取的强度；和
相位校正所述经提取的强度。
25.如权利要求24所述的方法，其中相位校正经提取的强度包括：
确定定相矩阵；和
应用所述定相矩阵至所述经提取的强度。
26.如权利要求23所述的方法，其中生成位置模板包括检测所述荧光图像中的所述第一荧光标签和所述第二荧光标签之间的串扰。
27.如权利要求19所述的方法，其中所述第一荧光标签和所述第二荧光标签经受串扰。
28.如权利要求19所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸不缀合至所述第一荧光标签或所述第二荧光标签，所述第二类型的核苷酸缀合至所述第一荧光标签，所述第三类型的核苷酸缀合至所述第二荧光标签，并且所述第四类型的核苷酸不缀合至所述第一荧光标签和所述第二荧光标签。
29.如权利要求13所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸是dGTP的类似物，所述第二类型的核苷酸是dTTP的类似物，所述第三类型的核苷酸是dCTP的类似物，和所述第四类型的核苷酸三磷酸是dATP的类似物。
30.用于测定多核苷酸的核苷酸序列的系统，其包括：
单光源，其配置成刺激荧光的生成；
至少一个检测器，其配置成检测连接至核苷酸的不同荧光团的四种基本上不同的荧光发射；
处理器，其配置成执行进行方法的指令，所述方法包括：
从所述光源生成光至核苷酸上；
当所述至少一个检测器检测到第一荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第一类型；
当所述至少一个检测器检测到第二荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第二类型；
当所述至少一个检测器检测到第三荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第三类型；和
当所述至少一个检测器检测到第四荧光发射时，鉴定所述核苷酸为第四类型。
31.如权利要求30所述的系统，其中所述第一荧光发射、所述第二荧光发射、所述第三荧光发射和所述第四荧光发射具有基本上不同的波长。
32.如权利要求30所述的系统，其中所述处理器还配置成确定所述荧光发射中的一种或多种的强度。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述处理器还配置成通过颜色校正所述强度来确定所述荧光发射中的一种或多种的强度。
34.如权利要求33所述的系统，其中颜色校正所述强度包括估计颜色矩阵。
35.如权利要求30所述的系统，其中所述光源是激光器，并且其中由所述激光器生成的光的预定波长为400nm至800nm。
36.如权利要求30所述的系统，其中所述光源是发光二极管，并且其中由所述发光二极管生成的光的预定波长为400nm至800nm。
37.如权利要求30所述的系统，其中所述第一类型的核苷酸不连接所述单光源可激发的荧光团，并且其中所述第一荧光发射包括不发射。
38.如权利要求30所述的系统，其中所述第一类型的核苷酸连接至两种不同的荧光团，并且其中所述第一荧光发射包括来自所述两种不同的荧光团的发射。
39.如权利要求30所述的系统，其中所述第一荧光发射来自连接至所述第一类型的第一核苷酸的第一荧光团，其中所述第二荧光发射来自连接至所述第二类型的第二核苷酸的第二荧光团，其中所述第三荧光发射来自连接至所述第三类型的第三核苷酸的第三荧光团，并且其中所述第四荧光发射来自连接至所述第四类型的第四核苷酸的第四荧光团。
40.如权利要求39所述的系统，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团、所述第三荧光团和所述第四荧光团中的所有四种均是不同的。
41.如权利要求39所述的系统，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团、所述第三荧光团和所述第四荧光团中的三种是不同的。
42.如权利要求39所述的系统，其中所述第一荧光团、所述第二荧光团、所述第三荧光团和所述第四荧光团中的两种是相同的。
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